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研究报告

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY
BULLETIN 2011年第 5期
柔嫩艾美耳球虫新基因的生物信息学分析与克隆表达
姜连连
林矫矫
韩红玉
董辉
赵其平
朱顺海
马卫娇
程军
曾艳波
黄兵
(中国农业科学院上海兽医研究所 农业部动物寄生虫学重点开放实验室,上海 200241 )


摘
要:
为了研究柔嫩艾美耳球虫 (E im er ia tenella )的两个主要入侵发育阶段


子孢子和裂殖子的差异基因, 根据已
报道的子孢子与裂殖子差异的 ESTs序列, 应用 RACE技术克隆获得了子孢子阶段差异表达的新基因全长 cDNA序列, 命名为
ZL583。该基因全长为 862 bp,开放阅读框 ( ORF)为 486 bp,编码 161个氨基酸, 编码蛋白的分子量约为 16
9 kD,利用生物信
息学分析软件, 分析新基因所编码蛋白的性质、定位、结构等特征。利用荧光定量 PCR对柔嫩艾美耳球虫不同发育阶段该基
因的表达量进行分析显示,子孢子阶段的表达高于其他发育阶段。将 ZL583克隆于 pET
28a中构建重组质粒, 转化大肠杆菌
BL21( DE3)后经 IPTG诱导表达, 获得重组蛋白分子量约 23 kD。免疫印迹分析显示该重组蛋白可与兔抗子孢子血清发生特
异性反应, 表明该蛋白具有较好的反应原性。该结果为进一步研究该基因的生物学功能奠定基础。
关键词:
柔嫩艾美耳球虫
子孢子
裂殖子
克隆
表达
B ioinformatics Analysis, Cloning and Expression of a NovelGene
from E im eria tenella
Jiang L ianlian
L in J iaojiao
H an H ongyu
DongH ui
Zhao Q iping
Zhu Shunhai
M aW eijiao
Cheng Jun
Zeng Yanbo
Huang B ing
(K ey Laboratory for A nimalParasitology of M inistry of Agricultry, Shanghai Veterinary Research Institute,
ChineseA cademy of Agricultural Sciences, Shanghai 200241)


Abstrac:t
In order to study the different genes between the invasion stages ofE im eria tenella, expressed sequence tags( ESTs) of
sporoziotes and m ero zo ites were ana lyzed and a novel gene nam ed ZL583 w as identified by rap id am plification o f cDNA ends( RACE)
approaches. The fu ll
length cDNA w as 862 bp w ith an open read ing frame( ORF) of 486 bp encoded a po lypeptide o f 161 am ino ac ids
w ith the predicted m olecu larw eigh t o f 16
9 kD. B io in fo rm atics m ethods we re used to pred ict the structure and function of the gene. Re

a l
tim e quan tita tive PCR analysis revealed tha t the expression leve l of ZL583 in sporozo ites is higher than those in the other developed
stages( unspo rulated oocysts, sporu la ted oocysts and second
generation m erozo ites). The sequence encoding them ature pro te in w as am

p lified by PCR, c loned into the pET
28a vecto r and expressed in E scher ichia coliBL21( DE3). SDS
PAGE ind icated that the recomb i

nant prote in was 23 kD and so luble. W estern blotting revealed that the recomb inant pro te in could be specifically recogn ized by po ly

clona l antibodies aga inst spo rozo ites o fE. tenella. These resu lts wou ld in favour o f study ing the biolog ica l function of the gene.
Key words:
E im er ia tenella
Spo rozo ite
M erozo ite
C loning
Expression
收稿日期: 2011
02
17
基金项目:上海市自然科学基金项目 ( 09ZR1438700) ,中央级公益性科研院所基本科研业务费项目 ( 2011JB01 )
作者简介:姜连连,女,博士研究生,助理研究员,研究方向:球虫分子生物学; E
m ai:l jl@l shvr.i ac. cn
通讯作者:黄兵,研究员, E
m ai:l huangb ing232@ 163. com
鸡球虫病是由几种艾美耳球虫寄生于肠道所引
起的一种危害极其严重的全球性寄生虫病, 严重危
害鸡的生长发育,给养鸡业造成巨大的经济损失 [ 1]。
目前, 鸡球虫病主要以药物防治和活疫苗免疫为主,
但由于耐药虫株出现频率的增加, 公众对肉蛋中药
物残留问题的日益重视, 以及使用活疫苗存在保存
难、散毒及潜在的致病威胁等缺点,迫使人们去寻找
更有效的防治方法 [ 2, 3]。近年来,研究表明, 许多球
2011年第 5期

姜连连等:柔嫩艾美耳球虫新基因的生物信息学分析与克隆表达
虫的重组蛋白可以诱导机体产生免疫保护反应,揭
示重组疫苗将这些抗原包括阶段特异性蛋白, 如子
孢子和裂殖子顶端特殊的分泌器官 (微线、棒状体
和致密颗粒 )分泌的蛋白, 揭示重组疫苗将成为球
虫疫苗的研究热点 [ 4 - 6]。因此, 对球虫不同发育阶
段虫体的功能蛋白和基因的研究显得尤为重要,可
为寻求新的靶标抗原提供参考 [ 7 - 9 ]。
柔嫩艾美耳球虫是一种分布广, 对鸡致病性最
强的球虫,其生活史主要包括孢子生殖、裂殖生殖和
配子生殖 3个阶段。子孢子是侵入宿主细胞的第一
个阶段,裂殖子是虫体在宿主细胞内增殖释放后重
新侵入宿主细胞的阶段, 因而子孢子和裂殖子均与
虫体入侵细胞相关, 比较分析这两个阶段虫体表达
基因的异同,有利于寻找入侵相关基因,为研究子孢
子和裂殖子的入侵机制提供参考依据。本研究利用
已发表的柔嫩艾美耳球虫子孢子和裂殖子差异的
ESTs序列,选取子孢子阶段高表达的 EST序列 (基
因登录号: BG929583) [ 7] ,利用 RACE技术克隆获得
了该基因的全长 cDNA序列,对其进行序列分析,发
现为未报道的新基因,并对其进行克隆表达,为进一
步研究该基因在柔嫩艾美耳球虫整个生活史中的功
能奠定基础。
1
材料和方法
1
1
虫种及试验动物
柔嫩艾美耳球虫纯种 (编号: CAAS21111611) ,
由中国农业科学院上海兽医研究所动物寄生虫病研
究室保存。 1日龄罗曼雏公鸡, 购自上海南汇某
鸡场。
1
2
菌种和表达载体
大肠杆菌 TOP10、BL21( DE3)购自上海天根生
物技术有限公司, 表达载体 pET
28a由本实验室
保存。
1
3
主要试剂与设备
pGEM
T购自 Promega公司, T rizo l、GeneRacerTM
K it购自 Inv itrogen 公司, RN easy M ini K it、DNA
M arker、Q IA qu ick PCR Purification K it购自 Q iagen公
司, Agarose G el DNA Purification K it购自上海申能
博彩生物科技有限公司, E coR
和 N ot
及 SYBR
Green I荧光染料购自宝生物工程 (大连 )有限公司,
DEPC、X
Gal、TagP lus I DNA聚合酶购自上海生工
生物工程技术有限公司, B acto
yeast ex tract、AgarA、
Bacto
tryptone为 Oxo id公司产品, 弗氏完全和不完
全佐剂购自 S igma公司, M x3005p荧光定量 PCR仪
为 Stratagene公司产品。
1
4
柔嫩艾美耳球虫各阶段虫体的收集和纯化
将柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊按 1
104个 /只
接种 14日龄无球虫雏鸡,在感染后第 5天剖杀鸡取
盲肠收集裂殖子, 裂殖子的纯化参照文献 [ 11]方
法。感染后第 8天剖杀鸡取盲肠收集未孢子化卵
囊, 收集的未孢子化卵囊按常规进行孢子化,未孢子
化卵囊和孢子化卵囊的纯化参考文献 [ 12]的方法
操作。子孢子的制备与收集参照文献 [ 13]的方法,
操作过程中略作修改。
1
5
总 RNA提取
以纯化的子孢子为材料按 Tr izo l说明书操作,
提取柔嫩艾美耳球虫子孢子阶段虫体的 Tota lRNA,
反转录合成 cDNA第一链。
1
6
ZL583全长基因的克隆及测序
1
6
1
ZL583基因的 RACE扩增根据
ZL583 EST
设计 5
端引物为 E t583
1, N ested
E t583
1, 3
端的引
物为 E t583
2, N ested
E t583
2 (表 1)。将 3

RACE
和 5

RACE PCR扩增产物回收纯化后与 pGEM
T
连接,转化 TOP10感受态细胞,进行蓝白斑筛选, 对
PCR鉴定的阳性菌落进行测序。
表 1
PCR反应中所用的引物名称及序列
引物 ID

引物序列 ( 5
 3
)
E t583
1 CCTGCCTCCACGCGCTTCTCGACT
Nested
E t583
1 GACTCTCGTTCCCTCACCGCTAGA
E t583
2 CCGCGATCTCAGCCTTGGGGTTGAT
Nested
E t583
2 ACGCCGGTGTTGAGCCAGTGC

CAGACTT
583
1 CTTTGCGCTACTATACTTTA
583
2 ACGCAGATTACTAAGACGGA
Real t im e quan titative PCR
sense prim er
TGTTGTGAGCGATCAAAGTATAGG
Real t im e quan titative PCR
an tisense prim er
ACTAAGACGGACAGACAGGTTG
18S rRNA Sen se TGTAGTGGAGTCTTGGTGATTC
18S rRNA An ti
sen se CCTGCTGCCTTCCTTAGATG
J1 GCGAATTCTGCGTGAAAATGGACC
J2 GTGCGGCCGCATCGCTCACAACAA
109
生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2011年第 5期
1
6
2
ZL583全长基因的扩增
根据 3
端和 5
端
RACE扩增产物测序结果,利用 DNAStar软件查找
3

RACE和 5

RACE PCR扩增产物的序列与原
EST序列的重叠部分,将 3段序列拼接为全长 cDNA
序列。再根据拼接的全长 cDNA序列,设计上、下游
引物分别为 583
1, 583
2(表 1), 以 mRNA反转录合
成的 cDNA第一链为模板, 进行 PCR扩增全长 cD

NA,扩增产物回收,连接转化 TOP10感受态细胞,对
PCR鉴定的阳性菌落进行测序。
1
7
ZL583基因的同源性分析
用 NCB I的 ORF finder程序寻找 cDNA片段中
的开放读码框并确定其编码的氨基酸序列,用 BLAST
( http: / /www. ncb.i nlm. n ih. gov /BLAST / )进行同源
性 分 析, Conserved Domains ( http: / /
www
ncbi
nlm
nih
gov /S tructure / cdd /w rpsb
cg i)程
序搜索是否具有全长的结构域,另外与其他物种已
知的全长基因进行比较来识别该基因是否为全长
基因。
1
8
ZL583基因的生物信息学分析
用 ExPASy
protparam Too l ( http: / / ca. expasy.
org / too ls/pro tparam. htm l)对 ZL583编码的蛋白质一
级结构的理化性质及结构分析,包括蛋白质的相对
分子量、理论等电点、消光系数、半衰期、不稳定系数
等分析;丝氨酸 ( Ser)、苏氨酸 ( Thr)和酪氨酸 ( Tyr)
磷酸化位点预测用 NetPhos( http: / /www. cbs. dtu.
dk /serv ices /) ; 信号肽及剪切位点预测用 SignalIP
( http: / /www. cbs. dtu. dk /serv ices/S ignalP / ) ; 跨膜
区预测用 TMHMM ( http: / /www. cbs. dtu. dk /serv

ices/TMHMM
2. 0 / );保守结构域用 NCB I/CDD ( ht

tp: / /www. ncb.i nlm. n ih. gov /structure /cdd /cdd. sht

m l) ;利用 PSORT II server( http: / /psor.t im s. utokyo.
ac. jp / form2. h tm l)进行亚细胞定位分析。利用 An

t igen ic程序分析其抗原位点。
1
9
ZL583基因不同发育阶段表达差异分析
选择柔嫩艾美耳球虫的看家基因 18S rRNA作
为内参,分别提取柔嫩艾美耳球虫未孢子化卵囊、孢
子化卵囊、子孢子、第二代裂殖子的总 RNA, 利用随
机引物合成 cDNA第一链。以这 4个不同发育阶段
的 cDNA第一链为模板,利用荧光定量 PCR法检测
ZL583基因在柔嫩艾美耳球虫不同发育阶段中的表
达情况。扩增 ZL583的引物和扩增 18S rRNA引物
见表 1。采用 SYBR G reen I荧光染料进行实时定
量 PCR, 反应体系 20
L。反应程序: 95
20 s;
95
5 s、55
15 s、72
15 s, 40个循环, 其中
55
15 s结束时间点为荧光信号检测点。虫体的
每个发育阶段做 3个样本重复, 每个样本做 3次技
术重复。
1
10
ZL583基因原核表达质粒的构建
根据 ZL583全长基因序列, 设计引物扩增开放
阅读框序列,上游和下游引物分别为 J1、J2(表 1),
在引物中引入酶切位点 E coR
和N ot
。 PCR产物
用 E coR
/N o t
双酶切后与同样双酶切的 pET
28a
连接, 构建重组表达质粒。转化大肠杆菌 BL21
( DE3) ,挑取单克隆过夜培养后用 1 mmo l/L IPTG
进行诱导表达, 将上清和沉淀进行 SDS
PAGE电泳
分析,以确定其表达形式。
1
11
柔嫩艾美耳球虫子孢子抗血清的制备
取 1
4中收集纯化的子孢子, 加入 4 mmo l/L
AEBSF抑制蛋白酶活性。冰浴状态下, 超声裂解至
无完整的子孢子, 将悬浮液 4
, 12 000 r /m in离心
30m in, 取上清, 测定蛋白质的浓度, 以每只兔子免
疫 200
g的剂量将子孢子全蛋白与弗氏完全佐剂
进行乳化,免疫 8周龄的母兔,免疫两周后, 再以相
同剂量的蛋白与弗氏不完全佐剂乳化后加强免疫 3
次, 每次间隔时间均为两周, 最后一次加强免疫后 8
d,对兔子进行大量采血,分离血清。
1
12
表达产物的W estern b lo tting鉴定
将 ZL583的重组蛋白进行 12%的 SDS
PAGE
电泳,转印到 PVDF膜上,用柔嫩艾美耳球虫子孢子
全蛋白的兔抗血清作为一抗, 辣根过氧化物酶标记
的羊抗兔 IgG为二抗, DAB显色, 至目的条带清晰
时水洗终止反应。
2
结果
2
1
ZL583全长基因的扩增
按照 ZL583的 EST序列设计的 RACE引物, 经
PCR扩增获得 3
和 5
末端序列。再根据全长 cDNA
序列设计引物, 以柔嫩艾美耳球虫子孢子的 cDNA
为模板进行 PCR扩增, 扩增产物经 1
0%琼脂糖凝
胶电泳分析, 约在 862 bp处有特异性的单一条带
(图 1), 结果与预期大小一致。
110
2011年第 5期

姜连连等:柔嫩艾美耳球虫新基因的生物信息学分析与克隆表达
M. DL2000分子量标准; 1. PCR扩增产物
图 1
ZL583全长的 PCR扩增产物
2
2
ZL583基因的同源性分析
对 RACE技术扩增获得了全长为 862 bp的 cD

NA序列。经 ORF finder程序分析表明, 在 106 -
591 bp之间存在完整开放性阅读框 ( ORF) , 大小为
486 bp。同源性分析发现该基因与间日疟原虫
(P lasmod ium vivax )的假想蛋白一致性为 42%。经
Conserved Dom ains Search程序对该基因编码的氨基
酸的保守结构域进行搜索, 结果显示该基因编码的
氨基酸没有保守结构域;并成功登录 GenBank(登录
号: HQ 877408)。
2
3
ZL583基因的生物信息学分析
根据生物软件预测, ZL583蛋白由 161个氨基
酸残基组成,相对分子质量 16
9 kD,等电点为 4
60,
带负电荷的氨基酸 Asp、G lu共 26个,带正电荷的氨
基酸 A rg、Lys共 13个,在体外的哺乳动物网织红细
胞中的半衰期为 30 h,在酵母和大肠杆菌中的半衰
期分别大于 20和 10 h。其不稳定系数为 55
9, 因
高于阈值 40为不稳定蛋白。脂肪系数为 67
27,总
平均亲水性为 - 0
621, 结合 Prot Scale软件的发现
疏水性的最大值 ( 2
289)位于 85位的亮氨酸, 亲水
性的最大值 ( - 2
467)位于 40位的脯氨酸, 说明该
蛋白是一个亲水蛋白。根据软件分析, 预测该蛋白
表达在细胞核的可能性稍大 ( 47
8% ), 其次为细胞
质 ( 34
8% )、细胞骨架 ( 8
7% )、质膜 ( 4
3% )、线粒
体 ( 4
3% )。采用 N etPhosK server和 N etPhos server
两种分析软件,预测 ZL583蛋白存在的激酶特异性
磷酸化位点、丝氨酸 ( S )和苏氨酸 ( T )磷酸化位点。
其中经 N etPhosK预测分值在 0
5以上的磷酸化位
点有 14个,分值最高的为蛋白激酶 C ( PKC ); 采用
NetPhos server分析软件预测分值在 0
5以上的磷
酸化位点有 9个; 两种方法都预测到的, 分别是第
7、16、31、35、113和 146位的 S残基和第 21位的 T
残基,其催化激酶有蛋白激酶 C ( PKC )、酪蛋白激酶
II( CK II)、糖原合成酶激 ( GSK3)和细胞周期蛋白依
赖性蛋白激酶 ( CDC2)。该蛋白无信号肽序列, 表
明该蛋白是非分泌性蛋白。未预测到有保守结构域
存在。抗原位点分析发现, 该蛋白可能有 4个抗原
位点 (表 2)。
表 2
ZL583编码蛋白的抗原肽位点分析
抗原位点 分值 氨基酸序列
136- 146 1
138 KPH LLEPVPES
101- 131 1
136 GQPSAPVLPPAPSPLDLEHAGVEPVPDLTAQ
66- 92 1
099 PH PFGVKQLITSFGAAISALGLMVQGL
46- 64 1
087 HEEVAEPPKLPDEPCFGRP
2
4
ZL583基因在不同发育阶段的差异表达性分析
分别提取柔嫩艾美耳球虫未孢子化卵囊、孢子
化卵囊、子孢子和第二代裂殖子 4个发育阶段的虫
体总 RNA,选择 18S rRNA作为内参,利用荧光定量
PCR验证该基因在柔嫩艾美耳球虫不同发育阶段
虫体中的 mRNA转录情况。试验结果 (图 2)表明,
该基因在子孢子阶段的转录拷贝数最高,比孢子化
卵囊的基因转录拷贝数多约 7倍, 比未孢子化卵囊
和裂殖子高约 20倍。
SO.孢子化卵囊; UO.未孢子化卵囊; SZ.子孢子; MZ.裂殖子
图 2
ZL583不同发育阶段 Real
tim e PCR 结果
2
5
ZL583重组表达质粒的构建
将含 ZL583开放阅读框的 PCR产物经 E coR

和N ot
双酶切,并与经同样双酶切的 pET
28a表达
载体连接,将连接产物转化 BL21感受态细胞, 选取
111
生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2011年第 5期
阳性菌落经 PCR鉴定后, 获得了正确的重组表达质
粒 pET
28a
583(图 3)。经 1 mmo l/L IPTG诱导表
达。SDS
PAGE结果表明达的重组蛋白约为 23 kD,
与预期分析的大小基本相一致 (图 4)。经鉴定表达
的蛋白大部分以可溶性存在。
2
6
ZL583重组蛋白免疫原性分析
将纯化的重组蛋白进行 W estern b lo tt ing分析,
结果 (图 5)显示, 抗柔嫩艾美耳球虫子孢子血清能
特异识别重组蛋白,在 23 kD处有一条特异性条带,
表明该重组蛋白具有良好的抗原性。
M. DL2000分子量标准; 1, 2.菌液鉴定的条带
图 3
重组质粒的 PCR鉴定结果
1.诱导表达的重组蛋白 H is
583; 2.未诱导菌液;
M.蛋白质分子质量标准
图 4
重组蛋白的 SDS
PAGE分析
3
讨论
鸡球虫的生活史复杂,不同发育阶段的蛋白组
成有很大的差异,子孢子和裂殖子均为虫体的入侵
发育阶段, 但二者的入侵形式和主要入侵蛋白是
否存在异同一直是研究的热点。本研究通过对已
M.蛋白质分子质量标准; 1.重组蛋白
图 5
W estern b lotting检测重组蛋白
发表的子孢子和裂殖子的差异 ESTs进行分析,选择
一个差异较为明显的 EST序列,利用 RACE技术获
得一条长为 862 bp的基因序列。利用荧光定量
PCR证明该基因在柔嫩艾美耳球虫的 4个主要发育
阶段均有表达,但子孢子中的表达量明显高于其他
3个发育阶段, 提示该基因可能参与子孢子入侵宿
主细胞的过程。
对 ZL583基因进行序列分析, 发现其是一种功
能未知新基因,仅与疟原虫的假想蛋白具有 42%的
同源性,该蛋白是一种不稳定的亲水性蛋白,可能是
个不成熟多肽,还需要经过翻译后加工才能形成稳
定蛋白。通过序列分析该蛋白不具有跨膜结构, 预
测其定位于细胞核内的可能性略大, 但也可能定位
于胞浆内。磷酸化调节是细胞内信号转导的重要方
式。其中 PKC磷酸化位点与介导胞外分泌有关;
CK II磷酸化位点与调节细胞凋亡和细胞周期有
关 [ 14] ; GSK3磷酸化位点与调节细胞的糖原合成代
谢相关 [ 15 ] ; CDC2磷酸化位点与细胞周期调控相
关 [ 16]。生物信息分析表明, ZL583蛋白可能具有上
述磷酸化位点提示该基因的生物学作用可能受到以
上蛋白激酶的磷酸化调节, 参与对细胞增殖和细胞
周期的调控。
本研究将该基因构建到原核表达载体 pET
28a
中进行目的蛋白表达,结果以可溶性重组蛋白形式
表达,但是融合蛋白的表达水平不高,进行条件优化
效果不太显著,提示该蛋白可能需要进一步加工修
112
2011年第 5期

姜连连等:柔嫩艾美耳球虫新基因的生物信息学分析与克隆表达
饰才能大量稳定表达。利用Western b lo tt ing对重组
蛋白的抗原性进行分析, 结果重组蛋白能被柔嫩艾
美耳球虫子孢子免疫血清识别,说明该蛋白具有一
定的抗原性且在孢子中存在该基因编码的天然蛋
白,为进一步研究该新基因的功能奠定基础。
参 考 文 献
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马鑫 )
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