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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第4期
收稿日期 : 2011-11-09
基金项目 : 国家公益性行业科研专项（201104023）
作者简介 : 乔中全 , 男 , 硕士研究生 , 研究方向 : 植物分子生物学 ; E-mail: qiaozhongquan110@163.com
通讯作者 : 何钢 , 男 , 教授 , 研究方向 : 生物技术教学与科研 ; E-mail: hegang262@163.com
金银花黄酮醇合成酶基因全长克隆及其序列分析
乔中全1 何钢1 王晓明2 王薇薇1
（1 中南林业科技大学生命科学与技术学院，长沙 410004 ；2 湖南省林业科学院，长沙 410004）
摘 要： 根据已知的其它物种黄酮醇合成酶 cDNA保守序列设计引物，用 RT-PCR技术从金银花叶片中扩增获得黄酮醇合成
酶基因部分 cDNA序列，再用 RACE技术获得其两端序列。序列拼接得到完整的 1 248 bp的黄酮醇合成酶基因，根据获得的序列，
设计引物扩增获得 1 001 bp的开放阅读框，编码 333个氨基酸。序列分析显示，金银花黄酮醇合成酶与烟草、马铃薯和桔梗的同
源性分别为 86%、83%和 80%，与其它物种的同源性也在 80%左右，表明不同物种中黄酮醇合成酶基因具有高度同源性。
关键词： 金银花 黄酮醇合成酶基因 RT-PCR RACE 序列分析
Cloning and Sequence Analysis of Flavonol Synthase Gene from
Lonicera japonica
Qiao Zhongquan1 He Gang1 Wang Xiaoming2 Wang Weiwei1
（1College of Biological Science & Technology，Central South University of Forestry and Technology，Changsha 410004；
2Hunan Forestry Academy，Changsha 410004）
Abstract: A pair of primers were designed according to the conserved cDNA sequence of flavonol synthase（FLS） gene of other species
and partial cDNA sequence of FLS was cloned from Fonicera japonica leaves using RT-PCR and RACE. The results indicated that the full length
cDNA sequence of FLS was 1 248 bp and it included an open reading frame （ORF） which encoded 333 amino acids. Sequence analysis showed
that the homologies of FLS cDNA from Fonicera japonica with Nicotiana tabacum, Solanum tuberosum and Platycodon grandiflorus were 86％ ,
83％ , 80％ and among the others were about 80％ ,which revealed that the FLS gene kept highly conserved among different species.
Key words: Lonicera japonica Flavonol synthase gene RT-PCR RACE Sequence analysis
黄酮类化合物（Flavonoids）又称生物类黄酮
（Bioflavonoids）或黄酮，是一大类天然次生代谢物，
广泛存在于各种陆生植物中［1］。根据对中心 C 环的
不同修饰，可分为异黄酮、黄酮、黄酮醇、黄烷酮、
黄烷醇和花青素等主要大类。已鉴定和报道的黄酮
类化合物种类总数达 6 000 多种［2］，常常以游离态
或与糖苷结合形成种类繁多，构型复杂，生物学功
能丰富的衍生物。黄酮类化合物在植物基础代谢中
发挥极为重要的作用，能使花、果实和种子形成不
同的颜色，以此吸引传播花粉和种子的昆虫及动物。
同时，又具有保护植物体免受紫外辐射伤害［3］、抵
御微生物病虫害、影响植物的生育力和花粉萌发率［4］
等功能。
黄酮醇类化合物占黄酮类化合物总数的 1/3 左
右，约有 2 000 多种。它是在黄酮醇合成酶（flavonol
synthase，FLS）的催化下，由由二氢黄酮醇转变而成。
一般具有较强抗氧化作用［5］、保护心血管作用、抗
炎、抗癌等作用。黄酮醇合成酶作为黄酮类合成途
径与儿茶素合成途径的桥梁，在植物中高度保守［6］，
它催化黄酮结构中的 C3 位羟基化，从而形成各种
黄酮醇类物质。Britsch 等［7］用从欧芹细胞中提取的
酶作用于二氢黄酮醇，第一次体外检测到二氢黄酮
醇转变为黄酮醇。Holton 等［8］根据双加氧酶的保守
序列设计简并引物， 用 PCR 的方法从矮牵牛中分离
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第4期64
出 FLS 编码基因。之后人们又从高杯花、月季、苹
果和金鱼草［9］等物种中分离得到 FLS 基因。随着
人们对黄酮类代谢途径认识的不断加深，利用生物
技术手段调控其生物合成途径的报道也越来越多，
Nielsen 等［10］利用基因沉默技术抑制 FLS 基因，是
花卉颜色有紫色变为红色，并能稳定遗传。
本研究根据其它物种中 FLS 基因 cDNA 的保守
序列设计引物，采过 RT-PCR 和 RACE 的方法，从
金银花（Lonicera japonica）叶片中分离得到 FLS 基
因的全长 cDNA 序列。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料 试验所用的“金萃蕾”金银花叶片，
采自湖南省林业科学院实验林场，叶片用装有冰袋
的泡沫盒带回，用去离子水清洗干净，-80℃冰箱保
存备用。
1.1.2 药品与试剂 RNA 提取试剂 Trizol 购自 Invi-
trogen 公司。反转录酶购自 Fermentas 公司。RACE
试剂盒购自 Clontech 公司，胶回收试剂盒购自
Omega 公司，Taq聚合酶、DNA Marker 及其它试剂
均购自宝生物工程（大连）有限公司。
1.1.3 菌株与载体 大肠杆菌（Escherichia coli）DH-
5α 购自天根生化科技（北京）有限公司。pMD18-T
载体购自宝生物工程（大连）有限公司。
1.2 方法
1.2.1 金银花叶片总 RNA 提取及纯化 金银花叶片
总 RNA 提取，按照 Invitrogen 公司 Trizol 说明书进行，
冰浴环境提取的 RNA 质量比室温下提取的 RNA 质
量好。电泳检测结果显示所提取的 RNA 有 DNA 和
蛋白质污染，需要对 RNA 进行纯化，其纯化方法
完全按照 Promega 公司的 RNA 纯化试剂盒操作说明
进行。
1.2.2 金银花叶片 FLS 保守区的克隆 cDNA 的
合成采用 Fermentas 公司的 RevertAidTM First Strand
cDNA Synthesis 反转录试剂盒进行，其操作方法完全
按照试剂盒说明书进行。
RT-PCR 扩增，其体系为 25 μL ：2.5 μL 10×LA
PCR 缓冲液（含 Mg2+），2.5 μL 10 mmol/L dNTP，20
mmol/L 上下游引物各 1.0 μL，Taq DNA 聚合酶 2.5 U，
以 2.0 μL 的反转录产物为模板，加双蒸水至 25 μL。
PCR 扩增程序为 94℃预变性 5 min，94℃变性 45 s，
47℃退火 30 s，72℃延伸 1 min，30 个循环，4℃保存。
反应结束，经电泳检测，确认 PCR 产物，凝胶成像
仪拍照。
1.2.3 3和 5RACE 3和 5RACE 采用 Clontech 公
司的 SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit 进行，
完全按照试剂盒操作说明进行试验操作。
3RACE 反应体系为 50 μL ：34.5 μL PCR-Grade
Water，5.0 μL 10×Advantage 2 PCR Buffer，1.0 μL
dNTP Mix （10 mmol/L），1.0 μL 50×Advantage 2
Polymerase Mix，2.5 μL 3-RACE-Ready cDNA，1.0 μL
3GSP2（20 mmol/L）。PCR 扩增程序为 94℃预变性
5 min，94℃变性 45 s，58℃退火 30 s，72℃延伸
1 min，35 个循环，4℃保存。反应结束，经电泳检测，
确认 PCR 产物，凝胶成像仪拍照。
5RACE 反应体系为 50 μL ：34.5 μL PCR-Grade
Water，5.0 μL 10×Advantage 2 PCR Buffer，1.0 μL
dNTP Mix （10 mmol/L），1.0 μL 50×Advantage 2
Polymerase Mix，2.5 μL 5-RACE-Ready cDNA，1.0
μL 5GSP2（20 mmol/L）。PCR 扩增程序为 94℃预变
性 5 min，94℃变性 45 s，51℃退火 30 s，72℃延伸
1 min，35 个循环，4℃保存。反应结束，经电泳检测，
确认 PCR 产物，凝胶成像仪拍照。
1.2.4 PCR 产物回收及测序 PCR 产物回收采用
Omega 公司的 E.Z.N.ATM Gel Extraction Kit，完全按操
作说明进行。经 1.2% 琼脂糖凝胶电泳检测，回收目
的片段，连接 T 载体，转化大肠杆菌 DH5α 随机挑
取 5 个阳性转化子做菌落 PCR 鉴定，测序有金斯瑞
生物科技公司完成。
1.2.5 序列分析 用 Vector NTI Advance 10 进行序
列拼接和开放阅读框（Open Reading frame ORF）寻找，
拼接后的序列进行 BLAST 相似性比较，用 Vector
NTI Advance 10 进行序列比对分析。
2 结果
2.1 金银花叶片总RNA提取及纯化检测
提取、纯化后的金银花叶片总 RNA，经核酸
蛋白测定仪测定、分析，所提取总 RNA 的 OD260/
OD280=1.96，OD260/OD230=2.21，说明 RNA 样品中，没
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有蛋白质、酚类及其它小分子物质的污染，纯度较高。
取 5 μL 经电泳检测显示结果，如图 1 显示 28S、
18S 的带型整齐清楚，且 28S rRNA 的亮度大约是
18S rRNA 的 2 倍。说明分离得到的总 RNA 较完整，
没有发生降解。可以满足后续 RT-PCR、RACE 试验
需要。
特异性上游引物 3GSP1：5-CAGCAGGTGGTGAAGA-
AATA-3、3GSP2：5-TGGAGTTGTGGCCCATACAG-3,
5-RACE PCR 扩 增 特 异 性 下 游 引 物 5GSP1 ：
5 -GCCTTGGACTTCATTTGGGAC-3 、5GSP2 ：
5 -TAACCCAAGCCCAAGTGATAAG - 3 ，3
RACE 的 下 游 引 物 和 5RACE 的 上 游 引 物
UPM ：Long: 5 -CTAATACGACTCACTATAGGG
CAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3，Short:5-
CTAATACGACTCACTATAGGGC-3，由试剂盒提供，
分别得到长约 500 bp、600 bp 的两条特异性条带（图
3，图 4），经测序，长度分别为 512 bp、687 bp。采
用 Vector NTI Advance 10 序列拼接功能，得到 1 248
bp 的 FLS 基因全长 cDNA 序列。
图 1 金银花叶片总 RNA电泳检测图
2.2 金银花FLS基因部分同源片段的克隆
根据烟草（GenBank 登录号 DQ435530）、马铃薯
（GenBank 登录号 FJ770475）、金花茶（GenBank 登
录号 JF353460）、草莓（GenBank 登录号 DQ087252）
和葡萄（GenBank 登录号 AB086055）FLS 编码基
因高度保守序列设计引物 R1 ：5-ATTTGTTCCATA-
AGATTTGGCC-3、R2 ：5-ATCCTTGTACTTCTT-
GGTCTTG-3，以金银花反转录产物为模板进行 RT-
PCR，电泳检测获得 600 bp 左右的特异性扩增条
带 （图 2），经测序，片段长 646 bp。
M. TaKaRa marker; 1-3. 保守区 PCR 产物
图 2 金银花 FLS基因 cDNA保守区 PCR产物
2.3 金银花FLS基因cDNA序列末端的扩增
根据获得的中间片段，设计 3RACE PCR 扩增
M. TaKaRa marker; S. 3RACE 琼脂糖电泳检测结果
图 3 金银花叶片 FLS基因 3RACE的 PCR扩增产物
M. TaKaRa marker; S. 5RACE 琼脂糖电泳检测结果
图 4 金银花叶片 FLS基因 5RACE的 PCR扩增产物
2.4 金银花FLS基因开放阅读框的扩增及与其它植
物FLS基因同源序列比较
根据序列拼接获得的全长 cDNA 序列，在起始
密码子和终止密码子区分别设计引物 F1 ：5-GCGTC
TAGATACTAAAACAATAATGGAGGT-3 、F2 ：5-C
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第4期66
GCGAGCTCTTCTTAAGAAGTGACTCCTTC-3 ，参考
pBI121 载体上的多克隆位点，并在 F1、F2 引物的 5
端分别加上 Xba I、Sac I 酶切位点和保护碱基，为后
续在植物中的表达打下基础。以叶中总 RNA 反转录
产物为模板扩增得到 1.0 kb 左右的 ORF 片段（图 5）。
测序结果（图 6）表明，ORF 片段大小为 1 001 bp，
编码 333 个氨基酸残基的多肽。利用 DNANAN 软件
对其编码的蛋白质进行预测，分子量为 37.7 kD，等
电点为 5.45。序列分析显示，金银花与其它 15 个物
种的已知 FLS 基因的 cDNA 序列具有 80% 左右的同
源性，如与烟草、马铃薯、桔梗的同源性分萄别为
86%、83% 和 80%，氨基酸的同源性则更高（图 7）。
据此可以认定获得的基因为 FLS。
M. TaKaRa marker; S. FLS 基因 ORF 琼脂糖电泳检测结果
图 6 金银花 FLS基因 cDNA序列及推导的氨基酸序列
图 5 金银花叶片 FLS基因 ORF的 PCR扩增产物
2012年第4期 67乔中全等 ：金银花黄酮醇合成酶基因全长克隆及其序列分析
图 7 金银花与其它植物 FLS基因的氨基酸序列比较
3 讨论
FLS 是金银花黄酮类化合物合成代谢途径中
的一种关键酶，是 α- 同戊二酸依赖性双加氧酶
（α-oxoglutarate-dependent dioxygenase）家族中的一
员，该家族还包括黄酮类化合物生物合成途径中的
黄酮合成酶 I、黄烷酮 3- 羟化酶以及花色素合成酶
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第4期68
等［11］。金银花 FLS 与其它 15 个物种的 FLS 氨基酸
具有 80% 左右的同源性，其中有 93 个氨基酸残基
是完全保守的，同源性主要集中在 C 端。与不同功
能 α- 同戊二酸依赖性双加氧酶氨基酸序列进行比较
时，有 3 个高度保守的氨基酸区域，可能跟 FLS 的
生物学活性有关。
本试验的 3RACE 和 5RACE，是使用 Clontech
公 司 的 SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit 进
行的，反转录合成 cDNA 时，其 5端和 3分别加了
一段接头序列，然后以基因特异引物和试剂盒内的
接头引物扩增目的片段。在试验过程中发现，由于
使用接头引物，而不全是基因特异引物，往往很容
易产生弥散、无扩增条带或扩增出非目的片段的情
况。因此如何快速准确扩出目的条带成为关键，首
先采用降落 PCR 的方法进行扩增，然后将扩增产物
稀释作为模板再进行常规 PCR，就能够出现清晰的
条带。再结合结合生物信息学的分析方法，尽量准
确估计出目的片段大小，并将符合条件的所有条带
都转入载体中克隆，然后用菌液 PCR 的方法鉴定得
到插入目的片段的阳性克隆。为以后解决此类问题
提供一条借鉴的思路。
4 结论
本研究采过 RT-PCR 和 RACE 的方法，从金银花
叶片中分离得到了 FLS 基因的全长 cDNA 序列，其
序列全长 1 248 bp，其中开放阅读框长 1 001 bp，编
码 333 个氨基酸，推测的蛋白分子量约为 37.7 kD，
pI 为 5.45，序列分析表明它与烟草、马铃薯、桔梗
的同源性比较高。
参 考 文 献
［1］ Koes RE, Quattrocchio F, Mol JNM, et a1.The flavonoid biosynthetic
pathway in plants: function and evolmion. BioEssays, 1994, 16（2）:
123-132.
［2］ Harborne JB, Williams CA, Advances in flavonoid research since.
Phytochemistry, 2000, 55（6）: 481-504.
［3］ Middleton E. Kandaswami C, Theoharides TC. The effects of plant
flavonoids on mammalian cells: implications for inflammation, heart
disease, and cancer. Pharmacol Rev, 2000, 52: 673-751.
［4］ Napoli CA, Fahy D, Wang HY, Taylor LP. White anther: a petunia
mutant that abolishes pollen flavonol accumulation, induces male
sterility, and is complimented by a chalcone synthase transgene.
Plant Physiol, 1999, 120: 615-622.
［5］ Jeong JM, Choi CH, Kang SK, et al. Antioxidant and chemosen-
sitizing effects of flavonoids with hydroxy and /or methoxy groups and
structure-activity relationship. J Pharm Pharm Sci, 2007, 10（4）:
537-546.
［6］ Forkmann G, Martens S. Metabolic engineering and applications of
flavonoids. Curt Opin Biotechno1, 2001, 12（2）:155-160.
［7］ Britsch L, Heller W, Grisebach H. Conversion of flavanon to flavone.
dihydroflavonol and flavonol with an enzyme system from cell
cultures of parsley. Zeitschrift fur Naturforsch，1981, 36 ：742-750.
［8］ Holton TA, Brugliera F, Tanaka Y. Cloning and expression of flavonol
synthase from Petunia hybrida. Plant J, 1993, 4 ：1003-1010.
［9］ Schwinn K, Venail J, Shang Y, et al. A small family of MYB-
Regulatory genes controls floral pigmentation intensity and patterning
in the genus Antirrhinura．Plant Cell, 2006，18（4）：831-851.
［10］ Nielsen K, Deroles SC, Markham KR, et al. Antisense flavonol
synthase alters copigmentation and flower color in lisianthus.
Molecular Breeding, 2002, 9: 217-229.
［11］ Prescott AG, John P. Dioxygenases ：molecular structure and role
in plant metabolism. Annual Rev Plant Physiol Mol Biol, 1996,47 ：
245-271.
［12］ 马春雷 , 陈亮 . 茶树黄酮醇合成酶基因的克隆与原核表达 . 基
因组学与应用生物学 , 2009, 28（3）:433-438.
（责任编辑 李楠）