全 文 ：·技术与方法·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第10期
随着转基因技术的不断发展，人们对于转基因
生物及其产品的安全性的关注度越来越高，为此，
包括我国在内的 50 多个国家和地区建立了标识制
度，对转基因产品实行严格监管。标识监管制度的
实施，依赖于快速、灵敏、准确的检测方法。目前
转基因产品检测技术主要分为两大类，一类以外源
DNA 为检测对象，如 PCR、LAMP 等 ；另一类以外
源基因表达蛋白质为检测对象，如 ELISA、快速检
测试纸条等［1］。
转基因外源蛋白检测方法是以纯度好、效价高
的蛋白抗体与抗原蛋白的特异性结合为基础。目前
转基因品种中外源蛋白抗体的制备和方法应用，针
收稿日期 ：2014-03-13
基金项目 ：吉林省人力资源与社保厅项目博士后启动项目
作者简介 ：龙丽坤，女，博士，副研究员，研究方向 ：转基因植物环境安全检测 ；E-mail ：longlikun@126.com.
通讯作者 ：李飞武，男，硕士，副研究员，研究方向 ：转基因检测技术 ；E-mail ：lifeiwu3394@sina.com
bar 基因表达蛋白单克隆抗体制备及 ELISA 检测
方法的建立
龙丽坤  李葱葱  张明  李飞武
（吉林省农业科学院，长春 130033）
摘 要 ： 通过原核表达诱导 bar 基因表达蛋白，通过表达蛋白免疫 BALB/c 小鼠，经细胞融合、筛选克隆，获得一个杂交瘤
细胞株。以兔多抗作为捕获抗体，鼠单抗作为示踪抗体，辣根过氧化物酶标记羊抗鼠 IgG 作为检测系统，建立了转基因植物 bar 基
因检测双抗夹心 ELISA 方法，试验证明利用该抗体建立的 ELISA 检测方法含有转 bar 基因的转基因玉米成分具较好的特异性和灵
敏度。为转基因成分的检测提供了安全、快速、准确的技术手段。
关键词 ： bar 基因 杂交瘤细胞 单克隆抗体 转基因检测
Development of A Monoclonal Antibody Sandwich ELISA for Detection
of bar Gene Transgenic Plant and Element
Long Likun Li Congcong Zhang Ming Li Feiwu
（Jilin Academy of Agricultural Sciences，Changchun 130033）
Abstract: This study induced prokaryotic express Bar protein, by protein Immunity of BALB/c mice, cell fusion and screening clones, we
obtained a hybridoma cell line. In this study, using rabbit polyclonal IgG and hybridoma cells secreting monoclonal antibodies we established
sandwich ELISA method for detection of bar gene intransgenic plant which showed good specificity and sensitivity . This study provides rapid
and accurate.technical tool for a secure monitoring of GMO.
Key words: bar gene Hybridoma Monoclonal antibody GMO detection
对 Cry1Ab、Cry1Ac 等 Bt 蛋 白，CP4-EPSPS 蛋 白，
磷酸酶 II 等蛋白的检测方法已广泛应用［2］。bar 基
因，编码蛋白—膦丝菌素乙酰转移酶（PAT），该基
因广泛应用于基因工程育种中，也是遗传转化中的
标记基因，它使植物抵抗以 L-phosphiothricin（PPT）
为活性成分的除草剂［3］。随着转基因食品的快速发
展，国外转 bar 基因作物和食品大量进入我国，转
bar 基因的食品检测技术是转基因食品安全性评价的
重要组成部分，其技术研究具有重要的意义。目前，
国内对于 bar 基因表达 PAT 蛋白的检测研究相对较
少［4］。研究者多利用多克隆抗体进行检测方法研究，
但多克隆抗体制备相对复杂，产量较低，抗体稳定
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第10期72
性和检测重复性具有一定局限性。高旭东等［5］的研
究仅制备了表达 PAT 蛋白单克隆抗体的细胞株，如
用于酶联免疫检测方法仍有待于对抗体特异性和效
价进行进一步验证。
本研究针对检测 Bar 蛋白作为转基因作物或食
品常用筛选方法，制备了高效 PAT 蛋白单克隆抗体，
旨为利用联免疫技术快速检测植物、食品耐抗除草
剂转基因成分提供技术支撑。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 载体和细胞 pET-28a 载体载体 E. coli DH5α、
BL21 感受态细胞，鼠源肾细胞，SP2/0 骨髓瘤细胞
均购自上海生工生物技术公司。
1.1.2 试验动物 BALB/c 雌性小鼠由北京鼎国生物
公司提供。
1.1.3 转基因标准样品 转基因玉米及其成分含量
样品，由农业部转基因环境安全监督检验测试中心
（长春）制备并提供。
1.1.4 主要试剂 限制性内切酶、T4 DNA 连接酶、
反转录酶、LA Taq DNA 聚合酶均购自 TaKaRa 公司；
pMAL 融合蛋白表达与纯化试剂盒购自 NEB 公司 ；
蛋白 Marker 购自 Fermentas 公司 ；弗氏佐剂、PEG、
HAT、HT、8-氮鸟嘌呤（8-AG）、邻苯二胺（OPD）
均 购 自 Sigma 公 司 ；HRP 标 记 羊 抗 鼠 IgG（HRP-
IgG）购自北京中杉金桥生物技术有限公司 ；SBA
ClonotypingTM System/HRP 抗体亚类鉴定试剂盒购自
Southern Biotechnology 公司 ；二氨基联苯胺（DAB）
显色试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。
1.2 方法
1.2.1 引物设计 从数据库中检索商业化载体序
列，进行核苷酸和氨基酸序列比对。对核酸序列进
行密码子优化，使其更适于大肠杆菌中表达，并保
证氨基酸序列不变。序列确定后，5 端引入 BamH
I 酶切位点，3 端引入 Hind III 酶切位点，最终设计
并确定扩增 bar 基因全长的引物序列为 ：BarF ：5-
CGCGGATCCATGTCTCCG-3 BarR ：5-CCCAAGCTT-
GATTTCGGTAAC-3 扩增长度为 ：567 bp。
1.2.2 基因扩增和表达 以合成引物序列扩增 bar
基因全长，用 BamH I 和 Hind III 内切酶分别酶切
pET-28a 载体，并将扩增片段连接入 pET-28a 载体，
连接产物转化至 DH5α 感受态细胞 ；利用 PCR 扩增
鉴定阳性质粒，并将阳性重组质粒命名为 pET-Bar。
提取质粒 pET-Bar 并转化到 BL21（DE3）感受态细
胞。筛选阳性克隆。挑取含 pET-Bar 质粒的单克隆
菌落，接种于 100 mL 含有氨苄青霉素的 LB 培养
基（用 LB（Amp+）表示）中，37℃震荡培养过夜。
次日用 LB（Amp+）稀释至 1 000 mL，37℃培养至
OD600=1 左右，加 IPTG 至终浓度为 1 mol/L。37℃继
续培养 6 h。4℃，5 000 r/min 离心 10 min，收集沉
淀并用 PBS 洗涤。
1.2.3 原核抗原蛋白分离 灌制 10％分离胶 60 mL
和 5％浓缩胶 15 mL，灌胶。上样后进行 SDS-PAGE
凝胶电泳。电压 100 V，电泳 6-7 h。终止电泳后，
用冷 0.1 mol/L KCl 浸泡胶 2-3 min，切下目的条带置
透析袋内。将透析袋置于水平电泳洗脱装置内，60
V 洗脱过夜。次日 100 V 继续洗脱 1 h。反转电极向
相反方向洗脱 3-5 min。吸出透析带内液体，蔗糖包
埋浓缩，PBS 透析。
1.2.4 动物免疫、细胞融合、筛选、克隆及 MAb 制
备 用纯化后的 Bar 蛋白免疫 6 周龄雌性 BALB/c 小
鼠，利用间接 ELISA 筛选方法对上清进行检测，具
体参照文献［6，7］方法进行。采用液相有限稀释
法进行细胞克隆。
取 20-22 g Balb/c 雌性小鼠，每只腹腔注射 0.5
mL 降殖烷（2，6，10，14- Tetramethylpen- tradecane，
Janssen Chimica 公司）。一周后，每只小鼠腹腔注射
约 2×106 个杂交瘤细胞。7-10 d 后小鼠腹部显著膨
隆，收集腹水。
1.2.5 MAb 亚类测定 按照 SBA ClonotypingTM Syst-
em/HRP 抗体亚类试剂盒说明书进行检测。
1.2.6 ELISA 检测方法的建立 方阵试验确定兔抗
bar 基因蛋白多抗与 McAb 最佳工作浓度［8，9］。以兔
抗 bar 基因 IgG 包被液和单抗稀释液浓度梯度，按
照多抗包被-封闭-加样-加单抗-加二抗-显色与终
止的程序进行。在酶标仪上读取 OD450 nm。以阳性孔
OD 值接近 1，P/N 值最大时，确定兔抗 PPV IgG 和
McAb 的最大稀释度为其最佳工作浓度。以确定的最
佳单抗和多抗浓度作为 ELISA 检测体系的关键参数，
进行样品检测。
2014年第10期 73龙丽坤等 ：bar 基因表达蛋白单克隆抗体制备及 ELISA 检测方法的建立
2 结果
2.1 PAT蛋白抗原表达与分离
利用设计的引物，进行优化密码子的 bar 基
因 全 序 列 扩 增， 扩 增 条 件 为 95℃，5 min ；95℃
30 s，58℃ 45 s，72℃ 1 min，35 个循环 ；72℃延伸
10 min，扩增的片段经 2% 琼脂糖凝胶电泳，检测为
567 bp 特异性片段，见图 1。并经过测序鉴定，验
证了与设计片段序列的一致性。
限稀释法进行，准确计数后进行系列稀释到 1 mL 含
10 个细胞，克隆后，选取单个细胞生长集落孔上清
进行检测，从中选取 1 个阳性值最高的孔再进行克
隆，直至检测阳性率为 100%。本研究获得了 1 株能
稳定分泌抗 PAT 蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，
将杂交瘤细胞株命名为 4C2，于 2012 年 7 月 9 日保
藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中
心，保藏号为 CGMCC No.6341。
2.3 单克隆抗体的纯化
小鼠腹腔注射约 2×106 个杂交瘤细胞。收集
腹水。12 000 r/min 离心 30 s，去除沉淀和上层油
脂，收集中段液体。并用 PBS 透析。平衡 Protein A
Sepharose-4B 层析柱（Pharmacia 公司）。用结合缓冲
液 1 稀释样品后通过层析柱。待流出液体的 OD 值
为 0.01 时，用 0.1 mol/L 柠檬酸钠（pH2.6）洗脱层
析柱，收集洗脱液。用 5 mol/L Tris（pH8.8）调节
pH 至 7.0，PBS 透析。纯化的抗体进行 SDS-PAGE
电泳，如图 3 所示，单克隆抗体的分子量约 147 kD，
在还原剂的作用下，抗体分解为两个片段，其中重
链 50 kD，轻链 25 kD。
M 1
600
bp
500
M ：DNA 分子量标准 ； 1 ：567 bp 目标片段
图 1 bar 基因全长的扩增图谱
获得的 567 bp 的 bar 基因片段克隆至 pET-28a
载体，表达载体在 IPTG 诱导 6 h 后能稳定表达 PAT
融合蛋白。融合蛋白以包涵体形式存在，约占菌体
总蛋白的 10％。其分子量约为 27 kD（图 2）。获得
的纯化的 PAT 蛋白为本试验所用抗原。
M 1
27
kDkD
24
M 1 2 3 4 5
M ：蛋白质分子量标准 ；1 ：300 nm 洗脱峰 ；2 ：200 nm 洗脱峰 ；
3 ：100 nm 洗脱峰 ；4 ：10 nm 洗脱峰 ；5 ：穿透峰
图 2 SDS 电泳分析 PAT 蛋白表达
kD
25
50
M1 2 3
1，2 ：该细胞株表达的抗体蛋白 ；3 ：阴性细胞株 ；M ：蛋白质分子量标准
图 3 纯化单抗的 SDS-PAGE 电泳图
2.4 MAb 腹水效价测定及亚类鉴定结果
将分离纯化的 PAT 蛋白用包被缓冲液进行稀
释，加入酶标板中（100 μL/孔），PAT 蛋白的包被浓
度为 10 μg/mL ；37℃孵育 2 h，然后用洗涤缓冲液冲
洗酶标板。将 1 g 非转基因大豆叶片总蛋白加入 10
mL 包被缓冲液中，在研钵中研磨，得到阴性对照液，
将阴性对照加入酶标板中（100 μL/ 孔），即为阴性
对照孔 ；37℃孵育 2 h，然后用洗涤缓冲液冲洗酶标
板。每孔加入 100 μL 含 5% 脱脂奶粉的磷酸缓冲液，
37℃孵育 30 min，然后用洗涤缓冲液冲洗酶标板。
2.2 杂交瘤细胞筛选和单克隆抗体的纯化
每只小鼠 200 μg Bar 蛋白腹腔注射，第 3 次免
疫 1 周后，进行第 4 次免疫，用酒精棉球消毒小白
鼠 尾 部， 把 吸 取 的 0.1 mL 溶 于 PBS 的 PAT 蛋 白，
注射入小白鼠尾部静脉。
免疫鼠脾细胞与骨髓瘤细胞 SP2/O 融合并进行
杂交瘤细胞筛选 ；按照文献方法进行，克隆采用有
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第10期74
每孔加入 100 μL 上述纯化得到的单克隆抗体或其稀
释液（用酶标抗体稀释缓冲液进行稀释），37℃孵
育 2 h，然后用洗涤缓冲液冲洗酶标板。每孔加入
100 μL 酶标二抗工作液，37℃孵育 2 h，然后用洗涤
缓冲液冲洗酶标板。每孔加入 100 μL 底物溶液，室
温避光孵育 60 min 后，用酶标仪测定 450 nm 波长
下的吸收值。
用将吸收值为阴性对照孔两倍以上的孔判断为
阳性孔。杂交瘤细胞培养上清、小鼠腹水及纯化后
抗体的结果，见表 1。
表 1 单克隆抗体 4C2 的效价
杂交瘤细胞株
效价
浓度（mg/mL）
上清 原腹水 纯化
No 6341 10-2 10-6 10-5 1.30
ISO-1 Capture ELASA 试 剂 盒 购 自 Sigma 公 司。
取待测杂交瘤细胞上清液 15 mL，加等量饱和硫酸胺，
混匀后 4℃过夜。次日 10 000 r/min 离心 10 min，沉
淀 溶 于 500 mL 去 离 子 水。 羊 抗 鼠 IgG1、IgG2a、
IgG2b、IgG3、IgA 和 IgM 按 1∶1 000 稀释后包被 96
孔板，3℃作用 1 h。PBS 清洗，每孔加待测上清 50
μL，室温作用 1 h。加 HRP-羊抗鼠二抗，室温作用
30 min。OPD 显色。No 6341 细胞株分泌的单克隆抗
体为 IgG1 亚类，结果如表 2 所示。
表 2 单克隆抗体的亚类鉴定
单克隆抗体类型
亚类
IgG1 IgG2a IgG2b IgG3 IgM
4C-2 0.675 0.103 0.101 0.091 0.515
2.5 双抗夹心ELISA 检测方法的建立
用 包 被 液 将 兔 抗 Bar 基 因 IgG 作 1∶100、
1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、
1∶6 400 稀释，100 μL/ 孔，每个稀释度一行，4℃
过夜包被抗体 ；用 100 μL 3% BSA 作封闭剂，37℃
封闭 3 h ；加入样品、PBS 空白对照，37℃ 40 min ；
加 McAb 用稀释液将 McAb 作 1∶25、1∶50、1∶100、
1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600 稀释，加入酶
标板中，每个稀释度作两列，37℃作用 40 min，；
加酶标二抗加入 1∶5 000 稀释的 HRP-羊抗鼠 IgG，
37℃温浴 40 min，（以上步骤每次操作前均洗涤 3 次，
并拍干液体）；加入新配制的 TMB 底物显色液避光
显色 10-15 min，加入终止液，50 μL/ 孔，在酶标仪
上读取 OD450 nm。以阳性孔 OD 值接近 1，P/N 值最大
时，兔抗 PPV IgG 和 McAb 的最大稀释度为其最佳
工作浓度。确定的兔抗 PPV IgG 包被浓度为 1∶3 200；
单抗稀释倍数为 1∶800。
2.6 特异性和灵敏度试验
成 分 含 量 为 1%、10% 和 100% 的 转 基 因 玉
米材料，所含转基因成分分别为 Bt176（含 bar 基
因）、T25（含 bar 基因）、MON810（不含 bar 基因）、
GA21（不含 bar 基因）各 1 g 加入 10 mL 样品抽提
缓冲液中，并研磨。提取的蛋白作为待测样本液，
利用本研究建立的双抗夹心 ELISA 法检测，含有
bar 基因成分的样本，1% 和 10% 含量均检测 bar 基
因表达阳性，而含有其他转基因成分的样本，为检
测阴性。该结果表明，制备的单克隆抗体与非转 bar
基因植物不发生交叉反应，而与 Bt 蛋白、EPSPS 蛋
白无特异性反应，依据此单抗建立的 ELISA 检测方
法具有检测 bar 基因表达蛋白的良好特异性。从检
测灵敏度来讲，此方法能够检出含 bar 基因转基因
成分含量为 1% 的产品。对加工品的检测和与其他
转基因植物內源蛋白的检测特异性，有待于进一步
研究证明。
3 讨论
随 着 国 内 外 对 转 基 因 产 品 检 测 研 究 的 深 入
以及各国对转基因产品检测要求的提高，迫切地
需要更准确、快速、安全、高效且成本低廉的检
测 技 术 的 问 世。 酶 联 免 疫 吸 附 法（Enzyme-linked
immunosorbent assay，ELISA）用于间接检测转基因
表达的目的蛋白质，由于其快速、灵敏、可定量操作、
简便、无需贵重仪器设备、且对样品纯度要求不高，
特别适用于大批量样品的检测，在转基因成分快速
检测领域有着极高的应用价值，其已被广泛用于转
基因作物中外源基因表达的靶蛋白质水平的分析测
定［10］。美国 FDA 已研究出用双夹心 ELISA 法检测
食品中是否含有转基因玉米成分。EnviroLogix ELISA
试剂盒可用于测定玉米中的 Cry9C 蛋白，在同一实
验室和实验室间共测定了 9 种含玉米的食品，测定
结果的重现性很好。Lipp 等［11］使用 ELISA 法，通
2014年第10期 75龙丽坤等 ：bar 基因表达蛋白单克隆抗体制备及 ELISA 检测方法的建立
过抗体特异性地与 CP4-EPSPS（5- 烯醇丙酮酰莽草
酸 -3- 磷酸合酶，来源于农杆菌 CP4）蛋白结合，检
测 抗草甘膦大豆（Rundup ready soybean，RRS）。对
于 bar 基因表达的 PAT 蛋白的检测方法研究，国外
已有相关试剂盒产品，但价格昂贵，不适用大批量
筛选应用，而国内的检测方法研究普遍使用多克隆
抗体，应用也仅限于实验室内部的初筛，因此开发
稳定的，具有自主知识产权的 PAT 蛋白检测方法和
产品，是本研究的任务之一。
本研究制备了表达 PAT 蛋白的单克隆抗体，并
利用该抗体建立的 ELISA 检测方法，通过转基因样
品的验证，证实其与其他蛋白无交叉反应，效价高，
达到 107 以上，并具有较高的检测灵敏度。检测指
标满足国内检测标准的要求，有较强的实用性，此
方法的进一步完善，有望为我国转基因成分监督和
监测提供快速、安全、低成本的方法，为转基因作
物安全监管提供了有力保障，具有良好应用价值。
4 结论
利用原核表达的 PAT 蛋白免疫小鼠，获得纯化
抗 PAT 蛋白，并通过杂交瘤筛选技术获得了分泌一
株抗 PAT 蛋白细胞株。利用该单克隆抗体本研究初
步建立了检测 bar 基因表达蛋白 ELISA 检测方法。
参 考 文 献
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（责任编辑 狄艳红）
3.5
3.0
2.0
2.5
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Bt176
T25
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图 4 转基因玉米进行的 ELISA 方法特异性检测