全 文 ：·综述与专论· 2015, 31(9):49-59
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
腺相关病毒（Adeno-associated virus，AAV）是
一种无包被，直径约 22 nm 的单链 DNA 病毒。它是
一种非致病病毒，目前尚未发现与 AAV 相关的人类
或其他哺乳类疾病。与其他基因治疗载体相比，重
组型腺相关病毒（Recombinant adeno-associated virus，
rAAV）载体具有安全性好、免疫原性低、物理性
质稳定、感染细胞谱广等优点，可在体内外有效介
导外源基因长期稳定表达，被视为最有前途的基
因治疗载体之一。目前，rAAV 已经被用于血友病、
先天性黑矇、囊性纤维变性等多项基因治疗的临床
研究中［1-3］。此外，全球第一个基因治疗药物——
Glybera 已经于 2012 年底批准上市，主要用于治疗
脂蛋白脂酶缺乏遗传病，而它的载体正是 AAV1。
然而 rAAV 转导效率相对较低，必须使用大量
的病毒才能达到有效的治疗效果，从而导致其治疗
费用相对较高［4］。此外，过高剂量 rAAV 的衣壳蛋
白会激发宿主的免疫排斥反应，限制基因治疗载体
的转导效率［5，6］。因此，如何提高 rAAV 转导效率
收稿日期 ： 2014-11-04
基金项目 ：国家自然科学基金项目（81303112）
作者简介 ：殷子斐，女，博士研究生，研究方向 ：中医药与基因治疗的联合应用 ；E-mail ：yinzifei870730smmu@163.com
通讯作者 ：凌晨，男，博士，助理教授，研究方向 ：以腺相关病毒为载体的基因治疗 ；E-mail ：lingchen@peds.ufl.edu
提高重组型腺相关病毒转导效率的研究现状
殷子斐1  王丽娜1  王园1  凌晨2
（1. 中国人民解放军第二军医大学，上海 200433 ；2. 佛罗里达大学，美国佛罗里达州 32610）
摘 要 ： 重组型腺相关病毒（recombinant adeno-associated virus，rAAV）载体是目前基因治疗研究中常用的、非常有前景的
载体之一。欧洲第一个批准上市的基因治疗药物正是基于 rAAV。然而，rAAV 的转导效率相对有限，导致其治疗成本过高 ；且过
高剂量的 rAAV 可以激发人体的免疫反应，降低其疗效。因此，如何提高 rAAV 的转导效率一直是基因治疗领域研究的热点之一。
目前常用的提高 rAAV 转导效率的方法有 ：使用组织特异性强的血清型 / 变体、应用蛋白酶体抑制剂、突变衣壳蛋白表面裸露氨基
酸、增加单链 DNA 的第二链合成、构建自身互补型双链载体等。就这些方法各自的原理、应用现状及优劣势进行系统地综述。
关键词 ： 重组腺相关病毒载体 ；基因治疗 ；转导效率
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.09.007
Research Advances on Increasing the Transduction Efficiency of
Recombinant Adeno-associated Viral Vectors
Yin Zifei1 Wang Li’na1 Wang Yuan1 Ling Chen2
（1. Second Military Medical University，People’s Liberation Army，Shanghai 200433 ；2. University of Florida，Florida 32610）
Abstract: The recombinant adeno-associated virus（rAAV）vector has emerged as one of the promising and commonly-used vectors
in gene therapy research. The first gene therapy drug in clinic approved in Europe is based on rAAV. Due to the relatively limited transduction
efficiency, the cost of the rAAV-mediated treatment is expensive. Additionally, high dose of rAAV may trigger host immune response, resulting
in the curative effect reduced. Therefore, how to enhance the transduction efficiency of rAAV has been a hot issue in gene therapy. Hitherto there
are five common methods to achieve this goal ：selecting tissue-specific tropism serotypes and variants, using proteasome inhibitors, mutating
capsid surface-exposed amino-acids, increasing second-strand DNA synthesis, and producing self-complementary vectors. In this paper we
systemically review the above methods from the aspects of principle, status of application, advantages and disadvantages.
Key words: recombinant adeno-associated virus vector ；gene therapy ；transduction efficiency
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.950
成了近年来基因治疗领域的研究热点之一。由于目
前已有学者针对如何通过调控免疫反应，增加 rAAV
的转导效率进行了系统的综述［5-9］，故笔者现主要
针对 rAAV 从进入细胞到在细胞中实现转基因表达
的各个环节，探讨能够有效提高 rAAV 转导效率的
方法，并对这些方法的原理及优劣势进行分析。
1 AAV 基本生物学特征
成熟的 AAV 衣壳是由 VP1、VP2 和 VP3 三种
衣壳蛋白装配而成，其分子量大小分别为 87、73、
62 kD，三者的分子数目比例约为 1∶1∶10。野生型
（wide-type，wt）AAV 的基因组为单链（Single-stran-
ded，ss）、约 4 800 个碱基的线形 DNA，其两末端
为 145 个碱基组成的倒置末端重复序列（Inverted
terminal repeat，ITR）。 在 ITR 序 列 之 间 为 病 毒 蛋
白编码区，包含两个开放阅读框架，产生复制蛋
白质（Rep）、衣壳蛋白质（Cap）和包装激活蛋白
质（Assembly-activating protein，AAP）。基因治疗载
体 rAAV 仅仅保留了 AAV 基因组末端的 ITR，而将
Rep、Cap 及 AAP 的基因以目的基因盒替代（图 1）。
在 ITR 结构中，有 3 段回文结构和一段非回文结构，
3 段回文结构形成发夹状，非回文结构为 D 序列，
其 中 含 有 末 端 断 裂 位 点（Terminal resolution site，
trs）。在 AAV 的复制过程中，其以自身 3-OH 为引物，
产生 2 个等长的具有一个共价连接末端的复制中间
体（子／母链）（图 1）。之后，Rep 蛋白发挥核酸内
切酶的作用，在母链 trs 处产生一个缺口。新产生的
3-OH 作为 DNA 聚合酶底物，合成新的 ITR。经过
新一轮复制，可形成一个新的单链 AAV 病毒基因及
一个子／母链共存二聚体［1，2，10］。
在 AAV 感染细胞的过程中，病毒颗粒不停地
撞击靶细胞，直至衣壳蛋白与细胞表面相应的受
体、共受体结合，借助于细胞内吞作用形成内含体
进入细胞，随后因内含体酸化后从内含体中逸出，
并向细胞核内运输，运输过程中，其衣壳蛋白表面
会被磷酸化、泛素化，从而被蛋白酶体降解。未被
降解而进入细胞核内的病毒颗粒逐渐脱壳，释放
出 其 中 的 ssDNA。ssDNA 不 能 作 为 mRNA 转 录 模
板，必须进一步合成为双链（Double-stranded，ds）
DNA，最终通过转录、翻译过程实现目的基因的表
达［1，11-14］（图 2）。此外，也有报道高尔基体 / 内质
网参与到了 AAV 在细胞质内的转运过程［15］。
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Rep
ITR
D sequence
trs
3˃
3˃
3˃ 5
5˃˃3˃
5˃
Cap
rAAV
wt AAV
AAP
ITR
图 1 AAV 结构示意图
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图 2 AAV 在细胞中的生物学过程示意图
2 提高腺相关病毒转导效率的方法
2.1 选择组织特异性强的血清型/变体
根 据 衣 壳 蛋 白 抗 原 的 不 同，AAV 可 以 分 为
1-13 个血清型，且不同血清型的组织靶向性不完
全相同。通过系统注射和局部注射的方法，现已经
证实 ：AAV3、AAV8 和 AAV9 对肝脏靶向性较强 ；
AAV6、AAV8 对心脏、胰腺的特异性突出 ；AAV4、
AAV9 对肺的特异性明显 ；AAV2 对肾的特异性较
强 ；AAV1、AAV2、AAV5 和 AAV9 对 脑 组 织 的 特
异性较好 ；对骨骼肌选择性较强的载体有 AAV1、
AAV5、AAV6、AAV7、AAV8 和 AAV9 ；另外，AA-
V2、AAV5 对角膜的靶向性优于其他血清型［16-18］。
为了更加精确地针对特殊细胞群进行治疗，越来
2015,31(9) 51殷子斐等：提高重组型腺相关病毒转导效率的研究现状
越多的研究者针对特定组织中的某一类细胞筛选
rAAV 不同血清型。例如，本课题组［19-21］的研究表
明 ：rAAV3 能使用人肝细胞生长因子受体作为共受
体，对肝癌细胞的靶向性很强 ；Markakis 等［22］发
现 AAV5 在神经元蛋白阳性、胶质原纤维酸性蛋白
阳性的细胞中转导效率最佳 ；Aschauer 等［23］报道 ：
rAAV8 主要在脑星形细胞中表达，而脑皮层神经元
是 rAAV9 的主要靶向组织。
近年来，借助于现代分子生物学技术，通过点
突 变、DNA 体 外 重 组 技 术（DNA shuffling）、 衣 壳
蛋白引入新肽段等方法，建立起了包含成千上万种
AAV 变体的大型 AAV 文库，为筛选靶向性更强的
rAAV 载体提供了有效的保障［24］。点突变技术是指
应用易错聚合酶链反应（PCR）技术，将单个或多
个碱基进行突变的方法。利用点突变技术，可以将
AAV 中 Cap 基因序列进行突变，从而形成一个或多
个位点氨基酸不同的变体（图 3-A）。Perabo 等［25］
对 rAAV2 Cap 序列中 353-767 的氨基酸序列进行了
突变，产生了 2.5×107 个 AAV 变体，并从中进一步
筛选出了能够降低被人血清抗体中和的变体。DNA
体外重组（shuffling）技术是指使用核酸酶，将基
因剪切后产生大量的片段，在此基础上，使之互为
引物和模板进行 PCR 扩增，从而发生基因重组。使
用此技术，将多种 AAV 的 Cap 序列剪切后，发生
随机重新组合，就可以产生大量的变体［26-28］（图
3-B）。如 Yang 等［28］ 采用这种方法，建立了 AAV
文库，并从中筛选出变体 M41，其对心脏的靶向性
与目前报道的心脏靶向性最强的 rAAV9 相当，且在
肝脏中的转基因表达明显较低。细胞表面特异性的
受体是基因治疗载体结合的位点。因此，如果 AAV
表面有与特异性受体结合的配体，那么，其靶向性
将大大提高。随机肽段插入法是指在目的基因中插
入一段可表达特异性肽段的 DNA 序列。在 AAV 的
Cap 基因中，用直接结合法或转座子介导突变等方
法，可以在不影响 AAV 包装的前提下在特定的位
点插入一段能够表达特异性肽段的 DNA 序列，从
而 形 成 大 量 新 的 AAV 变 体［29-31］（ 图 3-C）。Müller
等［30，31］使用这种方法建立了载体文库，并从中筛
ACA CGG
AGA CGG
AAA CGG
ACA CCG
ATA GGG
AAV
DNA
AAV13
AAV12
AAV2
AAV1
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图 3 AAV 文库的构建方法
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.952
选出的 AAV9 变体对人脐带血内皮细胞的亲和力为
wtAAV9 的 200 倍。
值得指出的是，目前对于 rAAV 血清型 / 变体
的筛选主要停留在细胞和动物实验上，并不能直接
地指导临床应用。例如，AAV8 能够靶向小鼠的肝
脏细胞，却在人的肝脏细胞中转导效率不高。因
此，如何构建更加能够反映人的某种组织特异性的
动物模型，并在此基础上筛选鉴定最佳的 AAV 血清
型 / 变体，是亟需解决的问题。Lisowski 等［32］将一
位患者的新鲜肝脏细胞接种在免疫缺陷的 FRG 小鼠
肝脏上，从而构建了人 - 鼠肝的杂合体。这种动物
模型对于 AAV 在肝脏疾病中的应用具有极高的应用
价值，值得借鉴。其次，AAV 文库的出现为大规模
筛选靶向性更强的载体提供了可能，但不同的方法
建立的文库中的变体的结构、组织靶向性不尽相同。
因此，有必要加大多个文库间的比较，并从中筛选
出对某一特定的组织靶向性最强的变体。此外，许
多文库面临一个问题 ：大多数变体并不能有效地包
装 rAAV 载体。如何整合并优化现有的构建文库方
法，建立变体数量不庞大、但却含有高效变体的文
库，也需要进一步的研究。Marsic 等［33］通过计算
机模拟的方法，先根据 AAV 衣壳蛋白的结构特点，
结合目前已知的 150 个变体，在不影响 AAV 衣壳
蛋白包装的前提下，仅针对衣壳蛋白表面的部分可
变氨基酸位点进行调整，最终产生了大约 8×105 的
rAAV2 变体，大大减少了那些不能被包装的 AAV 变
体的产生。
2.2 采用蛋白酶体抑制剂
泛素 - 蛋白酶体系统是细胞降解错误以及外源
蛋白质的主要途径，在细胞周期、细胞凋亡等方面
发挥着重要的作用［34，35］。不仅如此，泛素 - 蛋白酶
体系统也在 rAAV 进入宿主细胞后的生物学过程中
发挥了重要作用［36］。当 rAAV 进入细胞，离开内含
体之后，其衣壳蛋白被泛素化标记。被泛素化标记
的 rAAV 会被泛素 - 蛋白酶体系统降解，导致 rAAV
的转导效率下降［37，38］。在这个机制被揭示后，关于
应用蛋白酶体抑制剂提高 rAAV 转导效率的报道相
应地增加。
Duan 等［37］ 最早报道 ：半胱氨酸蛋白酶抑制
剂 LLnL、 泛 素 蛋 白 酶 体 抑 制 剂 MG132 等 能 明 显
将 rAAV2 在支气管上皮细胞的转导效率提高 10 倍
左右。Jennings 等［39］以类风湿性关节炎患者病变
部位的人滑膜细胞为研究对象，发现蛋白酶体抑制
剂 zLLL 能够明显增加含有白介素 IL-10 治疗基因
的 rAAV2 的转基因表达。此外，蛋白酶体抑制剂
MG132 还可以提高 rAAV 在人黑色素瘤细胞 M21、
人胶质瘤细胞 U87 等多种肿瘤细胞中的转导效率［40］。
硼 替 佐 米（Bortezomib） 是 目 前 已 经 被 美 国
食品及药品管理局批准用于临床的蛋白酶体抑制
剂，主要用于多发性骨髓瘤的治疗。现有不少学者
针对这个药物在 rAAV 基因治疗中的应用进行了研
究。Neukirchen 等［41］研究发现 Bortezomib 可以明显
提高细胞中 rAAV 介导的 p53 基因的表达水平，且
二者具有协同的抗非小细胞肺癌的作用 ；Monahan
等［42］在使用含有第八凝血因子治疗基因的 rAAV2
和 rAAV8 治 疗 A 型 血 友 病 的 狗 时， 同 时 注 射 了
Bortezomib，结果发现仅 Bortezomib 单次给药就能使
rAAV2 和 rAAV8 的转导效率分别提高 6 倍和 3 倍，
并能使血友病狗的凝血时间恢复正常，出血率降低
90%。此外，研究显示，一种新的蛋白酶抑制剂卡
非佐米（Carfilzomib）能够特异性地抑制糜蛋白酶样
蛋白酶体的活性，其提高 rAAV 的转导效率［36］的效
能与 Bortezomib 相当。
目前在 rAAV 转导效率研究中常用的蛋白酶体
抑制剂大多为化学合成，但从中药中分离的一些化
合物也有抑制蛋白酶体活性的作用，可提高 rAAV
的转导效率［43-45］。Zhang 等［43］发现从中药雷公藤
中提取出来的单体——雷公藤红素可以明显在细胞
诱导分化前后增加前脂肪细胞 3T3-L1 中 rAAV1 的
转导效率，其原因是雷公藤红素可以抑制蛋白酶体
活性，增加 rAAV 入核。Wang 等［44］进一步发现雷
公藤红素的结构类似物——扁塑藤素也能通过同样
的机制在体内外提高 rAAV 的转导效率，且扁塑藤
素的作用较雷公藤红素强。
蛋白酶体抑制剂在提高 rAAV 转导效率的同时，
它们的毒性作用也必须引起注意。例如，Bortezomib
可导致胃肠道不适、周围神经病变、心力衰竭等不
良反应，不少患者不得不减少使用剂量，甚至终
止治疗［46-48］，因此，在利用蛋白酶体抑制剂联合
2015,31(9) 53殷子斐等：提高重组型腺相关病毒转导效率的研究现状
rAAV 治疗疾病时，必须尽可能地将蛋白酶体的剂量
控制在安全、有效的范围内。与此同时，现已证明
一些中药单体具有蛋白酶体抑制剂的活性，能提高
rAAV 的转导效率，这为新的蛋白酶体抑制剂的研发
开辟了新的方向，但是，也必须对它们的毒副作用
进行严格的评估。
2.3 衣壳蛋白定点突变
在研究泛素化 - 蛋白酶体对 rAAV 影响时，Yan
等［38］ 发现，经热处理的衣壳蛋白更容易被泛素
化，提示衣壳蛋白在泛素化之前可能发生了构象
变化或经历了某种修饰。随后，Zhong 等［12，49，50］
研究显示，细胞内的上皮生长因子受体酪氨酸激
酶（Epidermal growth factor receptor protein tyrosine
kinase，EGFR-PTK）能够将 rAAV 衣壳蛋白表面酪
氨酸（Tyrosine，Y）残基磷酸化，磷酸化的衣壳蛋
白将通过泛素化 - 蛋白酶体途径被降解，导致 rAAV
转导效率降低。两年后，同一课题组对 rAAV2 衣壳
蛋白中的表面裸露的 7 个酪氨酸（Y）残基位点突
变成苯丙氨酸（Phenylalanine，F），各个突变体均
能有效提高 rAAV2 的转导效率，且 Y730F 能够分
别在 HeLa 细胞和小鼠肝脏中的将转导效率提高 10、
30 倍，能在小鼠体内将治疗血友病基因的第九凝
血因子的表达效率提高 10 倍［12］。在此基础上，该
课题组还尝试对 rAAV 多个酪氨酸残基位点进行点
突变，结果显示，AAV2-3M（Y444+500+730F）在
小鼠肝脏细胞中的转导效率较 AAV2 单个位点的
突变体高 3 倍，较 wtAAV2 提高至少 30 倍［51］。此
外，Qi 等［52］ 对 rAAV2 同 时 进 行 了 3 个 和 6 个 位
点的突变，结果显示 ：新构建的突变体 AAV2-6M
（Y252+272+444+500+704+730F）在肾小管上皮细胞
中的转导效率最高。关于通过 Y 残基定点突变提高
rAAV 转导效率的研究主要集中在 AAV2 上，但这项
技术对 AAV6 等血清型也适用［53］。不仅如此，衣壳
蛋白 Y 残基定点突变还能进一步提高 AAV 变体的
转导效率。如 Klimczak 等［54］对 AAV 变体 ShH10 进
行定点突变（Y445F），新的载体在 Müller 细胞的转
导效率较 ShH10 进一步提高，且能实现治疗基因——
胶质细胞源性神经营养因子在视网膜中的稳定表达，
减缓大鼠视网膜退行性变的病情进展［55］。
虽然，目前的衣壳蛋白突变大多将 Y 残基进行
突变，但是 Aslanidi 等［56］用丝氨酸（Serine，S）/ 苏
氨 酸（Threonine，T） 蛋 白 激 酶 JNK、p38MAPK 处
理细胞后，携带有增强绿色荧光蛋白（Enhanced
green fluorescence protein，EGFP） 报 告 基 因 的
rAAV2 在细胞中基因表达明显增高，这表明对衣壳
蛋白表面暴露的 S 和 / 或 T 磷酸化能降低病毒载体
的转导效率。在此基础上，该课题组分别对 AAV2
衣壳蛋白上的 S、T 位点进行突变，结果发现，将 S
或 T 突变成缬氨酸（Valine V）的 rAAV2 载体的转
导效率更强［56，57］。
对 rAAV 衣壳蛋表面的 Y、S、T 残基进行定点
突能显著提高其转导效率，这种技术已经被越来越
多的学者证实并采纳［58-61］。然而，衣壳蛋白突变不
一定对所有的血清型有效。例如，Qiao 等［62］构建
了突变体 AAV8（Y447F、Y733F）、AAV9（Y446F、
Y731F）， 结 果 显 示， 突 变 后 的 AAV 与 wtAAV 在
基因转导效率上并无明显差别。这究竟是突变位点
不佳，还是衣壳蛋白定点突变的方法对这两种血清
型无效，尚待进一步的分析。其次，衣壳蛋白上能
被磷酸化的位点有很多，但究竟对哪个位点、多少
个位点进行突变，是突变某一种氨基酸还是多种氨
基酸的残基位点，才能获得具有最强的转导效率的
突变体，还需要深入的研究来证实。目前，已经有
学者针对这个问题进行了初步的尝试，结果显示，
AAV2-4M（Y444+500+730F+T491V）突变体的转导
效率比突变体 AAV2-3M（Y444+500+730F）还高 2-3
倍［57］。然而，这样的突变组合对于其他血清型的
rAAV 是否适用，还需要进一步的分析。
2.4 增加第二链的合成
虽然 wtAAV 能感染多种哺乳类细胞，但在缺乏
辅助病毒或其他辅助因子情况下，其自身基因表达
几乎检测不到。同样的，rAAV 自身介导的转基因表
达水平低下。其中一个重要原因是其 ssDNA 必须变
成 dsDNA 才能完成转录和翻译，这个 DNA 第二链
合成 rAAV 介导的转基因表达的限速环节［63］。
单链 D 序列结合蛋白（Single-stranded D-seque-
nce-binding protein，ssD-BP）在 rAAV 基因组第二链
合成的过程中发挥着重要的作用。Qing 等［11，64，65］
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.954
在 20 世纪 90 年代发现，当 ssD-BP 的 Y 残基位点被
EGFR-PTK 磷酸化后，它能与 AAV 基因组中的 ITR
中的 D 序列结合，从而导致 DNA 从 3 端的复制受
阻，影响 dsDNA 的合成。随后的研究表明 ：ssD-BP
中的部分氨基酸序列与一种细胞内源性的可与免疫
抑制药物 FK506 结合的蛋白（FK506-binding protein
52，FKBP52） 相 同。 除 了 Y 磷 酸 化，S 或 T 磷 酸
化的 FKBP52 亦能显著抑制 rAAV 基因组的第二链
合成［66］。
随着以上机制的揭示，关于通过调控 FKBP52
去磷酸化从而增加转基因表达的方法也逐渐增多。
如 Qing 等［67］发现 Y 磷酸化的 FKBP52 是 T 细胞蛋
白酪氨酸磷酸酶（T-cell protein tyrosine phosphatase，
TC-PTP）的底物。HeLa 细胞和小鼠过表达 TC-PTP
后，FKBP52 的磷酸化程度显著降低，伴随着 ssAAV
的转导效率明显提升 ；Zhong 等［68］将 TC-PTP 基因
包装进入 rAAV 组成新的病毒载体 rAAV-TC-PTP，
并将其与携带有报告基因的 ssAAV 病毒载体同时
感染细胞，这种共感染的方法能安全有效的提高
ssAAV 的 转 导 效 率 ；Zhao 等［69］ 发 现 细 胞 磷 酸 酶
5（Protein phosphatase 5，PP5） 能 够 介 导 FKBP52
在 S 或 T 残基上的去磷酸化，增加单链 rAAV 的第
二链合成 ；Jayandharan 等［70］ 用 3 种 rAAV 载体共
同感染小鼠，即携带有报告基因的 ssAAV，过表达
TC-PTP 及 PP5 的病毒载体。这种方法能使靶细胞
内 FKBP52 的 Y、S、T 残基均去磷酸化，最大程度
降低第二链合成的抑制作用，结果显示，该方法使
ssAAV 的报告基因在小鼠肝脏中的表达效率提高了
16 倍。Ma 等［71］在传统的三质粒包装 rAAV 的基础
上，增加了含有 PP5 基因的质粒，这样包装纯化
后 的 病 毒 含 有 rAAV2-EGFP 和 rAAV2-PP5 两 种 病
毒，这种混合的病毒在体内外的转导效率较单独的
rAAV2-EGFP 高 5-10 倍。
ssD-BP、FKBP52 的发现阐明了 ssAAV 转导效
率 有 限 的 根 本 原 因，TC-PTP、PP5 的 应 用 能 够 使
FKBP52 残基去磷酸化，从而将抑制第二链合成的作
用降低，增加 rAAV 介导的转基因表达效率。然而，
需要注意的是，虽然通过构建过表达 TC-PTP、PP5
基因的细胞或小鼠，有助于阐明其作用机制，但是
过表达这些基因对细胞或小鼠的生理功能是否有影
响，目前尚无确切的研究报道。其次，直接将携带
有 TC-PTP、PP5 基因的辅助 rAAV 注射到人体内，
其安全性同样也需要深入评估。
2.5 将单链病毒载体改造成自身互补型双链载体
自然条件下存在的 AAV 的基因组是 ssDNA。虽
然人们已经发现了影响其第二链合成的关键酶，并
且可以通过对关键酶的调控增加 rAAV 转基因表达
效率，但将传统 ss rAAV 病毒载体直接改造成 ds 载
体，则能更加快速有效地提高 rAAV 的转导效率。
早在 2001 年，McCarty 等［72］ 将原来的 rAAV2
的包装的基因组的长度从 4 474 碱基减少至 2 299 碱
基， 首 次 分 离 了 自 身 互 补 性（Self-complementary，
sc）的 rAAV 载体，这种 scAAV 一端为正常的 ITR，
另一端为 ITR 的二聚体，中间的基因组是互补的双
链，从而解除了在 ssAAV 病毒载体基因表达过程中
合成第二链的限制。体外研究证实，scAAV 的转导
效率是 ssAAV 的 5-190 倍。随后不久，McCarty［73］
等进一步研究表明 ：只要去除 rAAV 的一端的 ITR
的 trs，就能避免末端 ITR 在复制后被 Rep 蛋白质剪
切。这个新合成的 DNA 会在分子内部通过碱基配对
的作用进行折叠，从而形成 scAAV 载体。动物实验
显示 ：ssAAV2 在小鼠肝脏中的表达效率仅有 5%-
10%，而 scAAV2 的表达效率却高达 25%-50%。此后，
Wang 等［74］进一步将一端 ITR 中的部分 D 序列和
trs 一起删除，合成双链的 scAAV2。这种新的 rAAV
载体不仅能在体外实现对黑色素瘤、肺癌等多种肿
瘤细胞的转基因表达，并能在体内肝脏中高效表达
转基因，并维持长达 6 个月。
这种新型的 scAAV 较传统的 ssAAV 的转基因
表达效率大幅提高，可用于多种血清型、多种疾病
的基因治疗中。例如，Nathwani 等［75］ 研究发现 ：
scAAV8 能够快速地在细胞中形成有活性的双链线
性基因组，并使人凝血因子 IX 的转导效率较 ssAAV
提高 20 倍左右，更加有效地纠正小鼠的出血状态 ；
Gao 等［76］ 合成的 scAAV7、scAAV8 在食蟹猕猴的
肝脏细胞中的转导效率较传统 ssAAV2 有 2 个指数
倍数的提高 ；Liu 等［77］将 scAAV2 直接注射到大鼠
感觉运动皮质、红核、背根神经节，结果显示这些
地方沿着轴突有很强的报告基因表达。
2015,31(9) 55殷子斐等：提高重组型腺相关病毒转导效率的研究现状
然 而，scAAV 也 有 着 一 定 的 局 限 性。 首 先，
scAAV 提高转导效率是建立在牺牲基因装载容量的
基础之上的，因为传统的 ssAAV 能包装约 4 500 碱
基的基因，而 scAAV 载体的基因装载量只有 2 300
碱基左右，约为 ssAAV 的一半，这并不适合杜氏
肌营养不良等治疗基因较长的疾病 ；其次，虽然目
前研究者们已经成功地实现了 scAAV 在肝脏、肌
肉、骨髓、眼等多种组织和细胞中的转导，但并非
所有细胞都能被 scAAV 感染［78］。如 Ding 等分别使
用携带有报告基因的 scAAV2、ssAAV2、scAAV5、
ssAAV5 感染人极化气道上皮细胞，结果发现 scAAV
与 ssAAV 之间没有区别，这说明可能在某些细胞中，
从单链合成双链并非转基因表达的限速环节［78，79］。
再次，scAAV 较 ssAAV 能够激发更强的免疫反应。
如 Martino［80］等研究结果表明，与注射 ssAAV 后的
小鼠相比，注射 scAAV 后的小鼠体内的肿瘤坏死因
子 a、单核细胞趋化化蛋白 1、g 干扰素诱导蛋白等
炎性因子明显升高，且肝脏中的中性粒细胞、巨噬
细胞、自然杀伤细胞明显增多，这说明 scAAV 较
ssAAV 对机体产生的免疫反应更强 ；Wu 等［81］研究
发现，scAAV 能够较 ssAAV 明显增加转基因产物特
异的 CD8+ T 细胞的数量。由于过强的免疫反应不仅
会导致抗体的产生，降低后续基因治疗的疗效，且
对机体也有损伤，因此，如何合理控制 scAAV 的使
用剂量，在提高疗效的同时，保证机体的安全是亟
需探讨的。
3 结语
基因治疗不仅是遗传性疾病的最佳疗法，也在
肿瘤、心血管疾病、自身免疫性疾病的治疗中有着
重要的价值。rAAV 免疫源性低、感染谱广，是目前
基因治疗领域中的热门载体。然而，由于 AAV 血清
型有限且对组织的靶向性不强，AAV 进入细胞后会
被蛋白酶体降解，且 ssAAV 必须实现向 dsAAV 的
转变才能完成基因的表达，而第二链合成的过程在
很大程度上受细胞内特异性蛋白抑制，rAAV 的转导
效率不尽如人意，限制了其广泛应用。
随着研究的不断深入，通过对 AAV 生命周期
更加全面的了解，现已经建立了一系列有效的提高
rAAV 转导效率的方法。野生型的 AAV 只有 13 种，
但在现代分子技术上建立的 AAV 文库包含了大量的
变体，使载体数量有了几何倍数的提高，这为将来
筛选特异性强的 AAV 载体提供了宝贵的资源 ；通过
直接使用蛋白酶体抑制剂，或者对衣壳蛋白进行定
点突变，均可以显著降低衣壳蛋白被泛素 - 蛋白酶
体系统的识别，保障 rAAV 的转基因表达 ；TC-PTP、
PP5 的应用可以将细胞中限制第二链合成的蛋白活
性降低，加速 rAAV 载体在靶细胞中的第二链合成 ；
新合成的 scAAV 载体则可以直接跳过合成双链这
个环节，快速地实现转基因的转录、翻译。除了目
前最常用的这 5 类方法外，还可通过使用三氧化二
砷增加细胞内活性氧、紫外线改变细胞内环境、在
rAAV 的衣壳蛋白上连接化学基团改变其对靶细胞的
亲和性等方法提高 rAAV 的转导效率［63，82-84］。正是
由于这些方法的发现、验证和应用，rAAV 的转导效
率大幅度提升，可用其进行基因治疗的疾病范围也
逐渐扩大。目前，全球第一个以 rAAV 为载体的基
因治疗药物——Glybera 已经于 2012 年上市，并且
还有关于 rAAV 基因治疗的多项临床试验正在进行
中，有望早日应用于患者。
在今后的研究中，需要注意的是，现报道的提
高 rAAV 转导效率的方法部分尚处于细胞和动物实
验阶段，能否安全、有效地应用于临床，还需要进
一步的判断评估。本综述中介绍的这些方法分别在
rAAV 衣壳蛋白与细胞绑定、胞内运输与降解、基
因复制与转录等环节中发挥作用。因此，十分有必
要将这些方法进行联合应用，以实现转导效率的最
大化。可以采取以下策略，首先，在常规血清型和
rAAV 文库的基础上，筛选对某一特定组织靶向性
最强的载体，并进一步根据载体的结构，突变其表
面的部分衣壳蛋白的氨基酸残基，合成感染效率更
佳的 rAAV 突变体 ；其次，若目的基因较小，则合
成 scAAV，若只能使用 ssAAV，则可联合含有 TC-
PTP、PP5 的 rAAV 同时应用 ；最后，结合安全剂量
下的蛋白酶抑制剂，实现目的基因的表达。事实上，
在最近一次的乙型血友病临床试验中，科学家们已
经将几种方法联合应用，包括本文介绍的以及没有
介绍的，从而增加 rAAV 介导的转基因表达。这些
方法包括 ：转基因 DNA 序列人源化、AAV8 血清型、
scDNA 的基因组以及联合使用免疫抑制剂地塞米松
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.956
等［85］。相信在不远的将来，通过科研和临床工作者
们不断的深入探索和有效的交流合作，rAAV 可以为
维护人类的健康作出更加重要的贡献。
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（责任编辑 狄艳红）