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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(7):161-168
收稿日期 ： 2014-10-24
基金项目 ：国家自然科学基金项目（31201699），中央级公益性科研院所基本科研业务费专项（2014JB03）
作者简介 ：翟颀，男，硕士研究生，研究方向 ：寄生虫分子生物学 ；E-mail ：zhaixiaoqi@126.com
通讯作者 ：韩红玉，女，副研究员，研究方向 ：寄生虫分子生物学 ；E-mail ：hhysh@shvri.ac.cn
柔嫩艾美耳球虫保守蛋白 CHP559 基因克隆与
真核表达
翟颀  黄兵  董辉  赵其平  朱顺海  梁思婷  李莎  杨斯涵  韩红玉
（中国农业科学院上海兽医研究所 农业部动物寄生虫学重点实验室，上海 200241）
摘 要 ： 为构建柔嫩艾美耳球虫保守蛋白 EtCHP559 基因的真核表达重组质粒 pcDNA3.1-flag-EtCHP559，并转染 DF-1 细胞
进行表达。利用 5 RACE 技术克隆获得了柔嫩艾美耳球虫 EtCHP559 基因全长 cDNA 序列，该基因全长为 1 746 bp，ORF 为 104-
1 327 bp，编码 407 个氨基酸，编码蛋白的分子量约为 46 kD，并利用生物信息学分析该基因编码蛋白的性质、结构等特征，发现
该蛋白含有跨膜结构和信号肽。通过 RT-PCR 扩增得到含完整开放阅读框的基因片段，并将其与真核表达载体 pcDNA3.1-flag 连
接，构建了真核重组表达质粒 pcDNA3.1-flag-EtCHP559，所构建的真核重组表达质粒 pcDNA3.1-flag-EtCHP559 经过 PCR 和双酶切
鉴定，可见一条大小约为 1 224 bp 的目的条带 ；重组质粒转染 DF-1 细胞后，免疫印迹检测可见大小约为 47 kD 的目的蛋白条带，
间接免疫荧光实验显示在 DF-1 细胞中检测到绿色荧光。这些研究结果表明已成功获得了 EtCHP559 的全长序列，并成功构建了
EtCHP559 的真核重组表达质粒，在真核细胞 DF-1 中获得表达，为深入研究 EtCHP559 的功能奠定了基础。
关键词 ： 柔嫩艾美耳球虫 ；CHP559 基因 ；DF-1 细胞 ；真核表达
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.07.024
Gene Cloning and Eukaryotic Expression of a Conserved Hypothetical
Protein Gene CHP559 in Eimeria tenella
Zhai Qi Huang Bing Dong Hui Zhao Qiping Zhu Shunhai Liang Siting Li Sha Yang Sihan Han Hongyu
（Key Laboratory of Animal Parasitology of Ministry of Agriculture，Shanghai Veterinary Research Institute of Chinese Academy of Agricultural
Sciences，Shanghai 200241）
Abstract: The objective of this study is to construct eukaryotic recombinant expression plasmids of a conserved hypothetical protein gene
（EtCHP559）of Eimeria tenella, and study the expression of EtCHP559 gene in transfected DF-1 cells. The full-length cDNA of EtCHP559
was cloned using 5RACE approaches. Bioinformatics analysis revealed that the gene contained 1 746 bp, of which the ORF was 1 224 bp
（position 104 - 1 327 bp）encoding 407 amino acids with molecular weight of 46 kD. The deduced amino acid sequence of the protein had
a transmembrane region and signal peptide. The cDNA fragment consisting of complete ORF was amplified by RT-PCR, and ligated to the
eukaryotic expression vector pcDNA3. 1-flag. The recombinant plasmid pcDNA3. 1-flag-EtCHP559 was identified successfully by PCR and
restriction enzyme digestion, and the target band of approximate 1 224 bp was observed. Subsequently, the recombinant plasmid was transfected
into DF-1 cells, Western blot recognized target protein of around 47 kD, and immunofluorescence also showed that green fluorescence in
transfected DF-1 cells was observed. These results indicated that the full-length sequence of EtCHP559 was obtained, and the recombinant
plasmid of EtCHP559 was successfully constructed and expressed in eukaryotic cells, which laid a foundation for the future research on functions
of EtCHP559.
Key words: Eimeria tenella ；CHP559 gene ；DF-1 cell ；eukaryotic expression
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.7162
鸡球虫病在世界范围内严重影响养鸡业健康发
展，给养鸡业造成巨大的经济损失，该病主要是由
几种艾美耳球虫寄生于鸡肠道引起。而在几种艾美
耳球虫中，柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）是分
布最广、致病力最强的球虫之一，常作为研究鸡球
虫病的一种模式物种［1］。柔嫩艾美耳球虫寄生在绒
毛上皮和盲肠的黏膜下，引起出血性肠炎，可导致
鸡死亡，尤其对雏鸡危害最大。鸡球虫属于顶复器
门原虫，顶复器原虫多数是专性细胞内寄生虫，都
需要入侵宿主细胞，在宿主细胞内生长、发育、繁
殖完成整个生活史，其共有的特征是具有由几种专
门分泌蛋白的细胞器构成的顶端复合体，这些细胞
器包括微线体、棒状体和致密颗粒，这些特殊细胞
器分泌的蛋白参与了虫体入侵宿主细胞。在虫体入
侵宿主细胞这一过程中，虫体黏附宿主细胞后，在
虫体顶端和宿主细胞膜表面形成一个紧密的运动接
触环（Moving Junction，MJ）［2］。对弓形虫、疟原虫
等顶复器门原虫的研究表明，该结构对虫体成功入
侵宿主细胞起至关重要的作用［3］。
研究发现由微线分泌的顶体膜抗原 1（Apical
membrance protein-1，AMA1） 是 组 成 MJ 的 关 键 分
子，该分子与棒状体分泌的蛋白形成的复合体是 MJ
的主要成分［4］。由于 MJ 在顶复器原虫入侵宿主细
胞过程中发挥重要作用，因此与顶膜抗原 1 相互作
用的分子可能参与形成 MJ，在虫体入侵宿主细胞
过程中也是必不可少的。为了弄清楚柔嫩艾美耳球
虫 AMA1 的相互作用分子以及在虫体入侵过程中发
挥的作用，本实验室前期利用酵母双杂交技术，以
柔嫩艾美耳球虫顶体膜抗原 1（EtAMA1）为诱饵，
筛选了柔嫩艾美耳球虫子孢子酵母双杂交 cDNA 文
库，获得一些潜在的与 EtAMA1 相互作用蛋白的
ESTs 序列［5］。本研究选取其中编号为 559 的 EST
序列，运用 RACE 技术扩增获得该基因含完整开放
阅 读 框（ORF） 的 全 长 cDNA 序 列。Blast 分 析 发
现该基因编码的蛋白是柔嫩艾美耳球虫的保守蛋白
（conserved hypothetical protein），因此将该基因命名
为 EtCHP559。利用 RT-PCR 扩增其 ORF 区，构建
该基因的真核表达重组质粒，并在真核细胞鸡胚成
纤维细胞 DF-1 中进行表达，旨在为进一步研究该基
因的功能奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 虫株 柔嫩艾美耳球虫纯种（CAAS211116-
11），由中国农业科学院上海兽医研究所动物寄生虫
病研究室保存提供。
1.1.2 菌种、细胞和载体 大肠杆菌 TOP10 购自上
海天根生物技术有限公司，真核细胞 DF-1 由本所丁
铲老师馈赠，pGEM-T-easy vector 购自美国 Promega
公司，真核表达载体 pcDNA3.1-flag，由复旦大学上
海医学院崔晓娴博士馈赠。
1.1.3 主要试剂 DL2000（DNA Maker）、DNA 胶回
收试剂盒、质粒提取试剂盒、2*Taq PCR MasterMix，
购自上海天根生物技术有限公司。Trizol、限制性
内切酶 BamH Ⅰ和 Xho Ⅰ，购自大连宝生物工程
有限公司。T4 DNA 连接酶、购自美国 Promega 公
司。GeneRacerTM Kit、Lipofectamine 2000， 购 自 美
国 Invitrogen 公 司。 胎 牛 血 清、DMEM、opti-MEM，
购自美国 Gibco 公司。近红外荧光羊抗兔二抗，购
自 LI-COR 公司。RIPA 裂解液购自上海碧云天生物
技术有限公司。绿色荧光标记山羊抗兔二抗，购自
Jackson Immuno Research 公司。
1.2 方法
1.2.1 总 RNA 的提取 以纯化的柔嫩艾美耳球虫子
孢子为材料按 Trizol 说明书操作，提取子孢子阶段
虫体的 Total RNA，经电泳和紫外分光光度计检测其
浓度和纯度，符合要求后用于 RACE 模板的制备。
1.2.2 引物设计与合成
1.2.2.1 RACE 引物 根据编号为 559 的 EST 序列，
该序列含有 3 端 poly（A）尾，利用 Primer Premier 5.00
软件设计 5 端的引物，RACE 引物如下，5 Primer ：
5-ACCTTCGACCGCTGCCGCTCGTGTTCCT-3 ；5Nest
Primer ：5-CCGCTGCCGCTCGTGTTCCTTTTCCC
AT-3。所有引物均由上海赛百盛生物有限公司合成。
1.2.2.2 全长 cDNA 扩增的引物 将获得的 5-RACE
扩增产物纯化回收后与 pGEM-Teasy 载体连接，转
化 TOP10 感受态细胞，进行蓝白斑筛选，对 PCR
鉴定的阳性菌落进行测序，利用 DNAstar 软件查找
5-RACE PCR 扩增产物的序列与原 EST 序列的重
叠部分，将 2 段序列拼接为全长 cDNA 序列，根据
2015,31(7) 163翟颀等 ：柔嫩艾美耳球虫保守蛋白 CHP559 基因克隆与真核表达
拼接的全长 cDNA 序列，设计上下游引物进行 RT-
PCR 扩增含完整 ORF 的 cDNA 片段，在上下游引物
引入酶切位点 BamH Ⅰ和 Xho Ⅰ，上游引物序列为
5-GGATCCATGCGATCCTCGCAGCGTCGGCGCC-3，
下游引物序列为 5-CTCGAGTCGGCTTCATCTCCCGG
CCCTTAC-3。
1.2.3 EtCHP559 基因的克隆与测序
1.2.3.1 EtCHP559 全长基因 5 端的扩增与测序 首
先利用 GeneRaceTMKit 对提取的柔嫩艾美耳球虫子孢
子总 RNA 依次进行去磷酸化反应、去 mRNA 帽结构、
连接 RNA Oligo、反转录，然后进行 cDNA 的 5 端
扩增。PCR 扩增体系含模板 1 μL，上游引物 1.5 μL，
下游引物 1 μL，总体积为 25 μL，反应条件 ：94℃ 2
min ；94℃ 30 s，72℃ 1 min，5 个循环 ；94℃ 30 s，
70℃ 1 min，5 个循环 ；94℃ 30 s，64℃ 30 s，72℃
1 min，25 个循环 ；72℃ 10 min。反应结束后，取
10 μL 进行 1% 琼脂糖凝胶电泳分析，若有特异性条
带，则回收 ；若无特异性条带，则继续进行 Nested
PCR， 反 应 条 件 ：94℃ 2 min ；94℃ 30 s，66℃ 30
s，72℃ 2 min，25 个循环 ；72℃ 10 min。反应结束
后取 10 μL 进行 1% 琼脂糖凝胶电泳分析，回收特
异性条带与 pGEM-T-easy vector 连接，连接产物转化
TOP10 感受态细胞，进行蓝白斑筛选，挑选白斑菌
落过夜培养后，进行 PCR 鉴定。经鉴定分子量大小
与预期一致的阳性菌落，送上海桑尼生物技术有限
公司进行测序。
1.2.3.2 EtCHP559 基因含完整 ORF 的 cDNA 克隆及
测序 利用 DNAstar 软件查找 5 RACE PCR 扩增产
物的序列与原 EST 序列的重叠部分，将两段序列拼
接为全长 cDNA 序列。根据拼接的全长 cDNA 序列，
利用 Primer Premier 5.0 软件设计两端引物（引物引
入酶切位点 BamH Ⅰ、Xho Ⅰ），以 mRNA 反转录
合成的 cDNA 第一链为模板，进行 PCR 扩增。PCR
体系含模板 2 μL，上下游引物各 1 μL，总体积为 20
μL。反应条件 ：94℃ 2 min ；94℃ 45 s，57℃ 45 s，
72℃ 2 min，35 个循环 ；72℃ 10 min。反应结束后
取 10 μL 进行 1% 琼脂糖凝胶电泳分析。回收的特
异性 PCR 产物同 5 RACE 产物一样连接转化，经鉴
定正确后测序。
1.2.4 EtCHP559 基因的生物信息学分析 利用在
线软件 ORF finder（http ：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/
gorf.html）分析获得的新基因全长 cDNA 序列，找出
编码框。利用 ProtParam 工具（http ：//cn.expasy.org/
tools/protparam. html）计算编码蛋白质的理论分子
量、等电点、氨基酸组成等。利用 TMHMM 服务器
（http ：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/） 分 析
编码蛋白有无跨膜结构。利用 SignalP3.0 在线分析软
件（www.cbs.dtu.dk/services/SignalP） 分 析 编 码 蛋 白
有无信号肽。利用 ProtScale 分析软件（www.expasy.
org/cgi-bin/protscale.pl）分析编码蛋白的疏水性。采
用 motif_scan（http ：//myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_
scan）寻找氨基酸序列的功能结构域，了解目的蛋
白可能的功能。利用北京大学生物信息中心 WebLab
中提供的 Antigenic 程序（http ：//weblab.cbi.pku.edu.
cn/program.inputForm.do?program=antigenic） 分 析 其
抗原为点。采用 NCBI 服务器中的 CDD（http：//www.
ncbi.nlm.nih.gov/structure/cdd/cdd.shtml）程序对氨基
酸序列进行功能保守功能域分析，判断该蛋白是否
具有完整的保守结构域。
1.2.5 真核重组质粒 pcDNA3.1-flag-EtCHP559 的构
建 按上海天根生物技术有限公司提供的质粒提取
试剂盒提取重组克隆质粒 pGEM-T-EtCHP559，并用
BamH Ⅰ和 Xho Ⅰ对载体 pcDNA3.1-flag 和重组克隆
质粒 pGEM-T-EtCHP559 分别进行双酶切，酶切产物
经 1% 琼脂糖凝胶电泳后，回收目的片段，4℃连接
过夜，连接产物转入大肠杆菌 TOP10 感受态细胞中，
涂板过夜培养，次日挑取单克隆菌落于 5 mL LB 培
养基中培养 12 h 后，进行 PCR 鉴定 ；对鉴定为阳性
的菌液提取质粒用 BamH Ⅰ和 Xho I 限制性内切酶
进行双酶切鉴定，阳性克隆送至上海桑尼生物有限
公司进行测序。
1.2.6 DF-1 细胞的复苏培养及质粒转染 质粒转
染细胞前的一周复苏 DF-1 细胞，将细胞从液氮中
取出，迅速放入 37℃水浴中融化后，将细胞转入
15 mL 无菌离心管中，1 000 r/min 离心 5 min，用含
10% 胎牛血清的 DMEM 培养液悬浮细胞，转入细胞
培养瓶中，于 37℃，5%CO2 浓度的培养箱中培养，
每 2 d 更换一次培养液，传 2-3 代，至细胞生长状
态良好。转染前，用 0.25% 胰蛋白酶 -EDTA 消化液
37℃消化 2 min，收集 DF-1 细胞进行计数，以每孔
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60 万细胞铺被六孔板 2 块，37℃、5% CO2 培养过
夜，按照 LipofectamineTM 2000 脂质体转染操作步骤
分别将空质粒 pcDNA3.1-flag 和重组质粒 pcDNA3.1-
flag-EtCHP559 转 染 进 DF-1 细 胞， 置 于 37℃、5%
CO2 培养 6 h，更换为含有 2% 胎牛血清的 DMEM 培
养基。培养 48 h 后，收集一块六孔板的 DF-1 细胞，
提取蛋白后进行 Western blot 检测，另一块六孔板的
DF-1 细胞进行间接免疫荧光检测。
1.2.7 间接免疫荧光（IFA）鉴定蛋白在真核细胞
的 表 达 为 了 检 测 真 核 表 达 重 组 质 粒 pcDNA3.1-
flag-EtCHP559 在 DF-1 细 胞 中 的 表 达 情 况， 取 培
养 48 h 的 DF-1 细胞，每孔用 2% 多聚甲醛 2 mL 固
定 15 min，PBS 洗 涤 3 次， 加 入 1% Triton X-100 2
mL，室温下固定 15 min，PBS 洗涤 3 次，加入 2%
BSA/PBS 2 mL，4℃ 封 闭 过 夜，PBS 洗 涤 3 次， 加
入 抗 rEtCHP559 蛋 白 兔 源 血 清（1∶100 倍 稀 释 ），
37℃作用 1 h ；PBS 洗涤 3 次，加入 1∶400 稀释的
绿色荧光标记的山羊抗兔二抗，37℃作用 1 h，PBS
洗涤 3 次后在荧光显微镜下观察结果。
1.2.8 Western blot 鉴定真核表达重组质粒 pcDNA-
3.1-flag-EtCHP559 在 DF-1 细 胞 的 表 达 情 况 收 集
培 养 48 h 的 DF-1 细 胞， 加 入 RIPA 裂 解 液，4℃，
12 000 r/min 离心 2 min，取上清进行 SDS-PAGE 电
泳。全湿法电转移至 PVDF 膜上，5% 脱脂奶粉 4℃
封闭过夜 ；PBST 洗涤 3 次，加入 1∶100 稀释的抗
rEtCHP559 蛋白兔血清，37℃孵育 2 h ；PBST 洗涤 3
次，加入 1∶15 000 稀释的近红外荧光羊抗兔二抗，
37℃孵育 1 h，PBST 洗涤 3 次，再经 PBS 洗涤 5 次后，
用 Odyssey 双色红外激光成像系统进行拍照。
2 结果
2.1 CHP559基因的生物信息学分析
根 据 Et CHP559 基 因 的 EST 序 列， 利 用 5
RACE 技术扩增获得了含一个完整开放阅读框（ORF：
104-1 327 bp） 的 全 长 cDNA 序 列， 该 序 列 全 长
1 746 bp，包括 5 端的 UTR 序列，长 103 bp，含有
CAAT 序列，没有 TATA 序列 ；3 端 UTR 序列，长
419 bp，含 Ploy（A）尾，没有典型的 AATAAA 序列，
ORF 长 1 224 bp，编码 407 个氨基酸（图 1）；预测
分子量为 46.04 kD，等电点为 9.12，在溶液中的不
稳定指数为 40.44，高于域值 40，在溶液中性质不
稳定，脂肪族指数 81.45，总平均亲水性 -0.223 ；信
号肽、疏水性和跨膜结构的分析表明，该基因编码
的蛋白有信号肽，信号肽的概率为 0.998，其断裂位
点位于第 25 个 aa 和第 26 个 aa 之间，该蛋白具有
跨膜结构，其中第 1-8 个 aa 为蛋白的胞内区域，第
9-31 个 aa 为该蛋白的跨膜区域，第 32-407 个 aa 为
蛋白的胞外区域。疏水性分析显示最大值为 2.611，
最小值为 -3.511。抗原位点分析发现，该蛋白可能
有 15 个抗原位点，推测具有良好的免疫原性。经结
构功能域分析发现 EtCHP559 基因编码的蛋白可能
含有 2 个 N 端糖基化位点，6 个 N 端酰化位点，5
个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点，6 个蛋白激酶 C 磷酸
化位点和 1 个酪氨酸激酶磷酸化位点。利用 NCBI
的 CDD 程序对该基因编码的氨基酸的保守结构域进
行搜索，结果显示该基因编码的氨基酸没有保守结
构域。与柔嫩艾美耳球虫基因组数据库（http：//www.
genedb.org/Homepage/Etenella） 比 较 发 现， 该 基 因
的 ORF 与 保 守 的 假 象 蛋 白（hypothetical protein，
conserved，ETH_00024035）100% 同 源， 因 此 将 该
基因命名为 Et CHP559。
2.2 EtCHP559基因的克隆
利用 DNAstar 软件查找 5 RACE PCR 扩增产物
的序列与原 EST 序列的重叠部分，将两段序列拼接
为全长 cDNA 序列。根据拼接的全长 cDNA 序列，
利用合成的引物以柔嫩艾美耳球虫子孢子的 cDNA
第一链为模板进行 PCR 扩增含 ORF 的 cDNA 片段，
扩增产物经 1.0% 琼脂糖凝胶电泳分析，在 1 224
bp 处有特异性的单一条带，与预期大小一致（图
2）；其与 pGEM-Teasy 载体连接，转化感受态细胞
TOP10，菌液 PCR、双酶切、测序鉴定正确，表明
成功扩增获得 EtCHP559 基因含完整 ORF 的 cDNA
片段。
2.3 重组质粒pcDNA3.1-flag-EtCHP559的构建
分别用限制性内切酶 BamH Ⅰ和 Xho Ⅰ对鉴定
正确的重组克隆质粒 pGEM-T-EtCHP559 和空载体
pcDNA3.1-flag 进行双酶切，纯化后进行连接，构建
了真核重组表达质粒 pcDNA3.1-flag-EtCHP559。对
该重组质粒进行 PCR 和双酶切鉴定，结果（图 3）
2015,31(7) 165翟颀等 ：柔嫩艾美耳球虫保守蛋白 CHP559 基因克隆与真核表达
均为阳性，测序结果显示该基因正确插入，表明真
核重组表达质粒 pcDNA3.1-flag-EtCHP559 构建成功。
2.4 间接免疫荧光检测pcDNA3.1-flag-EtCHP559在
DF-1细胞中的表达情况
利用抗 rEtCHP559 蛋 白 兔 血 清， 对 重 组 质 粒
转染 48 h 后的 DF-1 细胞进行了免疫荧光检测。结
果（ 图 4） 显 示， 在 转 染 pcDNA3.1-flag-EtCHP559
重组质粒的 DF-1 细胞中，绿色荧光通道可以看到
特异的绿色荧光 ；而在转染 pcDNA3.1-flag 空载体和
正常的 DF-1 细胞中，无任何可见荧光。结果表明
pcDNA3.1-flag-EtCHP559 重组质粒能在 DF-1 细胞中
成功转染和表达。
2.5 Western blot分析pcDNA3.1-flag-EtCHP559在
DF-1细胞中的表达
Western blot 结 果（ 图 5） 显 示， 转 染 了
pcDNA3.1-flag-EtCHP559 重 组 质 粒 的 DF-1 细 胞 中
779
734
689
644
599
554
509
464
419
374
329
284
239
194
149
104
91
46
1
1733
1688
1643
1598
1553
1508
1463
1418
1373
1328
1319
1274
1229
1184
1139
1094
1049
1004
959
914
869
824
1327
图 1 EtCHP559 cDNA 的核苷酸序列及其氨基酸序列
2000
1224
bp
M 1
bp
1000
750
M ：DNA 分子量标准（DL2000）；1 ：EtCHP559 基因
图 2 EtCHP559 的 PCR 扩增结果
M 1 M 2
M：DNA 分子量标准（DL2000）；1：pcDNA3.1-flag-EtCHP559 菌液 PCR 鉴定；
2 ：pcDNA3.1-flag-EtCHP559 双酶切鉴定
图 3 重组质粒 pcDNA3.1-flag-EtCHP559 的 PCR 与双酶
切鉴定结果
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.7166
可检测到大小约为 47 kD 的目的条带，而转染空载
体 的 DF-1 细 胞 中 却 没 有 相 应 的 条 带 出 现， 表 明
pcDNA3.1-flag-EtCHP559 重组质粒成功转染了 DF-1
细胞并在 DF-1 细胞中成功表达。
3 讨论
虽然顶复器门原虫入侵的宿主细胞不同，包括
红细胞、淋巴细胞、巨噬细胞和消化道细胞等，但
它们都有一个共同的高度保守的入侵机制［6］。 在这
一过程中，运动接触环（MJ）的形成至关重要，此
特殊结构作为支架推动虫体进入带虫空泡［7，8］，对
顶复器门原虫弓形虫、疟原虫等研究表明，AMA1
通过与棒状体颈部蛋白（RONs）相互作用形成的
复合体是构成 MJ 结构的主要成分，参与入侵过
程［3，9，10］。但到目前为止，对鸡球虫入侵宿主细胞
时 MJ 的分子组成研究还未见报道，只是对微线分
泌的顶膜抗原 AMA1 进行了一些研究。Jiang 等［11］
首次克隆到了柔嫩艾美耳球虫的 AMA1 基因全长，
并在体外用多克隆抗体抑制 EtAMA1 蛋白后观察到
子孢子细胞入侵率下降了 70%，表明 AMA1 蛋白参
与了子孢子入侵宿主细胞的过程。为了进一步研究
柔嫩艾美耳球虫 AMA1 的功能，薛璞［5］利用酵母双
杂交的方法从柔嫩艾美耳球虫子孢子酵母 cDNA 文
库中筛选到了与 EtAMA1 相互作用的 14 个蛋白的
ESTs 序列。已有研究表明其中 2 个 ESTs（EtZB1-A08
与 EtMIC2）参与了球虫入侵宿主细胞的过程，本研
究扩增获得的 EtCHP559 基因，是根据其中的一个
EST 序列利用 RACE 技术扩增获得的，因此该蛋白
可能与 EtAMA1 相互作用，参与了子孢子入侵宿主
细胞的过程。
pcDNA3.1 载体是一种能够在哺乳动物细胞或
宿主内高水平稳定或瞬时表达的真核表达载体，其
含有巨细胞病毒早期启动子 CMV、BGH、polyA 加
尾信号和 SV40 早期启动子，全长 5 400 bp，还带
有 Neo 抗性基因便于转染细胞的筛选，常用来融
合表达多种外源基因蛋白以及核酸疫苗的研究［12］。
本 研 究 选 用 的 真 核 表 达 载 体 pcDNA3.1-Flag 是 由
pcDNA3.1（+）改造而获得的，该载体在 pcDNA3.1
（+）多克隆位点的 N 端添加了 flag 标签，并且在标
签序列之前插入了 kozak 序列。研究发现真核生物
蛋白表达调控与蛋白起始密码子 AUG 周围的碱基种
类有很大关系，当一个基因起始密码子 AUG 之前的
A
B
C
A ：pcDNA3.1-flag-EtCHP559 转 染 DF-1 细 胞 ；B ：pcDNA3.1-flag 质 粒 转 染
DF-1 细胞 ；C ：正常 DF-1 细胞
图 4 重组质粒 pcDNA3.1-flag-EtCHP559 表达产物的间接
免疫荧光检测
170
130
100
55
40
35
25
15
kD M 1 2
M ：预染的蛋白质标准分子量 ；1 ：转染 pcDNA3.1-flag-EtCHP559 的 DF-1 细
胞 ；2 ：转染 pcDNA3.1-flag 载体的 DF-1 细胞
图 5 EtCHP559 重组蛋白 Western blot 分析结果
2015,31(7) 167翟颀等 ：柔嫩艾美耳球虫保守蛋白 CHP559 基因克隆与真核表达
碱基为 kozak 序列 GCCACC 时，该蛋白表达量会有
相应提高［13］。 Flag 是序列为 DYKDDDDK 蛋白标签，
由亲水性的 8 个氨基酸残基组成，序列简短，对目
标蛋白的结构和生物活性影响小，容易构建成标签
蛋白融合 N 端或 C 端，可用 Anti-flag 抗体检测［14］。
Flag 标签还可设计用于免疫亲和层析，在非变性条
件下洗脱 flag 标签融合蛋白［15］。因此，本研究利用
该载体成功构建了真核表达重组质粒 pcDNA3.1-flag-
EtCHP559，并在真核细胞 DF-1 中成功表达，表达
的蛋白带有 flag 标签，在后续实验中可以用来纯化
蛋白，也可以通过免疫沉淀来研究蛋白质之间的互
作等。
近年来，为了对鸡球虫功能基因和核酸疫苗的
研究，许多研究者将鸡球虫的功能基因连接到真核
表达载体，成功构建了真核重组质粒，并在不同的
真核表达细胞中获得表达。如王艳歌等［16］构建了
柔嫩艾美耳球虫乳酸脱氢酶的真核表达质粒，并在
293T 细胞中成功表达，刘颖丽等［17］在 Hela 细胞中
成功表达了柔嫩艾美耳球虫微线蛋白 2（Et-MIC2），
杜爱芳等［18］以减毒沙门氏菌为载体，在 Vero 细胞
中表达了柔嫩艾美耳球虫微线蛋白 4（Et-MIC4）。
但这些细胞均为哺乳动物细胞，目前还未见利用球
虫宿主鸡细胞来表达鸡球虫蛋白的报道。本研究尝
试选择了鸡胚成纤维细胞（chicken embryo fibroblast
cell line，DF-1） 来 表 达 EtCHP559，DF-1 细 胞 来
源 于 East Lansing Line（ELL-0）， 是 一 种 可 无 限 传
代的细胞系，目前，在病毒研究领域应用广泛，如
用于病毒疫苗的生产和重组病毒或蛋白的表达［19］。
黄杰等［20］在 DF-1 细胞中成功表达了鸭瘟病毒的
UL7 蛋白，田志革等［21］将新城疫病毒 V 基因片段
与 pcDNA3.1 载体连接，并在 DF-1 细胞中获得了表
达。近来，DF-1 细胞也被用于鸡球虫体外培养的研
究，姜连连等［22］首次将 DF-1 细胞应用于鸡球虫研
究领域，将柔嫩艾美耳球虫子孢子接入 DF-1 细胞
后，子孢子能成功入侵 DF-1 细胞，并在细胞内发育
至裂殖子，因此该细胞可用于鸡球虫体外研究。本
研究在 DF-1 细胞中首次成功表达了柔嫩艾美耳球虫
CHP559 蛋白，由于 DF-1 细胞是柔嫩艾美耳球虫天
然宿主鸡的本体细胞，因此以其为平台更有利于研
究球虫基因的功能以及与宿主的相互作用关系。
4 结论
本研究利用 RACE 技术成功获得了柔嫩艾美耳
球虫保守蛋白 EtCHP559 基因，并构建了其真核重
组表达质粒 pcDNA3.1-Flag-EtCHP559，成功转染到
DF-1 细胞中。通过间接免疫荧光和免疫印迹的方法
证实该基因在真核细胞 DF-1 中成功表达，这些结果
将为进一步研究该蛋白的生物学功能和球虫核酸疫
苗的研制奠定了基础。
参 考 文 献
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（责任编辑 李楠）