全 文 ：第 32卷第 3期
2010年 08月
海　洋　渔　业
Marine　Fisheries
Vol.32 , No.3
Aug., 　2010
文章编号:1004-2490(2010)03-0233-06
抗软骨藻酸单克隆抗体杂交瘤细胞株的构建
　　收稿日期:2010-05-30
基金项目:上海市科委科技攻关项目(08DZ1206302)
作者简介:高利利 (1986-),女 , 山东人 ,硕士研究生 , 主要从事赤潮毒素研究。 E-mail:gaolili 002@163.com
通讯作者:程金平.E-mail:jpcheng@sjtu.edu.cn
高利利 , 刘元嫄 , 程金平 , 王　茜 , 王文华
(上海交通大学环境科学与工程学院 , 上海　200240)
摘　要:为了获得稳定 、高效分泌抗软骨藻酸(DA)单克隆抗体的杂交瘤细胞株 ,采用活泼酯法制备软骨藻酸
免疫抗原(DA-KLH)和包被抗原(DA-BSA), 以 DA-KLH免疫 BALB/c小鼠 , 用细胞融合技术筛选抗软骨藻酸
单克隆抗体杂交瘤细胞株 , 体内诱生腹水法制备大量单抗 , 捕获 ELISA法测定小鼠免疫球蛋白亚型 ,间接 EL
ISA法测定腹水效价;用 G蛋白亲和层析法来纯化腹水。结果显示 , 成功构建 2株能稳定分泌 DA单克隆抗
体(McAb)的杂交瘤细胞株 2B1和 4C2,抗体亚类分别为 IgG1和 IgG2a, 间接 ELISA检测小鼠腹水的抗体效
价达 1∶64 000, 腹水纯化后蛋白浓度为 1.27和 0.675mg/mL。研究结果表明 , 成功制备的抗 DA单克隆抗体
杂交瘤细胞株稳定 、高效 ,为利用该单抗研制快速检测软骨藻酸的胶体金免疫层析试纸条打下基础。
关键词:软骨藻酸;单克隆抗体;杂交瘤细胞株
中图分类号:R392.33;Q547　　　文献标识码:A
Preparationofhybridomacelstrainssecreting
monoclonalantibodiesagainstdomicacid
GAOLi-li, LIUYuan-yuan, CHENGJin-ping, WANGQian, WANGWen-hua
(DepartmentofEnvironmentalScienceandEngineering, ShanghaiJiaoTongUniversity, Shanghai　200240, China)
Abstract:Toobtainstableandeficienthybridomacelstrainssecretingmonoclonalantibody(McAb)against
domicacid(DA), completedantigen(DA-KLH)andcoatingantigen(DA-BSA)weresynthesizedbyactive
estermethod.BALB/cmicewereimmunizedwithDA-KLHandhybridomacelstrainssecretingMcAbagainst
DAwerescreenedbycelfusion, andtheimmunologicaltitersofDA-McAbweredetermined.CaptureELISA
methodwasusedtodetermineisotypesofthemousemonoclonalantibodyandtheindirectELISAmethodwas
performedtodeterminethetitersofMcAbs.TheproteinGafinitychromatographyproteinpurificationmethod
wasusedtopurifyascites.Resultsshowedthat:twostrainsofhybridomas, 2B1and4C2, whichcouldsecret
McAbagainstDAsteadilyweresuccesfulypreparedandtheisotypeswereIgG1 andIgG2a.Thetiterof
purifiedMcAbwas1∶64 000 andtheproteinconcentrationofpurifiedasciteswere1.27 and0.675 mg/mL
respectively.Itcouldbedemonstratedthatthesuccessfulestablishmentofhybridomacelstrainssecreting
McAbagainstDAsupplyafirmfoundationfordevelopingagoldimmunochromatographyassaythatcandetect
DAasquickly, economicalyandsimplelyaspossibleinfutureresearch.
DOI :10.13233/j.cnki .mar.fi sh.2010.03.002
海　洋　渔　业 2010年
Keywords:Domicacid;Monoclonalantibody;Hybridomacelstrains
　　软骨藻酸(Domicacid, DA)是由海洋硅藻产生的一种兴奋性神经毒性氨基酸 ,是记忆缺失性贝毒
(ASP)的主要成分 ,海洋贝类通过食物链的传递作用可在体内累积 DA,人类食用被 DA污染的鱼 、贝而
中毒 ,多数在食后 3 ～ 6 h发病 ,中毒症状包括恶心 、呕吐 、腹痛 、腹泻等 ,同时有昏眩 、昏迷等类似神经性
中毒症状 ,永久性丧失部分记忆是此类中毒后的典型特征 ,严重者可造成死亡[ 1-3] 。目前 ,软骨藻酸的
检测分析方法主要有生物小鼠法 、高效液相色谱法(HPLC)以及一些免疫方法 [ 4] 。其中生物小鼠法简
便易行 ,适合于大规模 、批量样品的检测 ,但是不能区别毒素的种类和结构 、干扰大 、不精确 [ 5] ;现在应
用广泛 、方法完善的高效液相色谱法(HPLC)可以准确给出毒素的含量和种类 ,检测限可低至 ng/g级 ,
缺点是样品前处理繁琐 ,仪器昂贵 ,且需要专门的分析技术人员 [ 6-7] 。故建立一种简便 、快速准确的检
测方法已是当务之急 。近年来得到高度关注和快速发展的免疫化学方法是利用抗体对抗原的特异性结
合建立的分析方法 ,具有灵敏度高 、特异性强 、仪器设备简单 、样品前处理相对简单等优点 ,适于大量样
品的筛查和基层推广 [ 8-9] 。ELISA酶联免疫法和胶体金免疫层析法都是在此基础上发展起来的新技
术 [ 10-15] 。目前 ,国外有关软骨藻酸的 ELISA检测方法已有大量报道 ,并开发出 ELISA试剂盒 [ 12 -13] ;我
国在 DA的免疫检测方面的研究较为稀少[ 14-15] ,而且有关应用胶体金免疫层析技术快速检测 DA的研
究尚未见报道。
本文利用自制完全免疫抗原 DA-KLH免疫 BALB/c小鼠 ,利用杂交瘤细胞融合技术筛选出两株能
稳定 、高效分泌抗 DA单克隆抗体的杂交瘤细胞株 ,制备出效价为 64 000的单克隆抗体 ,为进一步开发
快速检测软骨藻酸的胶体金免疫层析试纸条打下良好的基础 。
1　材料与方法
1.1　仪器与试剂
软骨藻酸(Domicacid, DA)、匙孔血蓝蛋白(KLH)、牛血清蛋白(BSA)、弗式完全佐剂(FCA)、弗式
不完全佐剂(FIA)、水溶性碳化二亚胺(EDC)均购自 Sigma公司;N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、Tween-20
购自上海生工生物技术服务有限公司;辣根过氧化物酶标记羊抗鼠 IgG购自北京博奥森生物技术有限
公司。酶标仪 (MuLtiskanMk3),紫外可见分光光度计(UNICO-UV-2102), 高速冷冻离心机 (Sigma
3K30)。
1.2　方法
1.2.1　人工抗原的合成
参照文献 [ 15-16] ,采用活泼酯法 ,将 DA溶于少量二甲基亚砜中 ,加入 EDC和 NHS及少量磷酸
盐缓冲溶液(PBS, pH7.0), 25 ℃反应 2 h, 4 ℃冰箱过夜后 ,加入溶于 0.01 MPBS的匙孔血蓝蛋白
(KLH), 25 ℃反应 3 h。将反应混合物移入透析卡中用 PBS透析 3 d, 4 ℃,每 12 h换液 1次。最后将透
析的 DA-KLH溶液分成两部分 ,一部分于 4 ℃下保存 ,供紫外测试用;另一部分于 -20 ℃下保存 ,供免
疫小鼠用。包被抗原 DA-BSA的合成方法相同。紫外扫描光谱进行鉴定 ,并根据杨利国等 [ 17]用分光光
度法测定偶联物 2种分子浓度的方法计算 DA-KLH和 DA-BSA的偶联比。
1.2.2　免疫小鼠
以 DA-KLH为免疫原 ,免疫 5只 6 ～ 8周龄的雌性 BALB/c小鼠。首次免疫用 200 uLDA-KLH与等
体积完全弗式佐剂乳化 ,腹腔注射小鼠 ,第 2、4、6周取同量 DA-KLH与等体积不完全弗式佐剂充分乳
化 ,腹腔注射 。取尾血测定小鼠血清效价 ,待效价大于要求值后 ,取同量 DA-KLH的 PBS溶液腹腔注射
加强免疫 , 3 d后杀死小鼠取血 ,离心取上层血清 ,分装 , -20 ℃保存备用。同时首次免疫前采血 ,制备
阴性血清做对照 , -20 ℃保存备用 。
1.2.3　抗血清效价的检测
间接酶联免疫吸附分析方法(ELISA)测定血清效价 。 (1)包被:用 DA-BSA偶联物作为包被抗原 ,
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第 3期 高利利等:抗软骨藻酸单克隆抗体杂交瘤细胞株的构建
用碳酸盐缓冲液(pH9.6)稀释 ,包被 96孔酶标板 ,每孔 100 uL, 4 ℃过夜;(2)封闭:弃去残液 ,用 PBS-T
洗涤缓冲液(pH7.4)洗涤三次酶标板 ,用 5%的 PBS溶解的脱脂奶粉封闭 ,每孔加入 200 uL的封闭液 ,
37 ℃孵育 2 h后弃去封闭液 , 4 ℃保存备用;(3)一抗孵育:加入上清原液 , 37 ℃下孵育 1 h,弃去全部上
清并用纯水清洗 3次;(4)二抗孵育:将酶标羊抗鼠二抗用封闭液稀释至 1∶3 000,每孔加入 100 uL二抗
稀释液 , 37 ℃孵育 1 h,后用纯水清洗 3次 ,并拍干;(5)显色:加入发光底物 5 ～ 10 min后用 2 MH2SO4
终止 ,用酶标仪 450 nm波长处测定各孔 OD值 ,以 P/N值≥2.1时的血清最高稀释倍数作为抗血清
ELISA效价。其中:P/N值 =(待测孔 OD值 -空白孔 OD值)/(阴性对照孔 OD值 -空白孔 OD值)。
1.2.4　细胞的融合与选择培养
选择 1只血清效价最高的免疫小鼠 ,取其脾细胞与生长状态良好的小鼠骨髓瘤 SP2 /0细胞进行细
胞融合 。融合后的杂交瘤细胞接种于 96孔培养板中 ,在 20%血清的 HAT培养基中选择培养 , 10 d后换
液 ,并加入新鲜培养液继续培养 2 d, ELISA检测细胞培养液上清。
1.2.5　杂交瘤细胞的筛选与克隆
以 DA-BSA为检测抗原 ,用 ELISA测定培养上清中抗 DA的抗体 ,将抗阳性细胞孔的杂交瘤细胞按
照有限稀释法进行克隆 ,亚克隆 ,直到所有细胞孔的上清均为阳性为止 。
1.2.6　腹水单抗的制备及纯化
用 0.8 mL/只剂量的灭菌石蜡油腹腔注射致敏 8周龄的雌性 BALB/c小鼠 , 1周后注射杂交瘤细
胞 。视小鼠腹部膨大情况于 14 d后收集腹水 。腹水的纯化采用 ProteinG柱亲和层析纯化 ,间接 ELISA
方法测定纯化后的腹水单克隆抗体效价。
1.2.7　单克隆抗体鉴定
使用 Sigma单抗亚型鉴定试剂盒 ,按使用说明书(间接 ELISA法)对小鼠进行单克隆抗体的免疫球
蛋白类型及亚型鉴定 。Bradford法测定蛋白质含量。
2　结果与分析
2.1　完全抗原的合成与鉴定
DA分子量是 311.1,是典型的小分子半抗原 ,自身无免疫原性 ,需要通过与大分子蛋白质交联才能
成为具有免疫原性的人工抗原 [ 14] 。紫外扫描分析图谱(图 1)显示 ,载体蛋白 KLH和 BSA在 280 nm波
长处有强吸收 , DA半抗原在该波长处吸收较弱 ,最大吸收位置与载体蛋白不重叠。而合成的偶联物的
紫外光谱扫描的特征谱线与 DA、KLH和 BSA的谱线的峰型及最大吸收峰有较大的区别 ,可初步判断完
全免疫抗原 DA-KLH与包被抗原 DA-BSA均合成成功。经计算 , DA与 KLH及 BSA偶联结合的摩尔比
分别为 25∶1和 16∶1。
图 1　完全免疫抗原 DA-KLH(a)和包被抗原 DA-BSA(b)的紫外光谱扫描图
Fig.1　UVabsorptionofcompletedantigen(DA-KLH)(a)andcoatingantigen(DA-BSA)(b)
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2.2　免疫小鼠血清效价
小鼠免疫 4次 , 8周之后 ,间接 ELISA方法测定血清效价结果如表 1,根据 P/N值≥2.1的标准 ,可
判断 1号 、2号和 3号小鼠的血清效价为 1∶16 000, 4号和 5号小鼠的效价达到 1∶64 000。在整个单克
隆抗体制备过程中 ,抗原免疫后效价的高低对融合后的阳性率及最终单抗的效价有着直接的影响 ,一般
认为当血清中的效价高于 1∶4 000时 ,克隆后的细胞上清液才能得到相对稳定的阳性效价 [ 15] ,可见本
实验中血清效价明显高于 1∶4 000,说明获得了较好的免疫效果 ,有利于细胞融合和单克隆抗体的制备。
5只小鼠中 5号小鼠的 OD值最高 ,为 0.374,免疫效果最好 ,因此采用该小鼠进行下一步实验。
表 1　免疫小鼠血清效价测定结果
Tab.1　Titersofpolyclonalserum
分组
Group
抗血清稀释倍数 Dilutionofantiserum
1∶1 000 1∶4 000 1∶16 000 1∶64 000
阴性对照
Negativecontrol
空白
Blank
Mouse1 1.786P/N:17.1
0.979
P/N:8.8
0.552
P/N:4.4
0.271
P/N:1.5 0.225 0.128
Mouse2 1.538P/N:10.2
1.041
P/N:6.6
0.564
P/N:3.3
0.264
P/N:1.1 0.246 0.105
Mouse3 1.692P/N:11.1
0.971
P/N:6.0
0.502
P/N:2.7
0.286
P/N:1.2 0.258 0.116
Mouse4 1.672P/N:21.1
1.1
P/N:13.2
0.677
P/N:7.4
0.291
P/N:2.1 0.208 0.135
Mouse5 1.236P/N:12.0
0.875
P/N:8.2
0.577
P/N:5.0
0.374
P/N:2.8 0.209 0.116
2.3　细胞融合与杂交瘤细胞的筛选
选取效价最高的 5号免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合 ,细胞融合 12 d后观察细胞生长状
况 ,融合率达 80%,其中阳性细胞克隆孔 161孔 ,克隆阳性率为 42%。本实验共筛选出 5株阳性杂交瘤
细胞 ,采用有限稀释法连续进行了两次细胞克隆和筛选 , 2次克隆后 ,有 2株细胞的阳性率已经达到
100%,对其进行细胞株扩大培养并 -80 ℃冻存 ,最后得到 2株稳定分泌抗软骨藻酸的杂交瘤细胞株 ,
分别命名为 2B1和 4C2。
表 2　杂交瘤细胞融合情况及筛选情况
Tab.2　Resultsofcellfusionandscreening
融合次数
Fusiontimes
免疫原
Immunogen
包被原
Coatingantigen
融合情况
Fusion
融合率
Fusionrate
阳性率
Positiverate
克隆(阳性率)
Clone(Positiverate)
1次克隆
Firstclone
2次克隆
Secondclone
阳性杂交
瘤细胞株
Positivehybridoma
celstrains
1 DA-KLH DA-BSA 384 /480 80% 160 /384 42% 51/80 63.75%
40/79 50.63%
96/96 100%
96/96 100%
2B1
4C2
注:克隆阳性率为阳性孔数 /克隆孔数
Note:Cloningpositiverate=Positiveholenumber/Cloningholenumber
2.4　单克隆抗体免疫球蛋白类及亚类的鉴定
对比不同亚类的显色结果 ,以 OD值明显高于其它孔者判定为该细胞株分泌的单抗所属亚类 ,结果
见表 3。从表 3中可以看出 ,细胞株 2B1和 4C2分泌的单抗亚类分别为 IgG1、IgG2a。单抗亚型是单抗
品质评价的一个必备指标 ,单克隆抗体是采用小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合 ,建立杂交瘤细胞株的
方法制备的 ,因此所制备的单抗属于鼠源性单抗。鼠源单抗亚型包括 6种(IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3,
IgM, IgA),其中最适合建立免疫学检测方法的亚型为 IgG类 ,所以鉴定单抗的亚型可以为其应用提供依
据 [ 18] 。该研究中的 2株杂交瘤细胞株 ,其单抗亚型均为 IgG类 ,适用于在其基础上进行胶体金免疫层
析检测 DA的研究。
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表 3　单克隆抗体亚型鉴定
Tab.3　Thesubtypeofmonoclonalantibodies
细胞株
Celstrain
单抗亚型 IsotypeofMcAb
IgG1 IgG2a IgG2b IgG3 IgM IgA
2B1 1.872 0.102 0.078 0.087 0.08 0.094
4C2 0.113 1.903 0.302 0.122 0.108 0.156
2.5　单克隆抗体效价测定
如表 4所示 ,采用间接 ELISA测得杂交瘤细胞株 2B1和 4C2的纯化腹水效价为 1∶64 000,其中细
胞株 4C2的 OD值较高 ,所以选择 4C2扩大培养大量制备 DA单克隆抗体 ,用于后续胶体金免疫试纸条
检测 DA方面的研究 。Bradford法检测纯化后的腹水蛋白含量分别为 1.27和 0.675 mg/mL。
表 4　腹水单抗效价及浓度测定结果
Tab.4　ELISAtitersandproteinconcentrationsofpurifiedascites
细胞株
Celstrain
空白
Blank
阴性对照
NegativeControl
稀释度 Dilution
1∶1 000 1∶4 000 1∶16 000 1∶64 000
浓度(mg/mL)
Concentration
2B1 0.089 0.136 2.1P/N:42.3
1.373
P/N:27.3
0.482
P/N:8.4
0.245
P/N:3.3 1.27
4C2 0.104 0.145 1.92P/N:44.3
1.62
P/N:37.0
0.845
P/N:18.1
0.336
P/N:5.7 0.675
3　结语
小分子化合物合成的全抗原一般要求小分子与载体蛋白的最适偶联率在 1∶10 ～ 1∶25之间 ,可有效
刺激机体产生免疫应答[ 19] 。本研究中制备的免疫原偶联率为 25∶1,以此抗原免疫小鼠 ,小鼠获得了良
好的免疫效果。
蛋白质是一种大分子 ,结构复杂 ,具有胶质特征 ,是一种良好的半抗原载体。常见的蛋白质载体有
人血清蛋白(HSA)、牛血清蛋白(BSA)、匙孔血蓝蛋白(KLH)、卵清蛋白(OVA)等 。其中 KLH蛋白不
但具有良好的免疫原性 ,而且所产生的抗 KLH抗体与抗 DA抗体没有交叉反应 。半抗原与蛋白质偶联
的方法常见的有碳二亚胺法 、戊二醛法 、重氮化法和活泼酯法等。从 DA的结构式 [ 15]来看 , DA分子上
携带三个游离羧基 ,因此采用活泼酯法[ 16]对 DA进行载体蛋白偶联 ,成功合成完全免疫抗原 DA-KLH
和包被抗原 DA-BSA, DA-KLH作为免疫抗原免疫小鼠 4次之后 ,抗血清效价就达到了 64 000,相比文
献 [ 15]报道的效价较高 ,更加有利于细胞融合和单克隆抗体的制备。
本研究利用杂交瘤细胞融合技术成功制备 2株能稳定分泌抗软骨藻酸单克隆抗体的杂交瘤细胞
株 ,抗体亚类分别为 IgG1和 IgG2a。体内诱生腹水并纯化后 ,获得效价为 1∶64 000的单克隆抗体 ,为软
骨藻酸快速检测 ELISA试剂盒和胶体金免疫层析试纸条的开发奠定了基础。
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