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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(8):200-205
肿瘤免疫逃逸是阻碍抗肿瘤免疫治疗的一大障
碍，巨噬细胞通过其表面表达的 Fc 受体对包括肿瘤
在内的靶细胞行使吞噬作用，是抗体发挥细胞毒作
用（antibody dependent cell-mediated cytotoxicity，AD-
CC）的主要效应细胞。在抗肿瘤免疫反应中，巨噬
细胞发挥吞噬作用涉及巨噬细胞识别靶细胞表面的
促吞噬（“eat me”）和抗吞噬（“don’t eat me”）信
号［1］。巨噬细胞及树突状细胞表面表达信号调节蛋
收稿日期 ：2014-11-24
基金项目 ：国家自然科学基金项目（31370933）
作者简介 ：贾二坷，女，硕士，研究方向 ：生物化学与分子生物 ；E-mail ：erkejia@sina.com
通讯作者 ：李江伟，男，博士，教授，研究方向 ：分子免疫学 ；E-mail ：jwli67@sina.com
抗 CD47 胞外区骆驼多克隆抗体的制备及鉴定
贾二坷  冯亚宁  李江伟
（新疆大学生命科学与技术学院 新疆生物资源基因工程重点实验室，乌鲁木齐 830046）
摘 要 ： 验证人 CD47 蛋白能否在新疆双峰驼中产生高滴度抗体 ；为制备高亲和力的抗 CD47 纳米抗体提供实验依据。 构建
CD47 胞外区原核表达载体，诱导表达及纯化 CD47 蛋白，免疫新疆双峰驼。通过酶联免疫吸附试验（ELISA）和 Western blot 分别
检测骆驼多克隆抗体的效价及与 CD47 蛋白特异性结合活性。结果显示，成功构建 CD47 胞外区原核表达载体，获得纯度大于 90%
的 CD47 蛋白，表达纯化的 CD47 重组蛋白可与抗 CD47 单抗 B6H12.2 特异结合 ；ELISA 测定 CD47 重组蛋白免疫骆驼 7 次后，抗
CD47 多克隆抗血清的效价至少达到 1∶200 000，免疫印迹检测表明抗 CD47 骆驼抗血清与 CD47 重组蛋白、Jurkat 和 Raji 细胞表
面表达的 CD47 均能特异结合。 重组人 CD47 蛋白可以在骆驼体内激发高滴度抗体反应。
关键词 ： CD47 ；多克隆抗体 ；新疆双峰驼 ；纳米抗体
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.08.029
Preparation and Identification of Polyclonal Antibody Against CD47
Derived from Camel
Jia Erke Feng Yaning Li Jiangwei
（Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering，College of Life Science and Technology，Xinjiang University，
Urumqi 830046）
Abstract: This work aims to verify whether or not recombinant human CD47 would induce high antibody response in Xinjiang Camelus
bactrianus, and provide the experimental evidences for preparing anti-CD47 nanobody of high affinity. The gene segment of CD47 extracellular
region was amplified by PCR and ligated into pET30a plasmid, and a prokaryotic expression vector was constructed. The recombinant CD47
protein (rCD4) was expressed by IPTG induction and purified with Ni-affinity chromatography. A male C. bactrian camel was immunized with
purified rCD47 antigen. The enzyme-linked immunosorbent (ELISA) and Western blotting were applied to assay the titer of polyclonal antibody
and the specific binding to CD47 protein. The purified rCD47 of high purity (90%) from prokaryotic expression vector of CD47 extracellular
region bound specifically with B6H12.2 of anti-CD47. The ELISA results revealed that the titer of polyclonal anti-CD47 antibody in camel at
least reached 1:200000 after the 7th immunization. The Western blotting results demonstrated that camel antiserum of resisting CD47 specifically
bound with rCD47, and CD47 on membrane of Jurkat and Raji cells. In conclusion, the anti-CD47 polyclonal antibodies of high titer were raised
in camel and it lay a promising foundation for the future experiment.
Key words: CCD47 ；polyclonal antibody ；Bactrian camel ；nanobody
2015,31(8) 201贾二坷等：抗 CD47 胞外区骆驼多克隆抗体的制备及鉴定
白 α（Signal regulatory protein alpha，SIRPα）， 与 一
种广泛表达的跨膜蛋白 CD47 结合［2］，使得巨噬细
胞启动抗吞噬信号，从而避免了对正常细胞的攻击。
CD47 又叫整合素相关蛋白（integrin associated
protein，IAP），是一个 50 kD 的膜表面蛋白，表达广
泛，属于免疫球蛋白超家族成员，具有 IgV 样胞外
结构域和 5 个跨膜区以及 1 个短的胞质尾［2］。CD47
可以结合整合素和凝血栓蛋白 -1（thrombospondin-1，
TSP-1），参与多种生理和病理过程，包括细胞迁
移［3］，T 细胞和 DC 的激活［4］以及轴突发育、细胞
凋亡、增殖和炎症等。最近一系列研究报道抗 CD47
单克隆抗体可以阻断 CD47-SIRPα 信号通路，激活
巨噬细胞的吞噬作用，在白血病和淋巴瘤以及肿瘤
和实体瘤肿瘤动物模型中，都取得了良好的治疗效
果［5-10］，表明 CD47 可以作为肿瘤治疗的理想靶点。
目前抗 CD47 的抗体研究主要集中在单克隆抗
体。然而，大分子的单克隆抗体具有组织（如实体
瘤）的穿透能力差、且难以结合位于细胞表面的蛋
白裂隙中的表位（如受体和配体结合部位）的缺点。
另外还有生产和储存成本高、价格昂贵等因素限制
了这类药物在临床的广泛使用。
纳米抗体是 1993 年发现的一种仅存在于骆驼
科动物中的天然重链抗体的可变区结构（variable
domains of the HCAb，简称为 VHH）［11］，其分子量
为 15 kD，仅为全分子抗体的 1/10，分子大小在纳米
级，是目前可以得到的具有完整抗体功能的最小分
子片段。这种纳米抗体的抗原结合区具有与常规单
抗不同的结构［12］，在空间上呈突出的指状结构，因
此可以结合一些常规抗体无法接近的抗原表位，如
位于受体裂隙中的配体结合部位［13］。这使得这类抗
体具有较大的应用价值。
本研究为验证 CD47 重组蛋白能否在骆驼中激
发高滴度的特异抗体，从而为构建骆驼淋巴细胞重
链抗体基因表达文库提供材料，我们采用原核表达
的人 CD47 胞外区片段作为抗原免疫骆驼，并检测
骆驼免疫 CD47 后的体液免疫水平，以及骆驼多克
隆抗体与 Jurkat、Raji（均高表达 CD47 蛋白［7，14］）
细胞表面表达的 CD47 蛋白的特异结合，为今后制
备抗 CD47 的纳米抗体，进而研究其抗肿瘤作用提
供实验基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料 CD47 的 cDNA 购自 Sino Biologicai
Inc ；DH5α 感受态细胞，BL21（DE3）感受态细胞
购自天根生化科技（北京）有限公司。雄性新疆双
峰驼一头，1 年龄，本地区饲养。Raji 细胞购自长
沙赢润生物技术有限公司，Jurkat 细胞由暨南大学
生命科学技术学院馈赠。
1.1.2 试 剂 Ex Taq polymerse， 限 制 性 内 切 酶
BamH Ⅰ、EcoRⅠ，T4 ligation 购自宝生物工程（大
连）有限公司 ；质粒小提试剂盒、琼脂糖凝胶回
收试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司 ；Ni
SepharoseTM 6 Fast Flow 购自 GE Healthcare 公司 ；胎
牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自 Life Science
公司，Bradford 法蛋白定量试剂盒购自北京百泰克生
物技术有限公司 ；Mouse anti-CD47 IgG（B6H12）购
自 BD 公司（中国）；Rabbit anti-Llama IgG（H&L），
Affinity Pure 购自 ImmunoReagents，Inc ；抗 His 标签
鼠源单克隆抗体，山羊抗鼠 IgG（H&L）-HRP，山
羊抗兔 IgG（H&L）-HRP 购自康为世纪 ；完全弗式
佐剂及不完全弗式佐剂购自 Sigma（中国）；细胞膜
抽提试剂盒购自碧云天公司 ；BeyoECL 显色液购自
Beyotime 公司 ；其他常规试剂为进口或国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 CD47 胞外区的扩增 将含有 CD47 的 cDNA
的质粒转化至 DH5α 感受态细胞，通过培养细菌，
提取质粒，作为 PCR 扩增 CD47 胞外区基因序列扩
增的模板。根据 CD47 胞外区碱基序列设计引物 ：
P1 ：5-CCGGATCCCAGCTACTATTTAATAAAAC-3
（下划线为含有 BamH Ⅰ酶切位点）；P2 ：5-CCCT
CGAGGATTTTATAGCACAACAAAGT-3，（下划线为
EcoR Ⅰ酶切位点）。PCR 反应体系 ：ddH2O 13.5 μL，
dNTP 2 μL，10×Ex Taq buffer 2 μL，P1 0.3 μL，P2、
0.3 μL，TaKaRa Ex Taq 0.3 μL， 质 粒 ：1 μL， 共 20
μL。PCR 反应条件：95℃ 5 min；95℃ 35 s，61℃ 35 s，
72℃ 35 s，35 个循环 ；72℃ 7 min。PCR 产物经琼
脂糖凝胶电泳回收纯化。
1.2.2 原核表达质粒的构建和鉴定 回收纯化的目
的片段用 BamH Ⅰ和 EcoR Ⅰ限制性内切酶进行双
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.8202
酶切。同时活化 DH5α-pET30a 菌种，挑取单克隆，
提取质粒，用同样的限制性内切酶酶切 pET30a。回
收酶切的目的片段和载体经 T4 连接酶 16℃过夜连
接。最后连接产物转化至大肠杆菌 DH5α 感受态细
胞。挑取转化的阳性克隆提取质粒，进行酶切和基
因测序鉴定，重组质粒命名为 DH5α-pET30a-CD47。
1.2.3 CD47 蛋白的原核表达纯化及鉴定 将测序
正确的重组质粒转化至 BL21（DE3）感受态细胞，
37℃培养过夜 ；次日扎取单克隆，菌液 PCR 鉴定，
按 1% 接菌到 10 mL 含有终浓度为 50 μg/mL 卡那霉
素的 LB 培养基中，220 r/min 震荡 4 h ；加 IPTG 使
终浓度为 1 mmol/L 诱导 4 h，取样经 SDS-PAGE 检
测蛋白的表达。同时用 Western blot 检测诱导所得蛋
白 ：一抗分别为抗 His 标签鼠源单克隆抗体，Mouse
anti-CD47 IgG，稀释比例均为 1∶2 000 ；二抗为山
羊 抗 鼠 IgG（H&L）-HRP；稀 释 比 例 为 1 ∶5 000，
ECL 显 色，Las4000 检 测。 大 量 培 养 和 诱 导 BL21-
pET30a-CD47，用镍亲和层析柱纯化。
1.2.4 CD47 蛋白免疫新疆双峰驼 纯化的 CD47 蛋
白经 Bradford 法测定浓度约为 0.9 mg/mL。用纯化的
蛋白免疫新疆双峰驼 ：每次免疫的量为 0.44 mg，第
一次免疫使用等体积的完全弗式佐剂，之后的 6 次
加强免疫时加等量的不完全弗式佐剂，每 14 d 免疫
1 次，共免疫 7 次，采集免疫前和免疫后的骆驼血
清，-20℃保存备用。
1.2.5 ELISA 检测多克隆抗体的效价 rCD47 蛋白
在 96 孔板中 4℃包被过夜。对免疫前、后的骆驼血
清，进行倍比稀释，作为一抗测定骆驼血清抗 CD47
蛋白的血清效价。二抗为兔抗美洲驼 IgG（H ＆ L），
稀释比例为 1∶3 000 ；采用 HRP-羊抗兔 IgG（H ＆
L）作为检测抗体（稀释比例为 1∶5 000）。底物为
TMB，采用 ECL 检测，酶标仪中测定 540 nm 吸光值。
1.2.6 Western blot 检测多克隆抗体与细胞表面表达
CD47 的结合 将 Jurkat 细胞接种于含 10% FBS 的
1640 培养基中，37℃，5.0% CO2 培养。收集 3×10
7
个 Jurkat 细胞，利用细胞膜提取试剂盒抽提 Jurkat
细胞膜蛋白。用分离胶浓度为 12% 的 SDS-PAGE 分
离蛋白，使用 PVDF 膜转膜，转膜条件为 90 V，1 h。
骆驼源多克隆抗体、Mouse anti-CD47 IgG（B6H12.2）
为 一 抗 ；Rabbit anti-Llama IgG（H&L）、 山 羊 抗
鼠 IgG（H&L）-HRP 分 别 为 二 抗 ；山 羊 抗 兔 IgG
（H&L）-HRP 为三抗。ECL 显色，Las4000 检测。
2 结果
2.1 PCR扩增CD47胞外区基因片段
将 pGEM-CD47 质粒作为模板，用 CD47 特异引
物扩增该基因片段。CD47 胞外区片段大小为 363 bp
（图 1）。
5000
bp
M C 1 2 3 4
3000
2000
1500
1000
750
500
250
100
M ：DNA 分子量标准 ；C ：阴性对照 ；1-4 ：PCR 扩增 CD47 基因片段
图 1 PCR 扩增 CD47 胞外区基因片段
2.2 重组质粒pET30a-CD47的构建与鉴定
用限制性内切酶 BamH Ⅰ和 EcoR Ⅰ对重组质
粒 pET30a-CD47 进行双酶切，出现一条线性载体条
带和一条 363 bp 的目的条带（图 2），将酶切鉴定正
确的重组质粒测序，结果表明插入的目的基因核苷
酸序列完全正确。
5000
10000
bp
1 M
3000
2000
1500
1000
750
500
250
M ：DNA 分子量标准 ；1 ：BamHⅠ/EcoRⅠ双酶切 pET30a-CD47
图 2 重组表达质粒双酶切分析
2.3 CD47的原核表达及融合蛋白的纯化
将阳性克隆的重组子小量扩增后，用 1 mmol/L
的 IPTG 诱导，得到 22 kD 的重组蛋白（图 3），蛋
2015,31(8) 203贾二坷等：抗 CD47 胞外区骆驼多克隆抗体的制备及鉴定
白大小符合预期分子量。且经 Western blotting 检测
（图 4-B），鉴定所得蛋白为 CD47。进一步大量诱导
菌体，经超声破碎后，检测到重组蛋白以包涵体形
式表达。沉淀用含 4 mol/L 尿素的 Tris-HCl 溶解，通
过镍亲和层析之后，重组蛋白纯度可达 90% 以上。
加强免疫后第 4 天收集的血清，通过 ELISA 测定抗
体的效价。抗原 CD47 蛋白的包被量为 5 μg/孔 ；骆
驼来源的血清按 1×103、2×103、1×104、2×104、
1×105 和 2×105 梯度稀释。结果（图 5）表明骆驼
来源的抗体效价至少为 1∶200 000。
66.2
116.0
kD
1 2 3 4 65M
45.0
35.0
25.0
18.4
14.4
M ：蛋白 Marker ；1 ：未诱导的菌体蛋白 ；2 ：诱导后的菌体总蛋白 ；3 ：超
声破碎、12 000 r/min，10 min 离心后的上清蛋白 ；4 ：超声破碎，离心后，
用含 4 mol/L 尿素的 Tris-HCl 缓冲液溶解沉淀后的上清蛋白 ；5 ：纯化 CD47
蛋白过程中，最后一次洗涤杂蛋白的流川 ；6 ：纯化后的 CD47 蛋白
图 3 SDS-PAGE 检测 CD47 蛋白表达
2.4 CD47蛋白的鉴定
通过 Western blotting 检测重组蛋白 CD47。结
果（图 4-A）显示，纯化的 CD47 蛋白与抗 His 标签
的单克隆抗体特异结合。经 1 mmol/L IPTG 诱导 4 h
的菌体总蛋和纯化的 CD47 蛋白均可与 Mouse anti-
CD47 IgG 结合（图 4-B），而不与未诱导的菌体总蛋
白结合。
1 2
26
kD
M 3 4 5
17
A B
M ：蛋白 Marker ；1 ：未诱导的菌体蛋白 ；2 ：纯化的 CD47 蛋白 ；
3 ：未诱导的菌体蛋白 ；4 ：纯化的 CD47 蛋白 ；5 ：IPTG 诱导后，菌
体及 CD47 粗蛋白
图 4 Western blotting 检测 CD47 蛋白
2.5 抗体效价的测定
利用重组蛋白免疫新疆双峰驼，获得了抗 CD47
的骆驼源多克隆抗体。取免疫前的血清和最后一次
102 103 104㹰␵⎃ᓖ 105 1060.00.20.40.60.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8 ݽ⯛ਾݽ⯛ࡽ
O
D
45
0
图 5 ELISA 测定骆驼来源抗 CD47 抗体的效价
2.6 Western blotting鉴定骆驼多克隆抗体与CD47
的结合
Western blotting 结果（图 6）表明，与抗 CD47
单抗 B6H12.2 一样，骆驼多克隆抗体既能与重组的
CD47 蛋白结合，也能与 Jurka、Raji 细胞表面 CD47
蛋白特异性结合。而未免疫的血清（图 6-A 泳道 1，
6-B 泳道 3 和 4）与重组 CD47 和细胞表面表达的
CD47 均不结合。
1M
26
kD
17
2
3 4 5 6 7 8
A
B ᵚݽ⯛㹰␵ ݽ⯛㹰␵ B6H12.2অᣇ
M：蛋白 Marker；1：未免疫血清；2：免疫血清；3，5，7：Jurkat 细胞膜提取物；
4，6，8 ：Raji 细胞膜提取物
图 6 Western blotting 检测骆驼多抗与 rCD47（A）和细
胞表面 CD47 蛋白（B）的结合
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.8204
3 讨论
新疆双峰驼属于骆驼科骆驼属，该属目前仅
存两种。除广泛分布于我国新疆、青海、内蒙等地
以及蒙古的双峰驼外，还有分部于中亚地区和非
洲北部的单峰驼。由于新疆双峰驼饲养方式多为
放养，给免疫操作带来了困难。另外，根据我们
和国外研究者的经验，并不是所有抗原都能在骆
驼中激发高滴度抗体反应。Daley［15］ 发现，感染
Parelaphostrongylus tenuis 寄生虫的美洲驼不能产生
保护性的抗体反应。为了获得高水平的抗 CD47 骆
驼 IgG，尤其是重链亚型的抗体，有必要分析其体
液免疫水平。本研究采用重组 CD47 胞外区蛋白，
经过对骆驼 7 次免疫后，在骆驼外周血中检测到了
高滴度的抗 CD47 IgG 抗体（1∶200 000），表明免
疫策略是成功的，重组表达的 CD47 抗原在骆驼中
具有较强的免疫源性。
CD47 为 5 次跨膜蛋白，其氨基端 116 个氨基酸
为胞外 Ig 样结构域，是结合 SIRPα 的主要区域［16］，
该区域也是抗体结合的主要位点。因此，本研究克
隆和表达了这部分序列，作为免疫用抗原。但在最
初大肠杆菌中表达人 CD47 胞外区蛋白时，表达量
极低甚至不表达。考虑到大肠杆菌密码子的偏好
性，我们对 CD47 的密码子进行了优化。优化后的
CD47 基因在大肠肝菌中获得了较高水平的表达，满
足了免疫骆驼的要求。另外，尽管骆驼属于体型高
大的动物，但国外报道用于免疫的抗原的剂量最少
可低至 50 μg/ 次［17］。本实验采用抗原剂量为 0.44
mg/ 次，皮下单点或多点注射，激发了较高的抗体
反应。今后在免疫骆驼时还可以对免疫用抗原剂量
进行优化，以最大限度减少抗原的用量，并获得高
水平的抗体反应。
4 结论
本研究采用原核表达，并经过密码子优化后
的人 CD47 胞外区抗原可以在骆驼体内诱导高滴度
的抗体反应，免疫后的新疆双峰驼血清特异性结合
CD47 蛋白，可用于后续抗体基因文库的构建。免疫
印迹检测表明抗 CD47 骆驼抗血清也可与 Jurkat 和
Raji 细胞表面高表达的 CD47 特异结合，表明新疆
双峰驼是获得重链抗体的可靠宿主，也是制备重链
抗体库的良好材料。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）