全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第6期
收稿日期 ：2012-12-27
基金项目 ： 国家重点基础研究和发展计划（2010CB126003），国家转基因动物和植物研究项目（2009ZX08005-026B，2011ZX08009-003，
2011ZX08005-003）
作者简介 ：李鑫，女，硕士，研究方向 ：植物生化与分子生物学 ；E-mail ：lostcat311@163.com
AP2（APETALA2）/EREBP（ethylene-responsive
element binding protein）蛋白是植物中所特有的一类
转录因子，它们都含有一种被称为 AP2 的结构域［1］。
根据其所含 AP2 结构域数量的不同，可以被分为两
棉花中一个新型转录因子 GhWRI1 的表达特征与
功能分析
李鑫  王正明  薛伟  初明光
（清华大学 分子生物学实验室，北京 100084）
摘 要 ： AP2（APETALA2）/EREBP（ethylene-responsive element binding protein）是一类特异性存在于植物中的转录因子，
在植物中的许多代谢过程都起着十分重要的作用。从棉花中分离并获得了一个新的 AP2 基因 GhWRI1，该基因长 1 314 bp，所编码
的蛋白含有 437 个氨基酸，分子量约为 48 kD，pI 为 5.77。序列分析结果显示，GhWRI1 蛋白含有 2 个 AP2 结构域，该蛋白属于
AP2 家族 ；与 GFP 蛋白的融合表达试验结果显示，在洋葱表皮细胞中，GhWRI1 是特异性在细胞核中表达的。Real-time RT-PCR 数
据显示 GhWRI1 主要在真叶、根、纤维以及种子中表达，而且其在纤维和种子中的表达量是随着发育时间的推移而不断升高的。
同时构建了 GhWRI1 与 LUC 共表达的载体，通过检测 LUC 的活性来反映 GhWRI1 的表达量，试验数据显示，当 GhWRI1 与 LUC
共表达后，LUC 的活性提高了约 20 倍。试验结果都显示 GhWRI1 是一个很强的转录激活子。
关键词 ： WRI1 基因 转录因子 AP2 结构域 转录激活试验 棉花
Identification and Characterization of a Novel Gene，GhWRI1，
Encoding an AP2-type Transcription Factor in Gossypium hirsutum
Li Xin Wang Zhengming Xue Wei Chu Mingguang
（Laboratory of Molecular Biology and MOE Laboratory of Protein Science，School of Life Sciences，
Tsinghua University，Beijing 100084）
Abstract:  AP2（APETALA2）/EREBP（ethylene-responsive element binding protein）genes comprise a family of plant-specific
transcription factors，many of which have been linked to the regulation of essential biological processes. In this study，a novel AP2 gene，
named GhWRI1，was isolated from Gossypium hirsutum（cotton）. The GhWRI1 cDNA has a total length of 1 314 bp and encodes a protein
of 437 amino acids with a molecular weight of 48 kD and a calculated pI of 5.77. Sequence analysis showed that GhWRI1 contains two AP2
domains and belongs to the AP2 subfamily. Using a green fluorescent protein fusion protein，we demonstrated that GhWRI1 accumulated
specifically in the nuclei of onion epidermal cells. Real-time RT-PCR revealed that GhWRI1 was constitutively expressed in true leaves and
roots，and its expression in fibers and seeds was upregulated over the course of development. In addition，GhWRI1 enhances the activity of a
luciferase reporter by approximately 20-fold，by using a GAL4 activating system in tobacco cells. Our results indicate that GhWRI1 is a strong
transcriptional activator. The possible role of cotton GhWRI1 in controlling the seed oil content is discussed.
Key words:  Wrinkled1 gene（WRI1） Transcription factor AP2 domain Transient assay Gossypium hirsutum
种类型 ：含有两个 AP2 结构域的 AP2 亚族以及含有
一个 AP2/ERF（Ethylene Responsive Factor）结构域
的 EREBP 亚族［2］。此类转录因子在植物的整个生
命过程中都起着十分重要的作用，包括成花器官的
2013年第6期 81李鑫等 ：棉花中一个新型转录因子 GhWRI1 的表达特征与功能分析
决定［3］，叶片表皮细胞的分化［4］，以及植物对环境
压力和生物胁迫的响应过程等［5］。
Wrinkled1（WRI1） 作 为 AP2/EREBP 家 族 的 一
员，最早于 1998 年在拟南芥中被发现［6］。WRI1 基
因编码的蛋白中含有两个 AP2/EREBP 结构域［7］，
它是一个特异性的存在于植物中的转录因子，并且
对植物生命中的许多代谢过程都有着重要的调控作
用［8］，包括种子的发育过程以及胚的成熟过程等［9］。
研究表明，WRI1 可以通过调控植物种子中与油脂
的积累与储存相关基因的表达来提高种子的油脂含
量，为芽的发生提供润滑从而促进种子的萌芽［10］。
拟南芥中的 WRI1 蛋白含有 431 个氨基酸，分子量
约为 48 kD，将它突变后，拟南芥种子表皮出现皱缩，
糖酵解途径受到影响，而且种子中油脂含量下降了
80%［6］。相反地，将 AtWRI1 在 wri1 缺失的拟南芥
植株中过表达后，种子的表皮表型重新恢复正常，
而且与野生型相比，种子的油脂含量升高［6］。另外，
将油菜（Brassica napus）中 WRI1-like 基因在拟南芥
植株中过表达，发现也可以大幅度的提高种子的油
脂含量［11］。进一步的研究结果表明，AtWRI1 可以
与许多在脂肪酸代谢过程中起到关键作用的基因的
上游区域的保守序列 AW-box 相结合［10，12，13］。总之，
WRI1 在调控植物种子油脂含量这一过程中起着非常
重要的作用。
棉花（Gossypium hirsutum L.）是一种非常重要
的经济作物和油料作物，在世界范围内的种植历史
已有 70 年之久，提高棉籽油的产量对于我们的生产
生活都有着十分重要的意义。因此，有必要对调控
棉籽油表达的分子机制进行深入的阐述研究。考虑
到 WRI1 蛋白在调控拟南芥和油菜种子油脂含量中
所起到的重要作用，我们很想知道是否在棉花中也
存在有这样一个类似的 WRI1，能够起到类似作用。
本研究从棉花中克隆到了一个新的 WRI1 基因，并
将其命名为 GhWRI1。随后对 GhWRI1 的表达特征和
亚细胞定位进行了分析，另外通过 LUC 融合表达的
方法对 GhWRI1 的转录调节活性进行了研究，所有
的研究结果都表明 GhWRI1 是一个存在于棉花中的
能够随着种子发育期的推移表达量不断上调的一个
新型转录因子，而且它可能在调控棉花种子油脂含
量中起着重要作用。
1 材料与方法
1.1 材料
正常条件下生长的陆地棉（Gossypium hirsutum
cv CRI 35）；种子由中国农业科学院棉花研究所种质
资源库提供 ；花是在棉花开花当天采集 ；在发育的
不同时期采集的棉铃在冰上暂存，分离出的纤维和
种子于液氮中速冻后置于 -80℃冰箱中保存。
棉花幼苗于 25℃下进行培养（16 h light/8 h dark
cycle）。培养两周后收集幼苗的根和真叶，于液氮中
速冻，并于 -80℃冰箱中保存。
1.2 方法
1.2.1 棉花 GhWRI1 cDNA 的提取 利用生物信息
学和常规 PCR 相结合的方法来克隆 GhWRI1 基因的
cDNA 序列。首先，用拟南芥 AtWRI1（GenBank 登
录号 ：AT3g54320）的氨基酸序列利用 tblastn 程序
搜索棉花 EST 数据库（http ：//www.tigr.org）［11］，得
到 20 个 EST 序列（Supplemental Table S1）。利用序
列拼接技术获得一个序列，其氨基酸序列与 AtWRI1
有着很高的同源性。而且这个序列包含了翻译起始
密码子和终止密码子，说明这个序列包含了全长
ORF。
为了验证我们所研究的陆地棉品种中也存在这
个 cDNA 序列，在这个序列的两端设计了引物 F1
（5-AATGAAGAGGTCACCGAGCT-3）和 R1（5-TA-
ACCCGAAACATCAACCAT-3），以棉花 cDNA 文库为
模板进行常规 PCR。并将 PCR 产物克隆到 pMD19-T
载体（TaKaRa 公司）进行测序。利用 DNAMAN 软
件（Lynnon BioSoft 公 司 ） 对 DNA 序 列 进 行 分 析，
并利用 Clustal W 对 GhWRI1 与其他 AP2 蛋白之间
的同源性进行了比对［14］。
1.2.2 GhWRI1 蛋白的亚细胞定位 利用融合绿色
荧光蛋白（GFP）来检测目的蛋白在植物细胞中
的定位。GFP 产生荧光的生色团是由 Ser65、脱氢
Tyr66、Gly67 自身环化及氧化形成。形成时依赖于氧，
不需要酶催化，发生在肽链合成之后。该发色团在
395 nm 处有最大吸收峰，发射 509 nm 绿色荧光。用
395 nm 远紫外光激发的荧光强度大于用 490 nm 蓝
光激发的荧光强度。
采用 PCR 技术，在 GhWRI1 蛋白编码区的 5
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第6期82
端和 3 端分别加上 Nco I 和 BamH I 酶切位点。然
后将该片段插入到 pCK-GFP 载体（从 Dr. Duchene
获得，IBMP，澳大利亚）的 Nco I 和 BamH I 位点
之间，并通过酶切鉴定和测序分析筛选到了正确
的 重 组 子， 形 成 GFP 融 合 蛋 白 的 表 达 载 体 pCK-
GhWRI1 ：：GFP，使得 GhWRI1 与 GFP 绿色荧光蛋
白融合表达。克隆 GhWRI1 时采用的两端引物为 ：
F2（5-CCATGGACAAGAGGTCACCGAG-3），R2（5-
GGATCCTGAACAGAGTAGTTAC-3）。
利用基因枪技术将重组质粒以及空白对照质粒
分别导入洋葱表皮细胞，其中金粉包埋参照 Bio-Rad
Biolistic PDS 1000/He system（Bio-Rad，CA，USA）
的方法［15］。洋葱表皮预先撕好，并且放在 MS 固体
培养基上，于 22℃条件下培养 24 h。采用 Bio-Rad
PDS-1000/He 基因枪进行轰击，可裂膜压力为 1.1
kPa，洋葱表皮至可裂膜距离为 5 cm，转化后继续
22℃培养 24 h。而后将轰击后在 22℃培养 24 h 后的
洋葱表皮细胞直接放在载玻片上用激光共聚焦显微
镜（Olympus，FV500）观察。选用标准的 GFP（激
发波长 488 nm，发射波长 525 nm，并加强）和可见
光明场下对同一视野进行序列扫描，两次扫描结果
保存成单独的图像，最后由显微镜操作系统对两次
扫描形成的图像进行叠加。所有得到的扫描图像都
通过 Adobe Photoshop® CS 进行编辑整理，形成最终
的图片。
1.2.3 实 时 定 量 Real time-PCR 分 析 利 用 CTAB
方法从不同发育时期的棉花根、真叶、纤维和种
子中分别提取总 RNA，经过 RT-PCR 方法获得其
cDNA［16］：利用 TaKaRa RNA PCR 试剂盒（TaKaRa
公司），取 2 g 总 RNA 进行反转录扩增获得棉花的
cDNA。 利 用 iCycler iQ5 Multicolor real-time PCR 检
测系统（Bio-Rad）进行实时定量 PCR，选用 Power
SYBR Green PCR Master Mix（Applied Biosystems，
CA，USA）。组蛋白 H3 作为内参，使用的引物分
别 为 F3（5-AATGAAGAGGTCACCGAGCT-3），R3
（5-TAACCCGAAACATCAACCAT-3）；Histone-1（5-
TCAAGACTGATTTGCGTTTCCA-3），Histone-2（5-
GCGCAAAGGTTGGTGTCTTC-3）。最后利用比较 CT
值的方法对相关的基因表达进行定量。
1.2.4 转录激活试验 5×GAL4-LUC 载体和 CaMV-
35S-GAL4DB-NOS 质 粒 均 由 日 本 Ohme-Takagi 博
士赠送。通过将 GhWRI1 编码区插入到 CaMV35S-
GAL4DB 载体的 Sma I 酶切位点构建了包含有目标
蛋白 GhWRI1 的效应质粒 GAL4DB-GhWRI1，未插
入 GhWRI1 的 CaMV35S-GAL4DB-NOS 载 体 作 为 本
试验的空白对照。
采用基因枪轰击的方法分别将报告质粒、效应
质粒以及对照组质粒导入烟草的叶片细胞中去［15］。
轰击过的烟草叶片放在用 50 mmol/L 磷酸缓冲液
（pH7.0）润湿的滤纸上 22℃暗培养约 18 h。取出
叶片用液氮研磨成粉状，然后利用 Promega 公司
的双荧光素酶报告基因测试系统（Dual-Luciferase®
Reporter Assay System，DLR） 试 剂 盒 来 测 样 品 的
LUC 活性。具体操作如下 ：
（1）将磨好的样品加入到 2.0 mL 的离心管中，
加入 400 μL 新配制冷的 1×PLB 溶液，震荡混匀，
用预冷的电动匀浆器匀浆 2 min。
（2）4 ℃ 放 置 30 min，12 000×g，4 ℃ 离 心 10
min。取出上清到一个新的离心管中。
（3）将 LUC 检测仪 TD-20/20 照度计（TD-20/20
Luminometer，Turner Designs）连接到计算机，开机
预热。将程序设计成 3 s 延迟，15 s 测量。
（4）取 10 μL LAR II 溶液到离心管中，加入 10
μL 步骤（2）提取的上清，吹吸混匀 2-3 次，放入
TD-20/20 照 度 计 中， 按 enter 开 始 测 量 Firefly LUC
活性。
（5）等 Firefly LUC 测量完毕，取出离心管加入
10 μL Stop&Glo® 溶液，吹吸混匀 2-3 次，放入 TD-
20/20 照度计中，按 enter 开始测量 Renilla LUC 活性。
（6）由于 LUC 检测仪连接到计算机上，所以
Firefly LUC 和 Renilla LUC 的活力数值都在计算机上
显示，并且它们之间的比值（相对 LUC 活性）也自
动计算出来，记录这个比值。
2 结果
2.1 GhWRI1 基因的序列特征
将 拟 南 芥 AtWRI1 的 氨 基 酸 序 列 用 tblastn
程 序 搜 索 棉 花 EST 数 据 库 得 到 20 个 EST 序 列
（Supplemental Table S1），并通过序列拼接获得了目
的序列，而且经过序列分析发现，所得到的这个序
2013年第6期 83李鑫等 ：棉花中一个新型转录因子 GhWRI1 的表达特征与功能分析
列也包含了全长 ORF。因此将这个新分离到的基因
命 名 为 GhWRI1， 即 Gossypium hirsutum Wrinkled1。
同 时 用 GhWRI1（GenBank 登 录 号 为 ：JQ768531）
来表示 GhWRI1 基因的蛋白质产物。GhWRI1 基因
全长为 1 314 bp，其编码的蛋白 GhWRI1 含有 437
个氨基酸，分子量约为 48 kD，pI 值为 5.77，蛋白
序列中未发现有信号肽的存在。蛋白分析结果显示，
GhWRI1 含 有 两 个 保 守 的 AP2/EREBP 结 构 域（ 图
1-A），暗示着 GhWRI1 可能作为一个转录因子发挥
其作用。
为了进一步明确 GhWRI1 与 AtWRI1 以及其它
已报道的 AP2 类转录因子的同源关系和它在整个
AP2/EREBP 家族中的分类地位，将其 AP2 结构域的
氨基酸序列与该家族中的其它成员进行了进化树比
对分析（图 1-B）。AP2/EREBP 蛋白家族的 AP2 结构
域进化树分析结果（图 1-C）显示，所有的成员蛋白
都可以被分为四大类型。其中，GhWRI1 与 RcDBP1
同源性最高，它们与来源于水稻中的 OsWRI1.1 和
OsWRI1.2 同属于一个类型。
2.2 GhWRI1转录本的时空分布
基因的时空分布可以帮助我们更有效的了解其
功能，为了鉴定 GhWRI1 的时空分布特征，我们以
棉花的不同组织为材料提取总 RNA 进行实时定量
RT-PCR 分析。如图 2 所示，GhWRI1 的转录本可以
在所有组织中都被检测到，其中在 20DPA 的种子中
的表达量最高，15DPA 的种子和根中的表达量次之，
真叶中表达量最少，有趣的是，随着棉花纤维的发育，
在棉花纤维的快速伸长期（5-15 DPA），GhWRI1 的
表达量逐渐升高，这暗示着或许 GhWRI1 与棉花纤
维细胞的伸长过程中可能起到促进作用。另外，在
发育的棉花种子中，随着发育的进行（0-20 DPA），
GhWRI1 的 表 达 量 逐 渐 被 上 调， 特 别 是 在 10-20
DPA 的 这 段 时 间，GhWRI1 的 上 调 特 别 明 显， 表
明 GhWRI1 可能与种子的发育过程调控也有一定的
关系。
2.3 GhWRI1蛋白的亚细胞定位
转录因子通过与基因的启动子区相结合来调节
基因的表达，因此转录因子若发挥其转录调节功能
则必须进入到细胞核内与基因组 DNA 相结合。因此
选择通过瞬时表达 GhWRI1 与 GFP 融合蛋白以验证
它的细胞核定位。如图 3 所示，当 GhWRI1 与 GFP
在洋葱表皮细胞中融合表达时，此融合蛋白特异的
定位于洋葱表皮细胞的细胞核中（图 3D-F）；而当
GFP 单独表达时，GFP 荧光则充满整个洋葱表皮细
胞（图 3A-C）。此试验验证了 GhWRI1 蛋白的细胞
核定位。
20
16
12
8
4
R
el
at
iv
e
ex
pr
es
si
on
le
ve
l
0
RT TL FB
-5
FB
-10
FB
-15 SD
-0
SD
-5
SD
-10
SD
-15
SD
-20
总 RNA 由两周幼苗的根（RT）、真叶（TL），开花后成熟棉花植株的纤维
5DPA（FB-5）， 纤 维 10DPA（FB-10）， 纤 维 15DPA（FB-15）， 种 子 0DPA
（SD-0），种子 5DPA（SD-5），种子 10DPA（SD-10），种子 15DPA（SD-15），
种子 20DPA（SD-20）组成
图 2 GhWRI1 mRNA 表达的 Real-time RT-PCR 分析
利用基因枪轰击的办法将 35S-GFP（A-C）和 GhWRI1-GFP（D-F）分别导
入洋葱表皮细胞，培养箱中培养 24 h 后在激光共聚焦显微镜下进行观察。A，
D ：是暗场下对 GFP 荧光进行扫描 ；B ，E ： 是在明场下对细胞的形态进行
照片 ；C，F ：是暗场和明场的合并
图 3 GhWRI1 蛋白在洋葱表皮细胞中的核定位
A B C
D E F
2.4 GhWRI1的转录活性分析
利用瞬时表达的方法来研究 GhWRI1 的转录
活性。为了控制在每次转化试验中转化效率的差异
所造成的误差，以 CaMV 35S 启动子连接海参 LUC
（Renilla LUC）基因（CaMV35S-Renilla LUC-NOS）的
质粒作为转化效率的内参（图 4-A）。在每个转化试
验中报告质粒、效应质粒或者空白对照质粒和作为
转化内参的 CaMV35S-Renilla LUC-NOS 质粒通过基
因枪轰击方法同时转化到烟草叶片细胞中。然后检
测样品的相对荧光素酶活性（荧光虫 LUC 与海参
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第6期84
（A）GhWRI1 基因的核苷酸序列和推导的氨基酸序列，星号（*）表示终止密码子，下划线表示 AP2 结构域。（B）GhWRI1 与部分 AP2 亚族成员 AP2 结构域
序列比对。（C）GhWRI1 与其同源的其他 WRI1 蛋白序列的进化树分析，所涉及的蛋白在 GenBank 中的登录号分别为：GhWRI1（Gossypium hirsutum）：JQ76853；
AtWRI1.1，AtWRI1.2（Arabidopsis thaliana）：AEE79215，AEE79214 ；OsWRI1.1，OsWRI1.2（Oryza sativa，japonica cultivar group）：BAE78578，ABA91302 ；
BnWRI1.1，BnWRI1.2（Brassica napus）：ADO16346，ABD16282 ；ZmWRI1（Zea mays）：ACG32367 ；RcDBP1，RcWRI1（Ricinus communis）：EEF37078，
EEF45016 ；PtAP2.1，PtAP2.2，PtAP2.3，PtAP2.4（Populus trichocarpa）：EEF02630，EEE89288，EEF01965，EEF03969
图 1 棉花 GhWRI1 基因的核苷酸序列、氨基酸序列及其与其他 AP2 家族蛋白序列同源性比对分析
1
1
61
21
121
41
181
61
241
81
301
101
361
121
421
141
481
161
541
181
601
201
661
221
721
241
781
261
841
281
901
301
961
321
1021
341
1081
361
1141
381
1201
401
1261
421
AtWRl1.1
AtWRl1.2
OsWRl1.1
OsWRl1.2
BnWRl1.1
BnWRl1.2
ZmWRl1
RcWRl1
RcDBP1
PtAP2.1
PtAP2.2
PtAP2.3
PtAP2.4
GhWRIl1
Consensus
AtWRl1.1
AtWRl1.2
OsWRl1.1
OsWRl1.2
BnWRl1.1
BnWRl1.2
ZmWRl1
RcWRl1
RcDBP1
PtAP2.1
PtAP2.2
PtAP2.3
PtAP2.4
GhWRIl1
Consensus
AtWRl1.1
AtWRl1.2
OsWRl1.1
OsWRl1.2
BnWRl1.1
BnWRl1.2
ZmWRl1
RcWRl1
RcDBP1
PtAP2.1
PtAP2.2
PtAP2.3
PtAP2.4
GhWRIl1
Consensus
117
117
133
136
114
114
117
125
137
112
107
129
119
130
197
197
213
216
194
194
197
205
217
192
187
209
199
210
274
274
283
286
268
268
258
276
284
256
255
282
271
282
t qe e a a ay d a a y r g nav t nf d y
al kywg t nf p y e m e eyl a l r r s s gf s r gv s ky r gv a r hhh ngr wea r i gr v gn kyl yl gt
r s s r gv r hr wt gr e ahl wdk kk g q g a y d e e a a y dl a
42 PtAP2.1
PtAP2.2
BnWRl1.1
BnWRl1.2
ZeaWRl1
AtWRl1.1
AtWRl1.2
RcDBP1
GhWRl1
OsWRl1.1
OsWRl1.2
PtAP2.4
PtAP2.3
RcWRl1
100
45
49
83
85
99
70
100
100
50
92
A C
B
2013年第6期 85李鑫等 ：棉花中一个新型转录因子 GhWRI1 的表达特征与功能分析
LUC 之比，FLUC/RLUC）。以空白对照质粒的 FLUC/
RLUC 活性为 1.0。由此得到的相对活性越高则表明
该效应基因在细胞中的转录激活能力越强。与我们
的预测结果相一致，当将 GhWRI1 与 LUC 共表达时，
LUC 的活性提高了将近 20 倍（图 4-B）。这些数据
都表明 GhWRI1 是一个作用很强的转录激活子。
麻中的 RcDBP1 同属于类型 III。利用 Real-time RT-
PCR 对其在不同组织及不同发育阶段中的表达特征
进行了分析，结果显示 GhWRI1 在棉花的根、真叶、
纤维和种子中都有广泛的表达，而且随着棉花纤维
的伸长和种子的发育过程，其在纤维和种子的表达
量均呈现升高趋势。并利用其与 GFP 蛋白融合表达
的试验对其亚细胞定位进行了研究，结果表明其是
特异性的在细胞核中表达的。最终通过检测报告质
粒中的 LUC 活性对其转录调节活性进行了进一步鉴
定，试验结果表明，GhWRI1 是一个具有较强作用
的转录激活子。
参 考 文 献
［1］ Riechmann JL, Meyerowitz EM. The AP2/EREBP family of plant
transcription factors［J］. Biol Chem, 1998, 379 ：633-646.
［2］ Shigyo M, Hasebe M, Ito M. Molecular evolution of the AP2
subfamily［J］. Gene, 2006, 366（2）：256-265.
［3］ Jofuku KD, den Boer BG, Van Montagu M, Okamuro JK. Control
of Arabidopsis flower and seed development by the homeotic gene
APETALA2［J］. Plant Cell, 1994, 6（9）：1211-1225.
［4］ Moose SP, Sisco PH. Glossy15, an APETALA2-like gene from maize
that regulates leaf epidermal cell identity［J］. Genes Dev, 1996,
10 ：3018-3027.
［5］ Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K. A novel cis-acting element in
an Arabidopsis gene is involved in responsiveness to drought, low tem-
perature, or high-salt stress［J］. Plant Cell, 1994, 6（2）：251-
264.
［6］ Nicole F, Christoph B. Wrinkled1 ：A novel, low-seed-oil mutant
of Arabidopsis with a deficiency in the seed-specific regulation of
carbohydrate metabolism［J］. Plant Physiol, 1998, 118（1）：91-
101.
［7］ Weigel D. The APETALA2 domain is related to a novel type of DNA
binding domain［J］. Plant Cell, 1995, 7（4）：388-389.
［8］ Riechmann JL, Heard J, Martin G, et al. Arabidopsis transcription
factors ：genome-wide comparative analysis among eukaryotes［J］.
Science, 2000, 290（5499）：2105-2110.
［9］ Cernac A, Benning C. WRINKLED1 encodes an AP2/EREB domain
protein involved in the control of storage compound biosynthesis in
Arabidopsis［J］. Plant J, 2004, 40（4）：575-585.
［10］ Cernac A, Andre C, Hoffmann-Benning S, Benning C. WRI1 is
5XGAL4 TATA LUC NOS
CaMV35S Ω
Control
A
B
GhWRI1
0 10
Relative luciferase activity
20 30
GAL4DB GhWRI1 NOS
A ：效应质粒与报告质粒的结构示意图 ；B ：GhWRI1 在烟草细胞
中的转录活性
图 4 GhWRI1 在烟草细胞中的转录活性分析
3 讨论
WRI1 是特异性存在于植物中的 AP2/EREBP 家
族转录因子。已有的研究结果表明，WRI1 在调控
植物种子油脂含量过程中起着十分重要的作用［6， 11］。
拟南芥中的 WRI1 可以通过与许多在脂肪酸代谢过
程中起到关键作用的基因的上游区域的保守序列
AW-box 相结合［10，12，13］，从而调控植物种子中与
油脂的积累与储存相关基因的表达来提高种子的油
脂含量，并为芽的发生提供润滑从而促进种子的萌
芽［10］。然而，棉花中的 WRI1 至今尚无报道。若能
够在棉花中找到这样一个类似的 WRI1，将极大地拓
展我们对于 WRI1 这类基因功能的认识，未来或许
可以通过在棉花中过表达 WRI1 来对植物种子的油
脂含量进行一个人为的调控，这将对我们的生产和
生活具有十分重大的意义。在下一步的试验中，我
们计划将 GhWRI1 转入到拟南芥中，通过观察转基
因拟南芥的表型变化来对其作用进行进一步的研究。
4 结论
克隆到了一个蛋白结构含有两个保守的 AP2
结构域的新基因 GhWRI1，利用进化树分析发现，
GhWRI1 与 水 稻 中 的 OsWRI1.1、OsWRI1.2 以 及 蓖
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第6期86
required for seed germination and seedling establishment［J］.
Plant Physiol, 2006, 141（2）：745-757.
［11］ Kenichiro M, Tsuyoshi T, Ayame A, et al. An AP2- type
transcription factor, WRINKLED1, of Arabidopsis thaliana binds to
the AW-box sequence conserved among proximal upstream regions
of genes involved in fatty acid synthesis［J］. Plant J, 2009, 60（3）：
476-487.
［12］ Stockinger EJ, Gilmour SJ, Thomashow MF. Arabidopsis thaliana
CBF1 encodes an AP2 domain-containing transcriptional activator
that binds to the C-repeat/DRE, a cis-acting DNA regulatory
element that stimulates transcription in response to low temperature
and water deficit［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 1997, 94（3）：
1035-1040.
［13］ Qin F, Sakuma Y, Li J, et al. Cloning and functional analysis of a
novel DREB1/CBF transcription factor involved in cold-responsive
gene expression in Zea mays L［J］. Plant Cell Physiol, 2004, 45
（8）：1042-1052.
［14］ Thompson JD, Higgins DG, Gibson TJ. CLUSTAL W ：improving
the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through
sequence weighting, position-specific gap penalties and weight
matrix choice［J］. Nucleic Acids Res, 1994, 22（22）：4673-
4680.
［15］ Huang B, Liu JY. Cloning and functional analysis of the novel
gene GhDBP3 encoding a DRE-binding transcription factor from
Gossypium hirsutum［J］. Biochim Biophys Acta, 2006, 1759（6）：
263-269.
［16］ Li T, Li H, Zhang YX, Liu JY. Identification and analysis of seven
H2O2-responsive miRNAs and 32 new miRNAs in the seedlings of
rice（Oryza sativa L. ssp. indica）［J］. Nucleic Acids Res, 2011,
39（7）：2821-2833.
（责任编辑 马鑫）