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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第10期
HOX 基因（Homeobox）也被称为同源盒、同源
框或同源异形基因，是一种调节动物胚胎发育的基
因，并且在调控细胞的增殖分化方面也起着重要的
作用，最早是由美国科学家 Lewis 利用果蝇杂交互
收稿日期 ：2014-04-22
基金项目 ：国家科技支撑计划（2012BAD13B06），国家公益性行业 ( 农业 ) 科研专项（201203009），西南民族大学研究生创新性项目（CX-
2014SZ72）
作者简介 ：张亚南，女，硕士研究生，研究方向 ：细胞与胚胎工程 ；E-mail ：yanan599302927@126.com
通讯作者 ：李键，男，博士，教授，研究方向 ：动物生殖调控 ；E-mail ：lijian@swun.cn
金川多肋牦牛 HOXC10 基因的克隆、序列分析及
组织表达
张亚南1  熊显荣1  兰道亮1  符梅1  张雁1  侯定超2  马定美2  李善荣2  李键1
（1. 西南民族大学生命科学与技术学院，成都 610041 ；2. 金川县畜牧兽医局，金川 624100）
摘 要 ： 旨在克隆牦牛 HOXC10 基因，并进一步分析该基因的结构与功能以及揭示其组织特异性表达规律。以金川多肋牦
牛为材料，根据 GenBank 已公布的绵羊 HOXC10 基因序列设计引物，采用 RT-PCR 技术对 HOXC10 基因的 cDNA 全长进行扩增，
并对其进行生物信息学分析及在各组织中的表达谱。对测序结果进行生物信息学分析表明，扩增的牦牛 HOXC10 基因长度是 1 272
bp，其中包含一个 1 029 bp 的开放阅读框，共编码 342 个氨基酸 ；同源性分析表明，牦牛与黄牛的相似性较高，为 93.2% ；预测
HOXC10 蛋白质的分子量为 38.2 kD，理论等电点为 8.45 ；进化树分析显示，牦牛与黄牛的亲缘关系最近，处于同一个分支上 ；组
织表达谱分析表明，该基因在牦牛各组织中均有不同程度的表达，其中在肝脏中的表达量最高，胃中的表达量最低。
关键词 ： 牦牛 克隆 HOXC10 序列分析 组织表达
Cloning，Sequence and Tissue Expression Pattern Analysis of HOXC10
Gene in Multi-costa Properties Yaks of Jinchuan
Zhang Yanan1 Xiong Xianrong1 Lan Daoliang1 Fu Mei1 Zhang Yan1 Hou Dingchao2
Ma Dingmei2 Li Shanrong2 Li Jian1
（1. College of Life Science and Technology, Southwest University for Nationalities, Chengdu 610041 ；2. Animal Husbandry and Veterinary
Bureau of Jinchuan County, Jinchuan 624100）
Abstract: The present study aimed at cloning yak HOXC10 gene, and further analysis of the gene structure and function, and reveals
the tissue specificity expression pattern. The Jinchuan multi-costa properties yak as materials, this study based on the GenBank published Ovis
aries HOXC10 gene sequences for primier designing, using RT-PCR technology to amplification the cDNA full length of HOXC10 gene, and its
bioinformatic analysis and expression profiling in various tissues. The sequencing result showed that the length of yak HOXC10 gene is 1 272 bp
and contains a 1 029 bp open reading frame（ORF）, encoding 342 amino acids. The results of homology analysis showed that yak and bos
taurus has the higher similarity（93.2%）；Followed by predicting HOXC10 protein molecular weight 38.2 kD, the theory of isoelectric point is
8.45. Evolutionary tree analysis results showed that yak was closest relative with bos taurus, and in the same branch. Tissue expression profile
analysis showed that HOXC10 gene is expressed in different degrees in various organizations, which had the highest expression in the liver, the
lowest expression in the stomach.
Key words: Yak Cloning HOXC10 Sequence analysis Tissue expression
补的方法发现的 HOX 基因几乎存在于所有的两侧
对称的动物体内，并且其调控机理很相似，HOX 家
族是指成簇存在的同源异形盒基因，基因间的同源
性比率在 70%-80%，该家族所编码的蛋白质均含
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第10期140
有由 61 个氨基酸组成的同源结构域（homeodomeo，
HD）［1］。目前，根据基因在染色体上的分布、序列
的同源性及表达蛋白结构的不同，可将其分为两类，
一类 HOX 基因可以分为 A、B、C 和 D 4 个基因簇，
串联分布于 7、17、1 和 2 号染色体上 ；另一类 HOX
基因，又称 non-HOX 基因，由多个散布于不同染色
体 的 基 因 家 族 构 成， 如 TALE、CDX、PAX 等［2］。
HOXC10 是 HOX 基因家族中重要的一员，目前已经
有研究表明，HOXC10 不但影响脊椎动物的胚胎发
育，更重要的是影响神经系统的发育［3］，同时也对
脊椎动物的断肢及尾部的再生过程有一定的影响［4］。
牦牛主要分布于我国青藏高原地区，约占世界
牦牛总数的 95%［5，6］，常生活在于海拔 3 000 m 以
上，能充分利用高寒草地牧草资源，对高寒草地的
生态环境具有极强的适应性，为当地牧民提供生产
和生活必需品，是青藏高原地区牧民的重要生活和
经济来源。在长期的自然选择和人工选择的共同作
用下，牦牛对高海拔、低温、低氧牧区具有良好适
应性，能利用高寒草场资源带来优质、安全、营养
的绿色食品［7］。Tserang 等［8］在四川金川县牦牛群
体调查统计中发现，多肋牦牛的个体占群体总数的
52 %，并且该多肋牦牛群体的繁殖率和生产性能都
明显比非多肋牦牛的偏高。
目前，对于 HOXC10 在牦牛上的研究还很少，
主要集中在其影响动物体轴发育、肢体调控方面［9］。
鉴于 HOX 基因是动物躯干发育的框架设计基因，对
DNA 的合成和转录起关键性作用，每个 HOX 基因
都有特定的表达域，共同调控机体发育［10］。本研究
通过对金川多肋牦牛 HOXC10 克隆，对其基因序列
进行生物学分析，旨在为下一步解释该基因对牦牛
生长发育及胚胎骨骼发育等的作用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
牦牛组织样品，采自四川省阿坝州金川县的
多肋牦牛。液氮保存带回实验室，-80℃保存备用。
Trizol 试剂购自 Invitrogen（上海）公司，反转录酶
试剂盒购自 Ferments 公司 ；Taq DNA 聚合酶购自天
根生化科技有限公司 ；DNA 片段凝胶回收纯化试剂
盒购自 Axygen 公司 ；pMD19-T 克隆载体购自宝生物
工程（大连）有限公司。
1.2 方法
1.2.1 组 织 RNA 的 提 取 和 cDNA 的 合 成 采 用
Trizol 法提取牦牛心、肝、肺、肾、大肠、小肠、胃、
肌肉、乳腺、卵巢、子宫、输卵管的总 RNA，并用
Nanodrop ND-1000（LabTech，USA）检测 RNA 的浓
度和质量，-80℃保存备用。按照 Ferments 公司的反
转录酶说明书，采用 20 μL 体系 ：1 μL Oligo（dT）18
primer，5×Reaction Buffer 4 μL，RibolockTM Rnase
Inhibitor（20 g/L）1 μL，10 mmol/L dNTP Mix 2 μL，
RevertAidTM M-MuLV Reverse Transcriptase（200 g/L）
1 μL，模板 2 μg，最后用无 RNA 酶水补足至 20 μL，
反转录程序 ：42℃ 60 min，70℃ 5 min，合成第一链
cDNA，-20℃保存备用。
1.2.2 引物设计与合成 根据 GenBank 中绵羊（登
录号为 XM_004006284.1）HOXC10 基因的 CDS 区序
列，采用 Premier Premier 5.0 软件设计一对 PCR 引物：
MF1 ：5-CCTCCGCTGTAGTATTGCTC-3，MR1 ：5-
GAAGATGCGTCCACCTAAAG-3，所处位置分别为
71-91、1 322-1 342，预期产物长度 1 272 bp，退火
温度为 55℃，引物由上海 Invitrogen 公司合成。
1.2.3 目的基因的克隆 以牦牛卵巢组织 cDNA 为
模板，引物为 HOXC10 的 F、R，PCR 扩增体系为
25 μL，反应条件 ：94℃预变性 5 min ；94℃变性 1
min，55℃ 退 火 45 s，72℃ 延 伸 90 s，35 个 循 环 ；
72℃延伸 5 min。PCR 产物经 10 g/L 琼脂糖凝胶电泳
观察扩增结果，用 Axygen 的凝胶回收试剂盒回收纯
化的 PCR 产物，取适量纯化的 PCR 产物与克隆载
体 pMD19-T 进行连接，转化 DH5α 感受态细胞并在
Amp+ 的琼脂平板上涂菌。挑取单个菌落连接于含
Amp+ 的 LB 液体培养基。经过 PCR 鉴定后，将阳性
重组质粒送往 Invitrogen（上海）公司进行测序。
1.2.4 目的基因序列分析 扩增的牦牛 HOXC10 基
因编码区序列，采用 ORF Finder 在线程序预测开放
阅读框 ；利用 ExPASy 网站的在线工具 Protparam 和
ProtScale 分析牦牛 HOXC10 基因编码蛋白质的基本
理化性质和疏水性质 ；利用 Interpro 在线预测网站
预测蛋白质的结构域和功能位点 ；利用 DNAstar 软
件对克隆得到的牦牛 HOXC10 编码区与 NCBI 基因
2014年第10期 141张亚南等：金川多肋牦牛 HOXC10基因的克隆、序列分析及组织表达
库中绵羊、黑猩猩等其他动物进行同源性比对，并
用 MEGA 软件进行进化树分析。
2 结果
2.1 目的基因的扩增
以牦牛卵巢组织为模板，克隆得到了 HOXC10
基因。结果（图 1）显示，扩增片段大小在 1 270 bp
左右，与预测扩增片段大小基本相符，初步证明克
隆成功。分析发现该序列包含一个 1 029 bp 的开放
阅读框，预测的蛋白质分子量约为 38.2 kD，该蛋白
序列中含有 43 个带有负电的氨基酸残基，47 个氨
基酸带有正电荷正电荷，理论等电点是 8.45。
2000
bp
M 1 2
1272
bp
1000
750
500
250
100
M ：DNA Marker DL2000 ；1，2 ：HOXC10 在牦牛卵巢中的表达
图 1 金川多肋牦牛 HOXC10 基因的扩增结果
1
JHOXC10
GAPDH
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
1-12 ：依次为肝脏、子宫、小肠、输卵管、肺脏、大肠、
乳腺、胃、肌肉、卵巢、心脏、肾脏
图 2 HOXC10 基因的组织表达谱
2.3 蛋白质结构和功能预测
2.3.1 牦牛 HOXC10 基因编码蛋白结构域和功能位
点预测 利用 Interpro 在线工具对牦牛 HOXC10 基
因编码蛋白进行结构域预测，结果（图 3）表明，
该序列在第 241-330 位氨基酸之间具有完整的 DNA-
binding domain 功能域。
2.3.2 牦 牛 HOXC10 基 因 编 码 蛋 白 质 亲 水 性 / 疏
水 性 分 析 运 用 ExPASy 中 的 ProScale 子 程 序 对
HOXC10 的亲疏水性进行分析。结果（图 4）显示，
根据氨基酸亲水性 / 疏水性规律分析，分值越低的
亲水性越强，分值越高的疏水性越强。由图 4 可以
看出，牦牛 HOXC10 的 C 端 0-50 个氨基酸区域处
有一个明显的疏水区域，最大值为 1.06（第 45 位氨
基酸），最小值为 -2.5（第 230 位氨基酸），在 40-50
位氨基酸区域很可能是 HOXC10 蛋白的跨膜区域。
2.3.3 牦牛 HOXC10 蛋白分子跨膜区预测 利用在
线分析程序 TMpred 对 HOXC10 蛋白质跨膜区进行
预测，结果（图 5）显示，该蛋白在 0-50 个氨基酸
处有一个典型跨膜区段，结合亲 / 疏水性的预测结果，
可以判定此处是 HOXC10 蛋白的跨膜区域。
200150100501
Domain
342300250
图 3 HOXC10 蛋白质功能结构域分析
2.2 HOXC10基因的组织表达分析
以金川多肋牦牛的肝脏、子宫、小肠、输卵管、
肺脏、大肠、乳腺、胃、肌肉、卵巢、心脏、肾脏
组织为材料，提取总 RNA，通过 RT-PCR 方法检测
HOXC10 在不同组织中表达量。结果表明，在金川
多肋牦牛的 12 个组织中均有 HOXC10 基因的表达，
其中在肝脏、子宫、小肠中的表达量相对较高，在
输卵管、胃、肌肉中的表达量相对较低（图 2）。
2.4 金川多肋牦牛HOXC10同源性分析
利 用 DNAStar 软 件 程 序 MegAlign 的 Clustal W
方法与 GenBank 公布的部分物种 HOXC10 基因进行
同源性比较。结果（图 6）显示，牦牛与黄牛、绵羊、
猫、野猪、人同源性较高，分别为 93.2%、97.8%、
97.9%、96.1% 和 95.5%，与原鸡、爪蟾的同源性较
低，分别为 68.7% 和 63.3%，说明牦牛 HOXC10 基
因在长期进化中较为保守，尤其在哺乳动物间具有
较高保守性。
2.5 牦牛HOXC10的系统进化分析
用 MEGA.5 软件的 Neighbor-Joining 法，将获得
的 11 条 HOXC10 基因序列构建 Btstrap 的系统发育
树，结果（图 7）显示，牦牛与黄牛的亲缘关系最近，
并与家绵羊、野猪、猫、马、人、黑猩猩、家鼠形
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第10期142
成哺乳动物的一个分支，与原鸡和爪蟾形成一个与
牦牛较远的分支。
3 讨论
同源盒（Homeobox）基因是一类在胚胎发育、
细胞分化转录过程中的主控基因，含有共同的 183
个核苷酸序列（同源盒）编码转录因子的调节基
因［11］，这些基因在生物进化中具有高度的保守性，
暗示了它们在生物发育过程中扮演着重要角色。研
究发现脊椎动物 HOX 基因簇随着基因组的两次复
制产生 4 个 HOX 基因簇，首先是由 HOXA 复制出
HOXB，再由这两个簇复制出 HOXC 和 HOXD，因此，
人和哺乳类具有 4 个连锁群，分别命名为 HOXA、
HOXB、HOXC和 HOXD，这 4 个连锁群分别位于 4
条染色体上，每个连锁群具有大约 13 个HOX基因［12］。
其中，HOX1-3 主要在头部枕骨区表达，HOX4-6 在
颈椎区表达（包括第一胸椎），HOX7-9 在胸腰区高
表 达，HOX10-11 在 腰 荐 区 表 达，HOX12-13 表 达
于荐尾区［13］。脊椎动物 HOX 基因主要在于调控胚
胎前后体轴和体节的分化。作为 HOX 家族的一员，
HOXC10 基因被证明与动物体节最后的发育存在紧
密的联系［14］，即控制着成骨细胞的分化、骨骼发生
及肢体的发育。
目前，HOX 基因是一个比较热门的研究领域，
对 HOX 的研究主要集中在胚胎及骨骼发育方面，但
在各组织中的表达和功能关系还未做深入研究［15］。
而 HOX 基因的突变和异常将会使他所调控的区域
发生畸形［16］。本试验成功克隆了 HOXC10 基因并
对其进行生物信息学分析，初步分析了金川多肋牦
牛 HOXC10 基因所编码的蛋白质的结构和功能，为
下一步探究 HOXC10 在调控多肋牦牛肋骨发育上的
功能奠定了理论基础。基因同源性比对结果显示多
肋牦牛 HOXC10 基因与其它物种具有较高的同源性，
暗示了 HOXC10 基因在调控动物发育过程中的重要
性 ；另外，本试验成功分析了 HOXC10 基因的表达
150
Position
-2.5
-2.0
-1.5
-1.0
-0.5sc
or
e
0.5
1.0
1.5
0
250 30020010050
图 4 HOXC10 蛋白质的亲疏水性分析
-7000
0 50 100 200 300150 250 350
-6000
-5000
-4000
-3000
-2000
-1000
1000
0
i->0
o->0
图 5 HOXC10 蛋白质跨膜区分析
97.8
1
1
2
3
4
5
6
7
8
D
iv
er
ge
nc
e
9
10
11
2 3 4 5
Percent Identity
6 7 8 9 10 11
86.0 93.9 96.1 97.9 96.1 68.7 63.3 95.5
90.1
93.2 ⢖⢋Bos grunniens㔥㖺Ovis aries唁⥙⥙Pan troglodytesᇦ啐Mus musculus傜Equus caballus⥛Felis catus䟾⥚Sus scrofa৏呑Gallus gallus⡚㸮Xenopus laevisӪHomo sapiens哴⢋bos taurus2.3 91.1 88.3 93.5 96.1 95.1 55.5 60.4 99.189.74.94.9 84.2 81.9 85.9 82.6 60.5 55.6 86.490.612.86.4 6.6 93.5 95.6 93.2 58.4 63.6 84.395.56.63.7 5.0 6.5 97.4 93.7 73.9 69.1 86.197.44.02.2 3.1 4.5 2.4 96.8 73.3 69.8 89.594.95.14.0 5.0 7.2 6.2 3.3 68.9 65.9 86.658.167.740.7 43.0 61.0 32.0 33.4 40.7 72.3 52.063.256.750.9 54.5 50.3 39.8 39.2 46.1 35.1 56.610.74.7 0.5 10.1 4.3 2.7 5.3 61.6 51.3 86.115.40.97.1 5.2 17.7 15.1 11.3 14.7 76.8 65.4
图 6 金川多肋牦牛 HOXC10 基因的同源性分析
0.4 0.3 0.2 0.1 0.0
⢖⢋Bos grunniens㔥㖺Ovis aries唁⥙⥙Pan troglodytesᇦ啐Mus musculus傜Equus caballus⥛Felis catus䟾⥚Sus scrofa৏呑Gallus gallus⡚㸮Xenopus laevisӪHomo sapiens哴⢋Bos taurus
图 7 基于 HOXC10 基因序列构建的牦牛与其他物种的系
统进化树
2014年第10期 143张亚南等：金川多肋牦牛 HOXC10基因的克隆、序列分析及组织表达
谱，组织表达分析结果表明 HOXC10 在牦牛大部分
组织中都有表达，尤其在肝脏、子宫中的表达量较
高，这与小鼠胚胎中表达谱结果基本一致［17］。基因
在不同组织中的表达量水平直接与其功能相关［18］，
HOXC10 基因在组织中的差异表达与功能的关联分
析将是下一步研究的重点内容。此外，由于环境的
显著差异性，推测基因的差异很可能存在于基因编
码区以外的区域，如启动子区域的甲基化水平的程
度往往会导致基因表达量的差异。
基于以上的研究结果，初步推测在金川多肋牦
牛体节发育过程中，HOXC10 可能有重要的调控作
用。当然，该基因的功能有待在已建立的牦牛的乳
腺上皮细胞系上进行验证［19］。后续试验将对多肋与
非多肋牦牛各主要器官 HOXC10 基因表达量进行定
量分析，以确定 HOXC10 基因的表达是否存在明显
差异性，为探索 HOXC10 基因的更多的分子机制提
供更有力的依据。
4 结论
本试验克隆的牦牛 HOXC10 基因包含一个 1 029
bp 的开放阅读框，编码 342 个氨基酸 ；该基因所
编码的蛋白属于亲水性蛋白质 ；牦牛与其它物种的
HOXC10 基因编码区序列具有较高的同源性，该基
因在生物进化上高度保守 ；进化结果显示，牦牛与
黄牛的亲缘关系最近。本研究分析序列和蛋白时，
选用多种软件，提高了结果的可靠性。
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（责任编辑 马鑫）