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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第4期
收稿日期 : 2011-11-03
基金项目 : 上海市自然科学基金项目（09ZR1438700）, 中央级公益性科研院所基本科研业务费项目（2011JB01）
作者简介 : 孔春林 , 男 , 硕士研究生 , 研究方向 : 球虫分子生物学 ; E-mail: starlinkong@163.com
通讯作者 : 黄兵 , 男 , 研究员 , 研究方向 : 球虫生物学 ; E-mail: hb@ shvri.ac.cn
柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶 3基因在
毕赤酵母中的表达及分析
孔春林1, 2 韩红玉2 李洋2 董辉2 姜连连2 李婷2 赵其平2 朱顺海2 黄兵2
（1上海师范大学生命与环境科学学院，上海 200234 ；2中国农业科学院上海兽医研究所 农业部动物寄生虫学
重点开放实验室，上海 200241）
摘 要： 旨在真核表达系统中高效表达柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶 3（Eimeria tenella calcium-dependent protein kinase-3，
EtCDPK3），获得有活性的天然蛋白，利用毕赤酵母表达系统对该基因进行了表达。将 EtCDPK3基因连接到毕赤酵母表达载体
pPIC9K上，构建重组质粒 pPIC9K-EtCDPK3。重组质粒通过电击转化入酵母细胞 GS115后，用组氨酸缺陷培养基和 G418分别进
行筛选，获得含重组质粒的酵母表达细胞。重组酵母细胞在含 1%甲醇的 BMMY培养基中诱导产生目的蛋白，培养收集 1-4 d的
部分上清。经 SDS-PAGE检测，所表达的蛋白相对分子质量约为 49 kD。Western blotting表明，该蛋白能与兔抗 EtCDPK3血清特
异性结合。结果表明，柔嫩艾美耳球虫 CDPK3基因在毕赤酵母中成功地进行了表达。
关键词： 柔嫩艾美耳球虫 钙依赖蛋白激酶 3 真核表达 毕赤酵母
Analysis and Expression of Eimeria tenella Calcium-dependent Protein
Kinase-3 Gene in Pichia pastoris
Kong Chunlin1, 2 Han Hongyu2 Li Yang2 Dong Hui2 Jiang Lianlian2 Li Ting2
Zhao Qiping2 Zhu Shunhai2 Huang Bing2
（1College of Life and Environmental Sciences, Shanghai Normal University, Shanghai 200234；2Key Laboratory of Animal Parasitology of
Ministry of Agriculture, Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241）
Abstract: In order to efficiently express calcium-dependent protein kinase-3 (EtCDPK3) of Eimeria tenella in eukaryotic expression
system and obtain the active and natural protein, EtCDPK3 gene were ligated to Pichia pastoris expression vector pPIC9K. The recombinant
plasmid pPIC9K-EtCDPK3 was constructed successfully. After the recombinant plasmids were transformed into yeast cells GS115 by
electroporation technology, the positive yeast cells containing recombinant expression plasmid which were screened with histidine-deficient
medium and G418 were obtained. The protein was produced by recombinant yeast cells which were induced by 1% methanol in BMMY medium.
Part of supernatant were collected from 1 d to 4 d. Results showed the target protein band of about 49 kD was identified by SDS-PAGE. Western
blotting analysis demonstrated that the target protein could bind specifically to rabbit serum of anti-EtCDPK3. These results showed that Eimeria
tenella CDPK3 gene had been successfully expressed in Pichia pastoris, which have provided the foundation for further studying function of the
protein.
Key words: Eimeria tenella CDPK3 Eukaryotic expression Pichia pastoris
鸡球虫病在世界范围内严重影响养鸡业健康
发展，给养鸡业造成巨大的经济损失，主要是由几
种艾美耳球虫寄生于鸡肠道引起。在几种艾美耳球
虫中，柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）是分布最
广、致病力最强的球虫之一，也是研究鸡球虫病的
一种模式物种［1］。目前防治鸡球虫病主要以抗球
虫药为主，但抗药性和药物残留等问题限制了抗球
虫药物的广泛应用。现阶段分子生物学技术的迅猛
2012年第4期 109孔春林等 ：柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶 3 基因在毕赤酵母中的表达及分析
发展为寄生虫基因亚单位疫苗的研发开辟了新的思
路。一般认为子孢子入侵和裂殖子生殖阶段是球虫
最危险的阶段［2］ 。本实验室前期利用抑制性消减杂
交技术和 cDNA 微阵列技术筛选了柔嫩艾美耳球虫
子孢子与孢子化卵囊差异表达基因［3］，在对柔嫩艾
美耳球虫子孢子阶段部分高表达基因序列分析时，
发现有与其他物种钙依赖蛋白激酶（CDPKs）同源
的 EST 序列。利用 RACE 技术克隆获得该基因的全
长序列（命名为 EtCDPK3），经 Blast 比较分析，发
现与刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）CDPK、恶性
疟原虫（Plasmodium falciparum） CDPK、犬新孢子
虫 （Neospora caninum）CDPK 等 高 度 同 源。CDPKs
全称是钙依赖的而钙调素不依赖的蛋白激酶，它不
同于动物细胞中的蛋白激酶 C 和依赖于 Ca2+/ 钙调素
（CaM） 的蛋白激酶。CDPKs目前只发现在植物、绿藻、
纤毛虫及顶复器原虫中存在，但在细菌、真菌、酵母、
线虫和动物中尚未发现。植物含有多种 CDPKs，在
不同发育阶段调控着许多钙依赖的生理功能，包括
干旱、冷热应激、盐应激、机械损伤、激素信号传导、
生长和发育等［4］。研究也发现顶复器原虫的 CDPKs
对虫体在宿主体内完成整个生活史起着至关重要的
作用［5］。
本实验室前期获得了柔嫩艾美耳球虫 CDPK3 基
因，连接至原核表达载体 pET-28a，并在原核表达
系统中成功表达，但表达的融合蛋白以包涵体形式
存在［6］，在改变诸多表达条件后，该蛋白仍然主要
以包涵体形式存在，产物的纯化比较困难，难以获
得具有天然活性的目的蛋白，不利于进一步研究其
功能。由于毕赤酵母真核表达系统可对表达的蛋白
进行翻译后加工和修饰，同时具有可快速利用碳源、
操作简单、生长快速、表达量高以及价廉等优点［7］，
广泛应用于目的蛋白的表达。本研究应用该系统对
EtCDPK3 进行表达，且对表达产物进行免疫原性分
析，旨在为进一步研究该蛋白的功能奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 质粒、菌种以及抗血清 大肠杆菌 TOP10
感受态细胞购自上海天根生物技术有限公司 ；载
体 pET28a-EtCDPK3 含柔嫩艾美耳球虫 CDPK3 基
因，由本实验室构建保存 ；PCR 检测引物 P1、P2
由上海赛百盛基因技术有限公司合成 ；酵母表达载
体 pPIC9K 和酵母菌株 GS115 由本实验室保存 ；兔
抗重组柔嫩艾美耳球虫 CDPK3 蛋白血清由本实验室
制备。
1.1.2 主要试剂 2×Taq PCR Master Mix、DL2000
DNA Marker，购自上海天根生物技术有限公司 ；
限制性内切酶 NotⅠ和 EcoRⅠ、T4 DNA 连接酶及
其 Buffer、D-生物素，购自大连宝生物工程有限公
司 ；DNA 琼脂糖回收试剂盒、质粒提取和纯化试剂
盒，购自上海捷瑞生物工程有限公司 ；考马斯亮蓝
R250、30% H2O2、Tween-20、甘油，购自上海化学
试剂采购供应站 ；YNB（无氨基酸和硫酸铵）培养
基购自碧迪医药器械（上海）有限公司 ；G418、D-
山梨醇购自 Invitrogen 公司 ；其他常规试剂均为国产
分析纯。
1.2 方法
1.2.1 引物设计及 EtCDPK3 基因的扩增 根据
EtCDPK3 编码核苷酸序列及酵母表达载体 pPIC9K
多克隆位点序列，设计一对含 EcoR Ⅰ和 NotⅠ酶
切位点的引物。P1: 上游引物 5-GCAGAATTCATGC-
AGCGAGCAGTCAAGACC-3（EcoRⅠ），P2: 下游引
物 5-GCAGCGGCCGCTCATTTGCTGCTCTTCTTTTT-
C-3（NotⅠ），按常规方法进行 PCR 扩增 pET28a-
EtCDPK3（本实验室构建）上的 EtCDPK3 基因。
PCR 扩增程序为：94℃ 3 min；94℃ 40 s，55℃ 40 s，
72℃ 90 s，35 个循环 ；72℃延伸 10 min。将 PCR 产
物电泳后，回收阳性 PCR 产物，并与 pGEM-T easy
载体连接、转化，再进行阳性克隆鉴定，并送上海
桑尼生物有限公司测序，获得 pGEM-T-EtCDPK3 克
隆菌株。
1.2.2 重组质粒 pPIC9K-EtCDPK3 的构建 按上海
捷瑞生物工程有限公司质粒小抽试剂盒的方法提取
重组质粒 pGEM-T-EtCDPK3，并用 EcoR Ⅰ和 NotⅠ
对载体 pPIC9K 和质粒 pGEM-T-EtCDPK3 分别进行
双酶切，37℃水浴锅中孵育 4 h，中止反应。电泳后
按上海捷瑞生物工程有限公司普通琼脂糖凝胶 DNA
回收试剂盒的方法回收纯化双酶切产物，取 2 μL 回
收产物电泳鉴定回收效率。载体和目的片段用 T4
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第4期110
DNA 连接酶在 16℃水浴锅中连接 18 h。
1.2.3 重组质粒的鉴定 将连接产物转化入大肠杆
菌 TOP10 感受态细胞（100 μL/支）中，均匀涂布
于含氨苄青霉素（0.1 mg/mL）的 LB 平板，37℃倒
置培养过夜，挑取生长良好的单菌落接种于 LB 培
养基中，37℃振荡培养过夜，抽提重组质粒，经酶
切和 PCR 鉴定后测序，获得 pPIC9K-EtCDPK3 重组
质粒。
1.2.4 重组质粒的转化和筛选 用限制性内切酶
SacⅠ分别酶切重组质粒 pPIC9K-EtCDPK3 和空质粒
pPIC9K，酚/氯仿法回收线性化质粒，-20℃保存备用。
依照 Invitrogen 公司试剂盒说明书提供的方法 （略作
改进）制备 GS115 感受态细胞，使用电脉冲方法转
化毕赤酵母，转化条件为电压 1.5 kV，电容 25 μF，
电阻 200 Ω，电击时间为 5 ms，电击完毕后立即加
入 1 mL 冰预冷的 1 mol/L 山梨醇溶液将菌体混匀，
转至 1.5 mL 离心管中，混匀菌体，涂布于组氨酸
缺陷培养基 MD 平板上，30℃培养 2 d 后出现菌落。
用无菌的牙签将 MD 平板上的各菌落分别点于含 2
mg/mL G418 的 YPD 平板上，30℃培养 2 d 长出菌落
后进行 PCR 鉴定，鉴定方法参照文献［8］。
1.2.5 重组酵母菌株的诱导表达 取两支试管各
加 4 mL YPD 培养基，分别接种筛选后含多拷贝
pPIC9K-EtCDPK3 质粒的 GS115 和转化后 MD 平板
上长出的空载体菌，30℃振荡培养 24 h。各取 1 mL
接种到 50 mL 以甘油为碳源的 BMGY 培养基，30℃
培养。当 OD600 值为 10-20 时，离心，弃上清，加
入到以甲醇为碳源的 50 mL BMMY 培养基中诱导表
达，30℃，180 r/min 振荡培养，每 24 h 添加 1% 甲
醇（0.5 mL），并收集 24、48、72 和 96 h 的上清。
1.2.6 表达产物的SDS-PAGE分析 分别吸取40 μL
经 24、48、72 和 96 h 的酵母表达上清，加入 10 μL
的 5×SDS 样品缓冲液，100℃煮沸 6 min，吸取 20 μL
样品进行 SDS-PAGE 分析，并取空载体菌液作为阴
性对照。
1.2.7 表达产物的 Western blotting 分析 采用湿法
将 SDS-PAGE 中的蛋白转至 PVDF 膜上，以兔抗重
组 EtCDPK3 蛋白多克隆抗体作为一抗，辣根过氧化
物酶标记的羊抗兔 IgG 为二抗，DAB 显色至目的条
带清晰时终止反应。
2 结果
2.1　EtCDPK3基因的克隆
以重组质粒 pET28a-EtCDPK3 为模板，进行
PCR 扩增，得到大小约 1 300 bp 的基因片段（图 1）。
经克隆得到 pGEM-T-EtCDPK3 重组菌，测序鉴定，
所得基因序列与理论相符。
M.DL2000 标准分子量 ；1.pET28a-EtCDPK 的 PCR
扩增产物 EtCDPK 基因
图 1 pET28a-EtCDPK的 PCR扩增产物
2.2　重组表达载体的构建和鉴定　
将构建的表达载体 pPIC9K-EtCDPK3 用 EcoR Ⅰ
和 Not Ⅰ双酶切，获得约 9 300 bp 和 1 300 bp 左
右的两条片段，与预期大小一致。同时对空载体
pPIC9K 进行双酶切，得到 9 300 bp 左右的一条带（图
2）。重组菌 PCR 鉴定与预期大小 1 300 bp 相符，证
实重组质粒 pPIC9K-EtCDPK 构建成功（图 3）。
2.3 EtCDPK3的诱导表达
取 24、48、72 和 96 h 的酵母表达上清，进行
SDS-PAGE 电泳及考马斯亮蓝染色，结果（图 4）显
示与空质粒相比，重组菌诱导表达液在分子量蛋白
约 49 kD 处有明显的条带出现，与预期 49.3 kD 大
致相符。随着诱导时间的增加，蛋白条带逐渐加深，
48 h 达到最大，72 h 和 96 h 基本稳定。
2.4 表达产物的Western blotting 检测
表达产物进行 Western blotting 分析，结果（图
5）显示，在约 49 kD 处出现了一条特异性条带，说
明该蛋白在毕赤酵母细胞中成功表达，且蛋白能与
兔抗 EtCDPK3 血清发生免疫反应，证实表达的蛋白
具有良好的抗原性。
3 讨论
顶复器原虫（疟原虫、弓形虫等）的钙依赖蛋
2012年第4期 111孔春林等 ：柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶 3 基因在毕赤酵母中的表达及分析
白激酶（CDPKs）对虫体入侵宿主细胞以及虫体在
宿主体内的发育繁殖起重要作用［9］。这些顶复器原
虫都拥有各自复杂的分子信号通路和效应分子以入
侵宿主细胞，在宿主细胞内形成带虫空泡，掠夺宿
主细胞养分去满足这些原虫本身的生长发育需要。
而细胞质中的 Ca2+ 浓度是虫体入侵宿主所必需的，
钙依赖蛋白激酶调控着顶复器原虫的运动以及对宿
主细胞的黏附和入侵。鸡球虫与疟原虫和弓形虫同
属顶复器原虫，鸡球虫的 CDPKs 也很可能在入侵宿
主细胞过程中发挥重要功能。由于 CDPKs 在顶复器
原虫的细胞周期调控和生活史的进程中具有重要的
功能，而且在脊椎动物体内没有发现 CDPKs，因此
顶复器原虫（包括鸡球虫）的 CDPKs 分子将来很可
能作为新治疗药物的靶标和研制新型疫苗的靶分子。
Dunn 等［10］在柔嫩艾美耳球虫子孢子阶段和巨
型艾美耳球虫（E. maxima）孢子化卵囊阶段发现了
一种钙依赖性蛋白激酶（EtCDPK1 和 EmCDPK1），
将柔嫩艾美耳球虫子孢子接种到体外培养的靶宿主
细胞中后，EtCDPK1 很快集中于子孢子顶部的丝状
结构中，一旦子孢子进入宿主细胞，在宿主细胞膜
子孢子入侵处可发现滞留的 EtCDPK1，该现象显示
EtCDPK1 可能在子孢子入侵宿主细胞时起着特殊的
作用，但其功能还没有得到进一步验证。这个结果
为球虫病的防治提供了一条新思路，如果能抑制子
孢子入侵鸡肠上皮细胞，就能够阻断球虫的生活史，
从而达到预防和治疗球虫病的目的。同时，周建民
等［11］也研究发现柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶
在虫体入侵宿主细胞时起着关键性的作用，具有较
好的免疫原性，可作为新型疫苗研究的候选抗原。
作为鸡柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶家族
（EtCDPKs）中的一种，本实验室获得的柔嫩艾美耳
球虫钙依赖蛋白激酶 3（EtCDPK3）在顶复器原虫的
M. DL2000 标准分子量 ; 1. pPIC9K-EtCDPK
重组质粒 PCR 鉴定
图 3　重组质粒 PCR分析鉴定
M. 蛋白质分子质量标准 ; 1. 诱导的 GS115-pPIC9K 对照 ;
2-5. 分别为诱导 24、48、72 和 96 h 的上清
图 4 pPIC9K-EtCDPK表达产物的 SDS-PAGE分析
M. 预染的蛋白质标准分子量 ; 1. pPIC9K 空载体空白对照 ; 2. 目的蛋白
图 5 表达产物的Western blotting分析
M. DL2000 标准分子量 ; 1. pPIC9K-EtCDPK 重组质粒用 EcoR Ⅰ、
NotⅠ双酶切分析 ; 2. pPIC9K 空载体用 EcoR Ⅰ、NotⅠ双酶切分析
图 2 重组质粒和空载体双酶切分析鉴定
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第4期112
细胞周期调控和生活史的进程中也很可能具有重要
的功能。因此，获得有活性的天然 EtCDPK3 蛋白，
是进行下一阶段研究的重要前提，而对 EtCDPK3 进
行体外分泌表达则是获得可溶天然蛋白的一个重要
途径。
本试验采用的是组氨酸脱氢酶缺陷型毕赤酵母
GS115，表型 His-Mut+，即 His4 基因发生了突变，
不能合成组氨酸脱氢酶。而采用的 pPIC9K 载体含
有与 GS115 染色体 DNA 同源的乙醇氧化酶（AXO1）
序列和完整的 His4 基因，二者可发生同源重组，利
用基因互补作用，合成组氨酸脱氢酶，可在不含组
氨酸的 MD 培养基中生长。并能利用 AXO1 基因的
甲醇诱导型强启动子，表达外源基因［12, 13］。外源基
因稳定的整合在酵母基因组上，高效分泌表达外源
蛋白后，能对其进行翻译后加工修饰，分泌到细胞
外，既保证了表达蛋白的活性，又有利于蛋白的纯
化。同时，该菌株只需要甲醇诱导，操作简单方便，
价格低廉，且外源蛋白表达量高，优点非常明显。
赵金国等［14］采用毕赤酵母系统表达小亚璃眼
蜱（Hyalomma anatolicum）4D8 基因时，发现外源
分子的表达量与诱导表达时间、pH 值和诱导甲醇的
浓度密切相关。因此，本试验也采用改变上述条件
的方式，得到了较为优化的表达条件，在 pH7.0、1%
甲醇的BMMY培养基中诱导48 h后蛋白量达到最大，
到 96 h 时，仍然维持该表达量不变。至于继续诱导
是否会出现蛋白糖基化、杂蛋白增多等其他现象，
有待继续深究。
4 结论
本试验成功构建了鸡柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋
白激酶 3（EtCDPK3）毕赤酵母分泌型重组表达载体，
采用毕赤酵母真核表达系统对 EtCDPK3 成功进行表
达，筛选了表达该基因水平较高的工程菌，初步优
化了表达条件，为后期进一步研究 EtCDPK3 的功能、
寻找鸡球虫病新治疗药物的靶标和新型疫苗的靶分
子奠定基础。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）