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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第3期
藻 胆 蛋 白（phycobiliproteins，PBP） 包 括 藻 红
蛋白（phycoerythrin，PE）、藻蓝蛋白（phycocyanin，
PC） 和 变 藻 蓝 蛋 白（allo-phycocyanin，APC） 等，
是部分藻类的天然色素，水溶性好，颜色鲜艳，且
具荧光特性［1］。70 多年来的研究表明，藻胆蛋白用
收稿日期 ：2012-09-23
基金项目 ：国家科技支撑计划课题（2012BAC07B03），上海市教委重点学科项目（S30701）
作者简介 ：郭子叶，女，硕士研究生，研究方向 ：海藻生物活性物质 ；E-mail ：luckyguoziye@gmail.com
通讯作者 ：何培民，男，教授，博士生导师，研究方向 ：海洋生物技术 ；E-mail ：pmhe@shou.edu.cn
条斑紫菜高纯度藻红蛋白规模制备及光学性质研究
郭子叶1  蔡春尔1，2  李春霞1  耿中雷1  贾睿1，2  何培民1，2
（1. 上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306 ；2. 上海海洋大学海洋科学研究院，上海 201306）
摘 要 ： 旨在大量制备条斑紫菜高纯度藻红蛋白并研究其光学性质。以江苏吕泗条斑紫菜为原料，采用“溶胀 + 组织捣碎”
法破碎 2 kg 冻干条斑紫菜叶状体细胞，经多次硫酸铵盐析和一次羟基磷灰石层析后获得纯度＞ 3.20 的藻红蛋白的产率为 0.184%，
再经一次同样层析可获得纯度＞ 4.50 的藻红蛋白的产率为 0.109%。蛋白纯度已通过吸收 / 荧光激发光谱，十二烷基硫酸钠 - 聚丙
烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）/ 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native-PAGE）的考马斯亮蓝 / 醋酸锌双染验证。该蛋白摩尔消光系
数经 Folin-酚法和 Bradford 法测定分别为 1.79 mL/（mg·cm）和 1.73 mL/（mg·cm），20℃时在 505 nm 处的荧光量子产率为 0.90，
在日光灯、发光二极管、碘钨灯和激光 4 种光源下的光漂白效果以激光最显著，240 μg/mL 藻红蛋白 10 min 可接近碘钨灯辐照 240
min 的光漂白率。
关键词 ： 条斑紫菜 藻红蛋白 纯化 摩尔消光系数 荧光量子产率 光漂白
Pilot Preparation and Optical Properties of Highly Purified
Phycoerythrin from Porphyra yezoensis
Guo Ziye1 Cai Chuner1，2 Li Chunxia1 Geng Zhonglei1 Jia Rui1，2 He Peimin1，2
（1. College of Fisheries and Life Science，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306 ；2. Institute of Marine Science，Shanghai Ocean
University，Shanghai 201306）
Abstract:  Pilot preparation were tried to obtain highly purified phycoerythrin（PE）in abundance from P. yezoensis in Lvsi city,
Jiangsu Province and to study its optical properties. 2 kg freeze-dried P. yezoensis thallus was broken using “swelling & smash” method. Further
purification was performed by means of ammonium sulphate co-precipitation（ASCP）and hydroxyapatite（HA）column chromatogram and
the purity of PE achieved 1.67（A565/A280）, corresponding to yield of 0.184%, The purity of PE could be improved beyond 4.5 with a yield
of 0.109% if HAP chromatography repeated. PE was validated by absorption/fluorescence spectra and SDS-PAGE/Native-PAGE stained with
coomassie brilliant blue/zinc acetate for its purity. Molar extinction coefficient（MEC）of PE were 1.79mL/（mg·cm）and 1.73 mL/（mg·cm）
determined by folin-phenol method and Bradford method, respectively. Fluorescence quantum yield of PE was 0.90 at 505 nm wavelength at
20℃ . The PE effect of photo bleaching was the most significant under irradiating of laser among daylight lamp, light emitting diode（LED）,
iodine-tungsten lamp and laser. For example, the photo bleaching rate of 240 μg/mL PE after 10 minutes’ irradiating under laser was close to the
value using iodine-tungsten lamp of 240 minutes’ irradiating.
Key words:  Porphyra yezoensis Phycoerythrin Purification Molar extinction coefficient Fluorescence quantum yield Photobleaching
途极为广泛，可作为天然色素添加于食品、化妆品、
保健品、药品、纺织品、洗涤剂，甚至喷泉中［2，3］，
最广泛的用途是制成荧光标记探针［4］，目前主要在
Cyanotech Corporation、Martek Bioscience、PROzyme
Inc. 等大公司出售，价格高昂［5］。
2013年第3期 193郭子叶等 ：条斑紫菜高纯度藻红蛋白规模制备及光学性质研究
半个多世纪来，人们试验了各种藻胆蛋白制备
方法，如 Padgett 等［6］采用 Diethylaminoethyl（DEAE）
Cellulose 琼脂糖凝胶层析纯化 550 g Microcystis aeru-
ginosa 得 到 33 g 纯 度 3.4 的 PC 和 2.3 g 纯 度 4.0 的
APC，王广策等［8］采用疏水层析纯化 700 g Gracilaria
verrucosa 得 到 98 mg 纯 度 4.4 的 PE［7］， 纯 化 550 g
Palmaria palmata 得到 67 mg 纯度 3.5 的 PE，Niu 等［9］
纯化 15 g Porphyra haitanensis 叶状体得到 23 mg 纯度
4.8 的 PE。此外，还有一些蛋白小量快速制备用于
检测的简单方法［10-12］。藻胆蛋白常规提纯方法的使
用效果因原料不同而各有差异［13］，如以中国最主要
的栽培藻类之一条斑紫菜为对象规模纯化藻红蛋白
时，上述方法似乎不大理想［14］。
藻胆蛋白作为荧光蛋白，摩尔消光系数表征其
吸光能力，荧光量子产率表征其荧光发射能力，光
漂白时间表征其光耐受能力，这些都是蛋白荧光标
记和光动力学应用中的重要参数。目前已报道摩尔
消光系数的藻胆蛋白有坛紫菜藻胆蛋白［15］，多管藻
藻红蛋白，钝顶螺旋藻藻蓝蛋白，倒卵圆形隐丝藻
藻红蛋白，集孢藻藻蓝蛋白［16］，已报道荧光量子产
率的有螺旋藻藻胆蛋白［17］，已报道光漂白效果的有
多管藻藻红蛋白［18］。
目前虽然海洋经济在中国国民经济中的地位不
断上升，但海边的渔民生活却存在不少问题，鱼塘
养殖面积逐步减少，水产加工及流通发展滞后，养
殖成本不断提高，渔业资源日趋衰竭，传统捕捞渔
民无地可耕，渔民由于年龄、素质等原因转产转业
十分困难，使得渔民生活水平难以提高。本试验探
索从条斑紫菜中规模制备高纯度藻红蛋白，旨在今
后大规模制备藻红蛋白需要大量的紫菜原材料时，
为海边的紫菜养殖户开辟新的销售渠道。而条斑紫
菜养殖不但成本低、转型快、操作简单，而且生产
的藻红蛋白附加值高，有利于提高农民收入。另外，
条斑紫菜养殖不仅可为渔民带来效益，也为海区环
境治理提供了良方。我们于 2002-2004 年在中国江
苏吕泗海区做了养殖条斑紫菜治理海区富营养化的
试验［19］，发现紫菜养殖可使海水中 NH4-N、NO2-N、
NO3-N 和 PO4-P 的 含 量 降 低 50%-94%、42%-91%、
21%-38% 和 42%-67%。 在 2003-2004 年，300 hm2
条斑紫菜养殖海区年均从海水中去除 14 708.5 kg 氮
元素和 2 373.5 kg 磷元素，且栽培期间规模化文蛤
养殖未发生死亡现象。表明条斑紫菜栽培去富营养
化作用和生态修复功能十分明显。
本试验以 2 kg 条斑紫菜为原料，尝试规模制备
高纯度藻红蛋白的方法，并研究所得蛋白摩尔消光
系数，荧光量子产率及在多种光源下的光漂白时间。
1 材料与方法
1.1 材料
条斑紫菜叶状体采自江苏省吕泗紫菜栽培海区。
藻体用清洁海水洗净，阴干后密封置于 -20℃冰箱保
存备用。
4 L 捣碎机购自美国 Warning 公司，Supra 22k 高
速冷冻离心机购自 Hanil Science 公司，Ultrospec2000
紫 外 - 可 见 分 光 光 度 计 购 自 Pharmacia Biotech 公
司，EPS601 电泳仪购自 Amersham Biosciences 公司，
F-4500 荧光分光光度计购自 Hitachi 公司，伯乐 680
酶标仪购自美国 Biorad 公司。化学试剂购自国药集
团，均为分析纯。
1.2 方法
1.2.1 条斑紫菜捣碎与蛋白释放 称取 2 kg 条斑紫
菜，加 50 mmol/L 磷酸钠缓冲液（pH6.8，1 mmol/L
EDTA）10 L，完全浸没，4℃存放约 36 h。用捣碎
机打碎。捣碎液在 4℃下 10 000×g 离心 20 min，取
上清。
1.2.2 条斑紫菜藻红蛋白粗提 上清液在磁力搅
拌器搅拌下，加硫酸铵至 20% 饱和度，静止 8 h，
10 000×g 离心 20 min，取上清液。将上清液续加
硫酸铵至 50% 终饱和度，静止 8 h，10 000×g 离心
20 min，取沉淀，沉淀用适量 50 mmol/L 磷酸钠缓冲
液溶解。将两次盐析得到的粗提液忽略自身所带盐
分，加硫酸铵至 10% 饱和度，静止 8 h，10 000×g
离心 20 min，取上清液。将上清液续加硫酸铵至
40% 终 饱 和 度， 静 止 8 h，10 000×g 离 心 20 min，
取沉淀，沉淀用适量 50 mmol/L 缓冲液溶解，此即
为藻红蛋白粗提液，以上步骤均在 4℃下操作。
1.2.3 藻红蛋白层析纯化 按 Siegelman 方法制备
HA 并预平衡［20］。藻红蛋白粗提液用 Sephadex G-25
柱脱盐，脱盐液用羟基磷灰石柱层析，用磷酸盐缓
冲液（pH6.8）梯度洗脱，洗脱液测吸光值。将层析
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第3期194
所得藻红蛋白脱盐后再层析一次。
1.2.4 藻红蛋白纯度鉴定 层析所得藻红蛋白做光
谱和电泳鉴定。藻红蛋白吸收光谱纯度用 A565/A280
表示［1］。蛋白紫外吸收光谱每隔 1 nm 扫描一次，扫
描波长范围 250-700 nm，荧光光谱扫描 3D 图像，
每隔 5 nm 扫描一次，激发波长范围 400-600 nm，
发射波长范围 500-900 nm。电泳均做考马斯亮蓝和
醋酸锌双染，十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电
泳（SDS-PAGE）的分离胶和浓缩胶浓度分别为 14%
和 5%，非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native-PAGE）
的分离胶和浓缩胶浓度均为 5%。
1.2.5 藻红蛋白含量和产率计算 藻红蛋白含量计
算公式［15］：CPE ＝ 0.123A565 - 0.068A615 + 0.015A650
藻红蛋白产率计算公式：PE yield =（CPE after purification×
Volumeafter purification）/（CPE before purification × Volumebefore
purification）× 100 %
1.2.6 摩尔消光系数测定 配制浓度为 0、25、50、
100、200、300 和 400 μg/mL 的 牛 血 清 白 蛋 白， 用
Folin-酚法以 A750 吸收值为纵坐标做标准曲线，并
取纯度 >5.0 的藻红蛋白溶液（10 mmol/L 磷酸钠，
pH6.8）测定浓度，该溶液用紫外—可见分光光度计
测定 565 nm 的吸收值，用 Lambert-Beer 定律 A=CεL
反推出 565 nm 波长的摩尔消光系数。标准蛋白和样
品均做 6 个平行。
配 制 浓 度 为 0、25、50、100、200、300、400
和 500 μg/mL 的牛血清白蛋白，用 Bradford 法以 A595
吸收值为纵坐标做标准曲线，并取和上述同一纯度
的藻红蛋白溶液测定浓度，该溶液测定 565 nm 的吸
收值并反推出相应摩尔消光系数。标准蛋白和样品
均做 6 个平行。
1.2.7 荧光量子产率测定 以溶于无水乙醇的 5.0
μg/mL 罗丹明 B 为标准溶液，采用参比法测定藻红
蛋白荧光量子产率。移取罗丹明 B 溶液与纯度 >5.0
的藻红蛋白溶液（A505nm<0.05），在紫外 - 可见分光
光度计上测定其在 505 nm 处的吸光度。将上述溶液
置于荧光比色皿中，在分子荧光光谱仪上分别扫描
它们以 505 nm 为激发波长时的荧光发射光谱，读取
相应积分荧光强度。试验做 3 个平行样。用下述公
式计算藻红蛋白在 505 nm 的荧光量子产率 ：
Yp= Yr·Fp/Fr·Ar/Ap
Yp、Yr —藻红蛋白和罗丹明 B 的荧光量子产率；
Fp、Fr —为藻红蛋白和罗丹明 B 的积分荧光强
度 ；
Ap、Ar —为藻红蛋白和罗丹明 B 在 505 nm 的吸
光值
1.2.8 光漂白时间测定 96 孔板中加入纯度 >5.0
藻红蛋白，蛋白梯度设为 15、30、60、120 和 240
μg/mL， 每 孔 100 μL。 分 别 用 日 光 灯、 发 光 二 极
管、碘钨灯和激光进行照射，照射时间为 10、30、
60、120 和 240 min。另设藻红蛋白 60、120 和 240
μg/mL，每孔 100 μL，用激光进行照射，照射时间为
10、20 和 30 min。照射结束后用酶标仪检测溶液在
490 nm 吸收值，每孔均设 3 个平行。
2 结果
2.1 蛋白释放效果
经过细胞破碎，获得了 8 000 mL 溶液，其中
含 17 262 mg 纯度为 0.54（A564/A280）藻红蛋白。经
过 4 次硫酸铵盐析，溶液中藻红蛋白纯度不断提高，
40% 盐析后蛋白纯度达到 1.67（A564/A280），含量为
13 888 mg（表 1）。
表 1 硫酸铵盐析条斑紫菜藻红蛋白粗提液的效果
硫酸铵盐析浓度 A564/A280 体积（mL） PE 质量（mg） PE 产率（%）
经 20% 硫酸铵盐析后 0.60 7200 17052 0.853
经 50% 硫酸铵盐析后 1.31 3820 16187 0.809
经 10% 硫酸铵盐析后 1.38 3930 14660 0.733
经 40% 硫酸铵盐析后 1.67 1960 13888 0.694
2.2 蛋白层析效果
粗提液在纯化时只过一次羟基磷灰石柱即可获
得纯度＞ 4.0 的藻红蛋白 2 234 mg，再过一次该柱可
获得纯度＞ 4.5 的藻红蛋白 2 172 mg（表 2）。
2.3 蛋白纯度鉴定
已纯化的藻红蛋白通过吸收 / 荧光激发光谱验
2013年第3期 195郭子叶等 ：条斑紫菜高纯度藻红蛋白规模制备及光学性质研究
证（图 1）显示，纯化的藻红蛋白最大吸收峰为 565
nm，498 nm 处有一次峰，540 nm 处有一吸收肩，最
大荧光发射峰在 575 nm。已纯化的蛋白通过 SDS-
PAGE 和 Native-PAGE 的考马斯亮蓝 / 醋酸锌双染验
证。蛋白 α、β 亚基分子量在 14.4-20.1 kD 之间，γ
亚基在 31 kD 左右（图 2）。
表 2 条斑紫菜藻红蛋白通过羟基磷灰石层析的效果
A564/A280 体积（mL） 质量（mg） PE 产率（%）
第一次脱盐后 1.52 2520 9320 0.466
1.75 1280 3629 0.181
第一次层析 10 mmol/L 3.82 650 1433 0.072
10 mmol/L 4.19 630 2234 0.112
第二次脱盐 4.10 380 3610 0.181
第二次层析 10 mmol/L 5.08 50 1381 0.069
10 mmol/L 4.78 55 791 0.040
10 mmol/L 4.23 66 327 0.016
ab
so
rp
tio
n
0.200
0.100
0.000
300.0 500.0 600.0
600
500
400
450
550
500 600 700 800 900
0
10
20
EX
nm

⌒䮯nm EMnm400.0
A B
蛋白紫外吸收光谱每隔 1 nm 扫描一次，扫描波长范围 250-700 nm，荧光光谱扫描 3D 图像，每隔 5 nm 扫描一次，激发波长范围 400-600 nm，
发射波长范围 500-900 nm
图 1 条斑紫菜藻红蛋白的吸收光谱图（A）和荧光发射光谱图（B）
M 1 2
669
kD
440
232
140
66
M 1 2
97.4
kD
A B
66.2
43.0
31.0
20.1
14.4
M ：蛋白质 marker ；1，2 ：分别经考马斯亮蓝和醋酸锌染色的藻红蛋白样品
图 2 条斑紫菜藻红蛋白 SDS-PAGE（A）和 Native-
PAGE（B）电泳鉴定图谱
1.79 mL/（mg·cm）， 用 Bradford 法 测 定 值 为 1.73
mL/（mg·cm）（图 3），两者非常接近。
2.5 荧光量子产率测定
以罗丹明 B 溶液在 20℃时的量子产率 0.97 为
参照，条斑紫菜藻红蛋白 20℃时在 505 nm 处的荧
光量子产率为 0.90。
2.6 光漂白时间测定
随着光照时间的增加，PE 在日光灯、发光二极
管、碘钨灯和激光 4 种光源下的光漂白效果以激光
最显著，240 μg/mL PE 10 min 光漂白率可接近碘钨
灯辐照 240 min 的值，而 PE 浓度越高，同样时间被
漂白的蛋白绝对量越大，但即使经过 240 min 的辐照，
各种光源下蛋白在 490 nm 吸收值依然与自身浓度成
正比（图 4）。
2.4 摩尔消光系数测定
条斑紫菜藻红蛋白（10 mmol/L 磷酸钠，pH6.8）
在 565 nm 的摩尔消光系数用 Folin-酚法测定值为
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第3期196
BA
0 100 200 300 400 500
0
0.4
0.8
1.2
1.6
BSA concentration
A
bs
or
ba
nc
e
y = -0.0012x + 1.4124
R2=0.9942
y=0.0005x + 0.0824
0
0.1
0.2
0.3
0 100 200 300 400
BSA concentration
A
bs
or
ba
nc
e
R2=0.9942
取纯度 >5.0 的藻红蛋白溶液（10 mmol/L 磷酸钠，pH6.8）用紫外可见分光光度计测定 565 nm 的吸收值条斑紫菜藻红蛋白摩尔消光
系数经 Folin-酚法和 Bradford 法测定分别为 1.79 mL/（mg·cm）和 1.73 mL/（mg·cm）
图 3 Folin-酚法（A）和 Bradford 法（B）测藻红蛋白摩尔消光系数标准曲线图
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0 10
Time of irradiatingmin
A
49
0n
m
15 μg/mL 30 μg/mL
60 μg/mL 120 μg/mL
240 μg/mL
30 60 120 240
A
0
0.1
0.2
0.3
0.4
A
49
0n
m
15 μg/mL 30 μg/mL
60 μg/mL 120 μg/mL
240 μg/mL
0 10
Time of irradiatingmin
30 60 120 240
B
0
0.1
0.2
0.3
0.4
A
49
0n
m
15 μg/mL 30 μg/mL
60 μg/mL 120 μg/mL
240 μg/mL
0 10
Time of irradiatingmin
30 60 120 240
C
0
0.1
0.2
0.3
0.4
A
49
0n
m
60 μg/mL 120 μg/mL
240 μg/mL
0 10 20
Time of irradiatingmin
30
D
纯度 >5.0 的藻红蛋白溶液，分别用日光灯、发光二极管、碘钨灯和激光进行照射，蛋白梯度设为 15、30、60、120 和 240 μg/mL，
照射时间为 0、10、30、60、120 和 240 min。另设藻红蛋白 60、120 和 240 μg/mL，用激光进行照射，照射时间为 10、20 和 30
min。在 4 种光源下的藻红蛋白光漂白效果以激光最显著，240 μg/mL 藻红蛋白 10 min 光漂白率可接近碘钨灯辐照 240 min 的值。
图 4 条斑紫菜藻红蛋白在日光灯（A）、发光二极管（B）、碘钨灯（C）和激光下（D）的光漂白效果图
2013年第3期 197郭子叶等 ：条斑紫菜高纯度藻红蛋白规模制备及光学性质研究
3 讨论
3.1 关于条斑紫菜藻红蛋白规模纯化
前人对于藻红蛋白规模纯化有不少研究［6-9］，
以条斑紫菜为材料的最新方法是膨化柱法。Niu 等［14］
将 28 g 条 斑 紫 菜 破 碎 后， 上 清 用 phenyl-sepharose
疏 水 层 析， 得 到 0.096% 纯 度 2.00-2.50 的 PE， 再
用 DEAE-sepharose 柱最终获得 0.082% 纯度 4.50 的
PE。而本试验 2 kg 条斑紫菜在纯化时只过一次羟基
磷灰石柱即可获得 0.184% 纯度＞ 3.20 的藻红蛋白，
再过一次该柱可获得 0.109% 纯度＞ 4.50 的藻红蛋
白，省时省力。
对于本提取流程的机理，我们认为可从以下方
面解释 ：首先，盐析与疏水层析的原理相似，都是
蛋白质分子在高盐环境下构象改变，疏水基团发生
非共价聚合而与其他亲水分子分离，多次盐析效果
类似于多次疏水层析 ；其次，脱盐去除了过小的分
子，效果类似于凝胶过滤层析 ；再次，羟基磷灰石
具有独特的立体化学结构，目前已知其与蛋白质的
结合有 4 种作用机理 ：静电作用，共价复合物的生
成，排斥作用，以及电荷的几何分布［21］。这 4 点的
共同作用使得羟基磷灰石与其他介质相比有了明显
的选择性。最终使得条斑紫菜高纯度藻红蛋白的规
模制备过程较为简捷。
3.2 关于本提纯方法的经济效益
由于使用了廉价的经济海藻作为原料（条斑紫
菜市价 20 元 /kg），简单和低成本的粗提工艺（硫酸
铵市价 16 元 /kg），自制的羟基磷灰石层析填料，加
之较高的蛋白产率和纯度，使得本方法具有较高的
经济效益及规模可持续扩大的潜力。
4 结论
采用“溶胀 + 组织捣碎”法破碎 2 kg 冻干条
斑紫菜叶状体细胞，经多次硫酸铵盐析和一次羟基
磷灰石层析后获得纯度 >3.20 的藻红蛋白的产率为
0.184%，再经一次同样层析可获得纯度 >4.50 的藻
红蛋白的产率为 0.109% ；条斑紫菜藻红蛋白摩尔消
光系数经 Folin-酚法和 Bradford 法测定分别为 1.79
mL/（mg·cm）和 1.73 mL/（mg·cm）；20℃时，条
斑紫菜藻红蛋白在 505 nm 处的荧光量子产率为 0.90；
在日光灯、发光二极管、碘钨灯和激光 4 种光源下
的藻红蛋白光漂白效果以激光最显著，240 μg/mL 藻
红蛋白 10 min 光漂白率可接近碘钨灯辐照 240 min
的光漂白率。
参 考 文 献
［1］ Lu N, Liu XL, Chen XY, et al. One-step chromatography method
for efficient separation and purification of R-phycoerythrin from
Polysiphonia urceolata ［J］. J Biotechnol, 2005, 116（1）：91-100.
［2］ Santiago-Santos MaC, Ponce-Noyola T, Olvera-RamIrez R, et al.
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［3］ Dufosséa L, Galaupa P, Yaronb A, et al. Microorganisms and
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an industrial reality? ［J］. Trends Food Sci Tech, 2005, 16（9）：
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（责任编辑 马鑫）