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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第7期
葡萄球菌蛋白 A（SPA），是金黄色葡萄球菌细
胞壁上的一种表面蛋白。SPA 能与多种哺乳动物血
清中的免疫球蛋白（IgG）的 Fc 片段相结合［1］，这
种特异性已经被广泛地应用在生物分离，医学分析
和诊断等领域［2，3］。
目前，亲和层析是主要的抗体纯化方法，这种
收稿日期 ： 2014-01-07
基金项目 ：国家科技重大专项（重大新药创制专项）（2014ZX09101043）
作者简介 ：任敬钢，男，硕士，研究方向 ：仿生亲和技术在蛋白纯化上 ；E-mail ：renjinggang@sjtu.edu.cn
通讯作者 ：李荣秀，男，博士，博士生导师，研究方向 ：生物医药新品种设计与研究开发，生物医药纯化新技术 ；E-mail ：rxli@sjtu.edu.cn
蛋白 A-葡聚糖 -Fe3O4 纳米磁珠的制备及对 IgG
分离纯化
任敬钢  程超  仲从浩  张丽  李荣秀
（上海交通大学微生物代谢国家重点实验室 上海交通大学生命科学技术学院，上海 200240）
摘 要 ： 蛋白 A（Staphylococcal Protein A，简称蛋白 A 或 SPA）是对 IgG 有特异性吸附能力的生物配基，将其偶联到葡聚糖
修饰的 Fe3O4 纳米磁珠上，研究 SPA 纳米磁珠对 IgG 的纯化能力。采用高温多元醇法合成不同粒径的纳米磁珠，研究磁珠粒径对
IgG 吸附量的影响，并对磁珠静态载量、吸附时间、可重复性进行研究，为工业化应用提供理论依据。通过控制反应体系中 NaOH
的浓度成功地合成了平均粒径从 30 nm 到 200 nm 的 Fe3O4 纳米磁珠，通过吸附量试验证明了磁珠粒径对 IgG 吸附量有较大影响，
当磁珠平均粒径在 101.5 nm 时对 IgG 的吸附量最大，静态吸附载量为 84.85 mg/mL，亲和常数为 3.48×106 M-1。对磁珠进行 5 次循
环再生试验后，磁珠的吸附性能没有明显的降低。利用磁珠能高效快速地从人血清中纯化到 IgG，纯度达到 93.5%（SDS-PAGE），
回收率为 88.7%。因此，这种磁性分离基质在 IgG 纯化中有较大的应用潜力，
关键词 ： 葡聚糖 纳米磁珠 蛋白 A IgG 纯化
Fe3O4 Magnetic Dextran Nanoparticles Modified with SPA Ligand for
IgG Purification
Ren Jinggang Cheng Chao Zhong Conghao Zhang li Li Rongxiu
（State Key Laboratory of Microbial metabolism，and School of Life Sciences & Biotechnology，Shanghai Jiao Tong University，
Shanghai 200240）
Abstract:  The objective of present research is to prepare magnetic dextran nanoparticles conjugated with Staphylococcal Protein A（SPA-
MDPs）for the purification of IgG. The magnetic nanoparticles were prepared by following a high-temperature solution-phase procedure, and the
average particle size can be tuned from 30 to 200 nm by simply varying the concentration of NaOH during the reaction. The size of SPA-MDPs
nanoparticles has a great influence on their adsorption capacity for IgG. A maximum adsorption of human IgG was calculated to be 84.85 mg/mL
with a binding affinity constant of 3.48×106 M-1 when the average size of SPA-MDPs is about 101.5 nm. The experiment results also demonstrated
that the SPA-MDPs nanoparticles can be recycled for 5 times with minor loss of adsorption capacity. Moreover, IgG was purified from
human plasma with a purity of 93.5% and recovery of 88.7%. Thus, SPA-MDPs show promising potentials for isolation and purification of IgG.
Key words:  Dextran Magnetic nanoparticles SPA IgG purification
纯化策略是基于抗体分子和偶联在固相基质上的亲
和配体之间的特异性识别来实现的。大多数用于固
定配体的固相基质为多孔性微米级载体，如琼脂糖
凝胶、葡聚糖凝胶和高分子树脂等。但是这种层析
介质存在使用寿命短、柱床堵塞、容易坍塌的问题，
一定程度上限制了其应用。磁性材料在 1960 年出
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第7期202
现后［4］，得到科学家的广泛关注。磁性材料具有超
顺磁性［5］、高比表面积［6］、生物相容性好［7］等优
点，已经被应用到多个领域。相比于层析介质，磁
性分离技术具有快速、简便、高回收率、重复性好
等显著优势。虽然已经出现了商品化的 SPA 偶联磁
性材料，但是相关磁性材料制造成本高、吸附载量
低，限制了其在大规模工业化纯化的应用［8，9］。目
前，国内研究者大多使用国外公司的磁性微球及相
关产品，国产的高质量磁性分离材料及相关应用产
品的研发尚处在起步阶段。因此，有必要开发一种
应用性强的国产抗体纯化磁性材料，在降低抗体纯
化费用的同时，又能提高纯度和回收率，为高效快
速地纯化抗体奠定基础。
葡聚糖修饰的 Fe3O4 纳米磁珠（Magnetic dextran
nanoparticle，MDPs）相比于其他磁性材料合成简便、
成本低廉，葡聚糖的修饰还增大了磁珠生物相容性
和化学稳定性［10］，葡聚糖对生物分子几乎不存在特
异性吸附，由葡聚糖制成的凝胶常用来进行生化分
离，如柱层析。同时，这种磁珠表面含有丰富的可
活化羟基，这为配体的偶联提供了反应位点，是一
种理想的磁性材料。目前 MDPs 主要应用在生物分
离和生物检测中［11，12］，在生物分离领域，常被用来
分离蛋白［13］，细胞［14］，细菌［15］等。
本研究主要将 SPA 偶联到 MDPs 上研究其纯化
IgG 的性能。有文献报道磁珠的粒径对蛋白吸附载
量有一定的影响［16］，因此本研究将考察不同粒径
SPA-MDPs 对抗体吸附量的影响，找到最佳的吸附
粒径，进而对 SPA-MDPs 的静态载量、可重复性进
行分析，优化吸附时间，并利用 SPA-MDPS 对人血
清抗体进行纯化，为工业化应用奠定试验基础和提
供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
人血清经 5 000 r/min 离心后取上清，低温保存；
蛋白 A 购于上海荣君生物医药有限公司 ；IgG 利用
GE ProteinA 亲和层析柱纯化人血清得到 ；FeCl3·
6H2O、FeCl2·4H2O 购于阿拉丁试剂有限公司 ；葡
聚糖 2 万、一缩二乙二醇（DEG），环氧氯丙烷购于
国药集团化学试剂公司 ；其他试剂均为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 MDPs 的制备及表征
1.2.1.1 MDPs 制备 所有合成试验均在通有干燥氮
气的标准 Schlenk line 中进行，通过高温多元醇法制
备水溶性超顺磁性纳米磁珠［17］。首先制备 NaOH/
DEG 反应液，将 50 mmol NaOH 加入到 20 mL DEG
中，搅拌加热至 NaOH 完全溶解后取出，70℃保存
待用。将 10 mmol FeCl2·4H2O、20 mmol FeCl3·6H2O
（摩尔比为 12）溶解在 200 mL DEG 中，加入 5 g
葡聚糖，温度升高到 210℃，充分搅拌反应 30 min
后，缓慢加入不同体积的 NaOH/ DEG 反应液（15，
20，25，30，35 mL），控制温度在 210℃，反应溶
液变为黑绿色。在此条件下反应 2 h。所得产物冷却
至室温，用乙酸乙酯和乙醇的混合溶液、乙醇和去
离子水的混合溶液分别清洗磁珠，除去未反应的修
饰物和 DEG。最后将黑褐色的 Fe3O4 纳米磁珠分散
在去离子水中。
1.2.1.2 磁珠表征 用透射电子显微镜（TEM）分
析纳米磁珠的微观形貌和结构、用纳米粒度分析仪
（DLS）对粒径及分布情况进行分析，并对磁珠的分
散性和磁响应性进行研究［18］，分散性是在室温下取
1 mL 纳米磁珠放入试管中，加入 20 mL 去离子水，
在自然条件下沉降 5 h 后，吸附试管 1/2 处的溶液，
用紫外分光光度计检测透光率，透光率能间接的反
应分散性，透光率越低分散性越好。磁响应性是在
1 500 高斯的磁铁环境下沉降 1 min 后，吸取试管
1/2 处的溶液，用紫外分光光度计检测透光率，透光
率能间接的反应磁响应效应，透光率越高磁响应性
越高。
1.2.2 SPA-MDPs 的制备
1.2.2.1 MDPs 环氧活化 分别取不同粒径的纳米
磁珠 10 mL，用水清洗至 pH 为中性。加入 10 mL
1 mol/L NaOH、10 mL 环 氧 氯 丙 烷、20 mL DMSO，
50℃下反应 3 h。反应结束后用大量去离子水洗涤至
中性，并对环氧基密度进行检测［19］。
1.2.2.2 MDPs 与蛋白 A 偶联 称取不同粒径的环氧
氯丙烷活化的纳米磁珠各 5 mL，加入 10 mL 蛋白 A
偶联液（0.2 mol/L Na2CO3 溶液，pH8.5，蛋白 A 浓
度为 10 mg/mL）、1 g 硫酸钠。37℃下转动反应 16 h。
2014年第7期 203任敬钢等 ：蛋白 A-葡聚糖-Fe3O4 纳米磁珠的制备及对 IgG 分离纯化
用去离子水清洗，收集清洗液，用 20% 乙醇 4℃保存。
收集的洗脱液进行 BCA 蛋白定量。
1.2.3 SPA-MDPs 对 IgG 纯化性能研究
1.2.3.1 粒 径 对 IgG 纯 化 载 量 研 究 取 0.2 mL 不
同粒径的 SPA-MDPs 于 4 mL 离心管中，通过磁性
分 离 方 法， 用 2 mL PBS（10 mmol/L，pH7.0，150
mmol/L NaCl）对磁珠进行平衡。向磁珠中加入 2 mL
10 mg/mL 的 IgG 溶液，在室温下旋转孵育 30 min。
用 PBS 洗杂，再用 0.5 mL 0.1 mol/L Gly-HCl（pH3.0）
进行洗脱，收集洗脱液并用 BCA 法测定蛋白浓度，
计算吸附的抗体量。
1.2.3.2 最佳吸附时间研究 分别取偶联效果最好
的磁珠 0.1 mL 放入 5 个离心管中，加入 5 mL 不同
浓度的抗体偶联液，在室温下旋转反应偶联不同的
时间（时间分别为 1，2，5，10，15，20 min），测
定抗体的吸附量。
1.2.3.3 静态吸附量研究 磁珠静态吸附量的测定
方法采用 Katsos 的研究方法［20］。取吸附性能最好
的纳米磁珠 0.2 mL，将 IgG 用 PBS 稀释至不同浓度
（0.5，1.0，1.6，3.2，5.4，8.3，10.1，12.9 mg/mL），
加入到用 PBS 平衡好的磁珠中，总体积为 5 mL。在
25℃下旋转孵育 12 h。吸取上清液，测定上清液中
抗体浓度，根据物料平衡原则，计算抗体吸附量。
1.2.3.4 循环性研究 取吸附效果最好的磁珠 0.2
mL，通过磁性分离方法，加入 1 mL 人血清样品，
进行平衡、上样，孵育 20 min，10 mmol/L PBS 洗杂、
0.1 mol/L Gly-HCl 洗脱 5 个纯化步骤，进行 5 次循环
试验。用 BCA 法测定洗脱的抗体量。
1.2.3.5 从 人 血 清 中 纯 化 IgG 向 平 衡 好 的 SPA-
MDPs 中加入 2 mL 人血清样品，室温下旋转孵育 10
min，2 mL PBS 进行洗杂，0.5 mL 0.1 mol/L Gly-HCl
（pH3.0）进行洗脱，收集洗脱液。对洗杂液、洗脱
液进行 BCA 蛋白定量，测定抗体浓度，计算回收率：
回收率 = 洗脱液抗体量 / 血清中抗体量。用 SDS-
PAGE 测定抗体纯度。
2 结果
2.1 不同粒径纳米磁珠物理特性分析
2.1.1 MDPs 的 TEM 图谱和粒径分析 为研究磁珠
粒径对抗体吸附量的影响，首先要合成不同粒径的
磁珠，反应溶液中碱性的增加能促进铁盐的水解聚
合，因此通过控制反应体系中 NaOH/DEG 反应液的
浓度合成出平均粒径在 30-200 nm 之间的纳米磁珠。
表 1 所示的是 5 组磁珠平均粒径，分别为（29.4±
4.3），（52.8±8.8），（101.5±11.6），（147.7±21.9），
（198.3±15.8）nm，随着 NaOH/DEG 反应液浓度的
增加，磁珠平均粒径不断增大，当 NaOH/DEG 浓
度为 7.5% 时，磁珠平均粒径为 29.4 nm，当 NaOH/
DEG 浓度增加到 17.5% 时，磁珠平均粒径增大到
198.3 nm。磁珠的形貌如图 1，TEM 照片显示磁珠为
球形，另外 TEM 粒径与纳米粒度分析仪测定的粒径
基本一致，证明了控制 NaOH 反应浓度能合成不同
粒径的纳米磁珠。
表 1 NaOH 浓度影响 MDPs 合成的反应条件和结果
编号 葡聚糖浓度 NaOH/DEG 偶联液浓度 平均粒径（nm）
1 2.5% 7.5% 29.4±4.3
2 2.5% 10.0% 52.8±8.8
3 2.5% 12.5% 101.5±11.6
4 2.5% 15.0% 147.7±21.9
5 2.5% 17.5% 198.3±15.8
2.1.2 MDPs 分散性和磁响应性研究 磁珠分散性
对抗体吸附量也有一定影响，高分散性的磁珠不易
发生团聚，增加与抗体碰撞几率，从而影响吸附量。
分散性是通过测定磁珠在自然沉降 5 h 后透光率来
反映，透光率越大，分散性越好，随着粒径的增大，
透光率先变小后变大，表明分散性先变大后变小。
如图 2-A 所示，平均粒径在 52.8 nm 时，透光率最
小，分散性也越好。在抗体的快速捕获阶段，需要
磁珠对磁场有快速地相应，可以通过磁响应性来检
测。磁响应性是磁珠在磁场作用 1 min 测定透光率
来反映，透光率越大，磁响应性越大。如图 2-B 所
示，随着磁珠粒径的增大，磁响应性先变大再变小，
当磁珠平均粒径在 101.5 nm 时，磁珠的磁响应性最
高，透光率达到 97%。在磁场 30 s 基本被吸附如图 3。
说明合成的 MDPs 能通过磁铁快速进行固液分离。
2.2 纳米磁珠吸附特性研究
2.2.1 不同粒径 MDPs 环氧基密度 MDPs 表面含有
丰富的羟基，羟基反应活性弱，而环氧基易于氨基
或或巯基反应，因此首先对磁珠进行环氧活化，本
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第7期204
30
A D
B E
C
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In
te
ns
ity
%
10
0
1 10 100 1000
Sizer.nm
16
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In
te
ns
ity
%
0
4
8
1 10 100 1000
Sizer.nm 25201510Intensity% 05 1 10 100 1000Sizer.nm
20
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8
In
te
ns
ity
%
0
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Sizer.nm
30
20
In
te
ns
ity
%
10
0
1 10 100 1000
Sizer.nm
A ：29.4 nm ；B ：52.8 nm ；C ：101.5 nm ；D ：147.7 nm ；E ：198.3 nm
图 1 不同 NaOH 浓度下制备得到的磁珠透射电镜照片和粒径分布图
60A
50
40
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20
100
95
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80
29.4 52.8 101.5 147.7 198.9
Nanoparticle sizenmTransmittance%
B
29.4 52.8 101.5 147.7 198.9
Nanoparticle sizenmTransmittance%
图 2 不同粒径 MDPs 分散性（A）和磁响应性（B）结果
A B C D
A ：0 s ；B ：10 s ；C ：20 s ；D ：30 s
图 3 MDPs 在磁场中不同时间的状态
试验用环氧氯丙烷对 MDPs 进行活化。通过分析磁
珠的环氧基密度来检测纳米磁珠的活化效果。如图
4 所示，随着磁珠粒径的增大环氧基密度不断减小，
平均粒径在 29.4 nm 时环氧基密度最高，为 73.81
μmol/mL，平均粒径在 198.9 nm 时环氧基密度最低，
为 35.75 μmol/mL。
2.2.2 不同粒径 SPA-MDPs 的蛋白 A 密度 环氧基
易与蛋白 A 上的氨基或巯基发生反应，从而使蛋白
A 偶联到 MDPs 上。蛋白 A 的偶联量影响磁珠对抗
体的吸附量。蛋白 A 密度如图 5 所示，从结果中可
2014年第7期 205任敬钢等 ：蛋白 A-葡聚糖-Fe3O4 纳米磁珠的制备及对 IgG 分离纯化
以看出，随着磁珠粒径的增大，蛋白 A 密度先变大
后变小，当平均粒径达到 52.8 nm 时，蛋白 A 密度
最高，达到 6.3 mg/mL，198.9 nm 磁珠的蛋白 A 密度
最低，为 4.9 mg/mL。而 29.4 nm 的磁珠虽然有最大
的环氧基密度，但蛋白 A 密度为 5.8 mg/mL，低于
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0
29.4 52.8 101.5 147.7 198.9
Nanoparticle sizenmEpoxy densityμmol/mL MDPs
图 4 不同粒径纳米磁珠上的环氧基密度
7
6
5
4
3
29.4 52.8 101.5 147.7 198.9
Nanoparticle sizenmSPA boundμmol/mL MDPs
图 5 不同粒径纳米磁珠上的偶联耐碱蛋白 A 的量
101.5 nm 磁珠（密度为 6.1 mg/mL）。
2.2.3 不 同 粒 径 SPA-MDPs 对 IgG 的 吸 附 量 结
果 在磁珠中加入过量等浓度的 IgG 溶液，孵育 15
min，用 pH 3.0 的甘氨酸洗脱液进行洗脱，测定洗
脱液中 IgG 的含量，从而得出不同粒径 SPA-MDPs
对抗体的吸附量，如图 6，结果显示不同粒径纳米
磁珠对抗体吸附量有明显差别。平均粒径在 101.5
nm 时抗体吸附量最大，载量为 77.4 mg/mL。平均
粒径为 52.8 nm 磁珠，其抗体吸附量为 66.8 mg/mL。
29.4 nm 磁珠的吸附量为 59.7 mg/mL，低于 147.7 nm
磁珠抗体吸附量（62.6 mg/mL）。对各组数据之间进
行差异显著性检验，各组之间差异明显，其中第 3
组与其他各组都有显著差异（P<0.01），表明平均粒
径为 101.5 nm 的磁珠是纯化抗体的最佳粒径。
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60
40
20
0
29.4 52.8 101.5 147.7 198.9
Nanoparticle sizenmAdsorbed hlgGmg/mL MDPs
图 6 不同粒径 SPA-MDPs 对抗体的吸附量
2.2.4 偶联时间对抗体吸附量的影响 吸附时间对
磁珠的动态吸附量有较大的影响［21］，以 101.5 nm 磁
珠为研究对象，在不同浓度和不同时间下研究抗体
吸附量的变化如图 7。孵育 10 min 后 IgG 的吸附量
基本达到稳定，即使延长吸附时间，抗体吸附量基
本保持不变，说明在 10 min 后就已经达到平衡。同
时发现 IgG 的起始浓度对吸附量有一定的影响，这
种现象可用蛋白-蛋白吸附理论来解释［22］，蛋白浓
度升高，分子间碰撞机会增大，加剧了蛋白之间的
相互作用，因此提高的 IgG 浓度能提高 SPA-MDPs
80
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0
0 5 10 15
Adsorption timeminAdsorbed hlgGmg/mL MDPs 0.5 mg/mL1.0 mg/mL1.5 mg/mL
图 7 在不同吸附时间和浓度下的 IgG 吸附量
对抗体的吸附量。
2.2.5 SPA-MDPs 静态吸附量研究 静态吸附载量
是依据斯卡查德理论来反映［23］，Q =（Qmax×C*）/
（Kd+C*），Q 代表吸附在磁珠上的抗体，Qmax 代表磁
珠对抗体的理论最大吸附量，C* 溶液中抗体的浓度，
Kd 代表的是解离常数。SPA-MDPs 的静态吸附性能
如图 8，经过 GraphPad prism 5 软件模拟分析，得出
最大静态吸附量 Qmax 为 84.85 mg/mL，解离常数 Kd
为 3.48×106 M-1。
2.2.6 SPA-MDPs 可循环性研究 用人血清进行偶联
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第7期206
表明 SPA-MDPs 对 IgG 有较高特异性，且特异性并
没有因为固相基质而改变。计算回收率得出，磁珠
对抗体的纯化具有较高的回收率，在 pH 3.0 洗脱条
件下对人血清抗体的回收率为 88.7%。
80
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20
0
0 5 10 15
hlgGmg/mLAdsorbed hlgGmg/mL MDPs
图 8 SPA-MDPs 吸附等温线
吸附-解离试验来检测 SPA-MDPs 循环性，重复循环
5 次，计算 IgG 的洗脱量。如图 9 显示，在 5 次循
环后抗体吸附能力只下降了 2.0%-3.0%，说明 SPA-
0 54321
Reutilization Cycles
90
80
70
60
50
40
A
ds
or
be
d
hl
gG
mg/mL MDPs
图 9 SPA-MDPs 可重复性研究（循环使用 5 次）
MDPs 能对 IgG 进行多次循环纯化。
2.3 SPA-MDPs纯化人血清抗体效果研究
直 接 从 人 血 清 中 纯 化 抗 体 是 SPA-MDPs 纯 化
性能的具体表现，对人血清样品纯化后进行 SDS-
PAGE 电泳，结果如图 10 所示，1 号泳带是血清原
样，泳道上含有多种蛋白，3 条明显的条带分别是
白蛋白（62 kD 左右）、抗体重链（50 kD 左右）、抗
体轻链（28 kD 左右）。2 号泳带是将血清原样加入
纳米磁珠中，室温下旋转孵育 10 min，2 mL PBS 进
行洗杂，将洗杂液进行 SDS-PAGE 电泳。由于抗体
都被吸附到磁珠上，在洗杂液中主要以杂蛋白为主，
几乎没有抗体。3 号泳带是将洗杂后的磁珠用 0.5
mL 0.1 mol/L Gly-HCl（pH3.0）进行洗脱，将洗脱液
进行 SDS-PAGE 电泳，两条主要的条带分别抗体重
链（50 kD 左右）、抗体轻链（28 kD 左右）。通过
ImageLab 软件分析 3 号泳带得出抗体纯度为 93.5%，
116.0
kD
M 1 2 3
66.2
45.0
35.0
25.0
18.4
14.4
M ：蛋白分子量标准 ；1 ：人血清原样 ；2 ：流穿 ；3 ：pH 3.0 洗脱
图 10 SPA-MDPs 人血清抗体 SDS-PAGE 电泳图
3 讨论
纳米磁性材料的合成方法有共沉淀法、高温分
解法、胶束法等，其中高温多元醇法合成的磁珠磁
性强、分散性好，粒径均匀，Gao 等［24］报道了磁珠
的形成过程，加入 NaOH 提高反应体系的碱性，使
FeCl3 和 FeCl2 更容易发生水解，形成 Fe（OH）3 和
Fe（OH）2，在高温的作用下最终脱水 Fe3O4 颗粒，
从而形成较大颗粒的物质。因此在本研究中，通过
改变体系中 NaOH/DEG 反应液浓度成功合成了平均
粒径在 30-200 nm 之间的 MDPs。通过试验测定了
其磁响应性和分散性。结果表明高温多元醇法制备
的磁珠操作简便，易于控制，响应性高、分散性好，
满足抗体快速纯化的要求，非常适合作为抗体纯化
的固相基质。
为了研究粒径对抗体吸附量的影响，分别分析
了不同粒径磁珠的环氧基密度、蛋白 A 密度、抗体
吸附量。结果表明，磁珠粒径越小，比表面积越大，
利于环氧活化的位点越多，环氧基密度与磁珠比表
面积是成正比。用蛋白 A 偶联后，29.4 nm 磁珠有最
大的环氧基密度，但蛋白 A 密度却低于 52.8 nm 和
101.5 nm 磁珠，可能 29.4 nm 磁珠上环氧基之间距离
接近，一个蛋白 A 会在偶联时屏蔽掉多个环氧基位
点，导致偶联的蛋白 A 量少。当磁珠平均粒径大于
52.8 nm 时，随着粒径的增大，蛋白 A 密度不断减小，
与环氧基密度变化趋势一致，因此粒径和环氧基密
2014年第7期 207任敬钢等 ：蛋白 A-葡聚糖-Fe3O4 纳米磁珠的制备及对 IgG 分离纯化
度决定了 52.8 nm 的磁珠蛋白 A 密度最高。由于抗
体本身具有一定的空间结构，直径在 15 nm 左右［1］，
在与 SPA-MDPs 结合时，存在一定的空间位阻效应。
从抗体吸附量上看，吸附量先变大，在 101.5 nm 达
到最大，随后逐渐减小。原因是磁珠粒径过小时，
抗体之间的竞争性吸附大，不利于抗体的结合［25］。
当粒径增大，空间位阻效应减小，起主导作用的是
磁珠上的蛋白 A 密度，蛋白 A 密度越大，偶联抗体
量越大，磁珠粒径和蛋白 A 密度决定了磁珠平均粒
径在 101.5 nm 时载量最大。
吸附时间对抗体吸附量有较大影响，SPA-MDPs
在 10 min 后的抗体吸附量就已经饱和，延长时间不
能再增加其吸附量。此外，也发现增加抗体浓度会
提高抗体的吸附量，采用 Katsos 的研究方法对其静
态吸附量进行测定，GraphPad prism 5 软件模拟分析
的磁珠静态吸附量 Qmax 为 84.85 mg/mL，目前载量
最大的磁珠是 GE 公司的 Protein A Mag SepharoseTM
Xtra，最大载量也只有 30 mg 人 IgG/mL，并且 SPA-
MDPs 也大于商业化的蛋白 A-Agarose 介质的静态载
量［26］，因此 SPA-MDPs 在载量上满足工业纯化的要
求。在经过 5 次循环试验后，磁珠对抗体的吸附载
量并没有很大的降低，说明该方法合成的磁珠具有
较高的稳定性，能进行多次循环使用。应用蛋白 A
磁珠对人血清进行纯化得到抗体纯度为 93.5%，回
收率为 88.7%，商业化的蛋白 A-Agarose 介质纯化抗
体纯度通常为 95% 左右［1］，回收率在 60%-80% 之
间［19］，说明 SPA-MDPs 对抗体纯化有较高的纯度和
回收率，能较好地应用于抗体的分离纯化。
4 结论
葡聚糖修饰的 MDPs 是生物磁性分离的理想材
料，在偶联上耐碱蛋白 A 后，制备了对 IgG 有特异
性吸附的 SPA-MDPs。通过研究粒径对抗体吸附载
量的影响，发现平均粒径为 101.5 nm 的磁珠对抗体
吸附量最大，吸附量、纯度、回收率、循环性试验
的研究结果证明了 SPA-MDPs 能较好地对抗体进行
纯化，分离速度快且易于操作。因此，本研究制备
的蛋白 A 偶联的葡聚糖纳米磁珠是一种具有应用潜
力和市场前景的抗体分离载体。
参 考 文 献
［1］ Hober S, Nord K, Linhult M. Protein A chromatography for antibody
purification［J］. Journal of Chromatography B, 2007, 848（1）：
40-47.
［2］ Speziale P, Pietrocola G, Rindi S, et al. Structural and functional role
of Staphylococcus aureus surface components recognizing adhesive
matrix molecules of the host［J］. Future Microbiology, 2009, 4（10）：
1337-1352.
［3］ Hattum HV, Nathaniel Martin I, Ruijtenbeek R, et al. Development
of a microarray detection method for galectin cancer proteins based
on ligand binding［J］. Analytical Biochemistry, 2012, 434（13）：
99-104.
［4］ Chang TM. Sempermeable aqueous microcapsules（“Artificial
Cells”）：with emphasis on experiments in an extracorporeal shunt
system［J］. ASAIO Journal, 1966, 12（1）：13-19.
［5］ Ditsch A, Yin J, Laibinis PE, et al. Ion-exchange purification of
proteins using magnetic nanoclusters［J］. Biotechnology Progress,
2006, 22（4）：1153-1162.
［6］ Boyer C, Whittaker MR, Bulmus V, et al. The design and utility
of polymer-stabilized iron-oxide nanoparticles for nanomedicine
applications［J］. NPG Asia Materials, 2010, 2（1）：23-30.
［7］ Dias A, Hussain A, Marcos AS, et al. A biotechnological perspective
on the application of iron oxide magnetic colloids modified with
polysaccharides［J］. Biotechnology Advances, 2011, 29（1）：
142-155.
［8］ Cao Y, Tian W, Gao S, et al. Immobilization staphylococcal protein A
on magnetic cellulose microspheres for IgG affinity purification［J］.
Artificial Cells, Blood Substitutes and Biotechnology, 2007, 35（5）：
467-480.
［9］ Tsushima S. Production of human monoclonal autoantibodies
that react with islet-cell-surface antigens by EBV-transformed
lymphocytes ：new method of preselection of ICSA producing
lymphocyte by protein A magnetic microspheres［J］. The
Hokkaido Journal of Medical Science, 1988, 63（4）：73-88.
［10］ Shinkai M. Funct ional magnet ic par t ic les for medical
application［J］. Journal of bioscience and bioengineering, 2002,
94（6）：606-613.
［11］ Kaittanis C, Nath S, Perez JM. Rapid nanoparticle-mediated
monitoring of bacterial metabolic activity and assessment of
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第7期208
antimicrobial susceptibility in blood with magnetic relaxation［J］.
PLoS One, 2008, 3（9）：3253-3256.
［12］ Kaittanis C, Santra S, Perez JM. Emerging nanotechnology-based
strategies for the identification of microbial pathogenesis［J］.
Advanced Drug Delivery Reviews, 2010, 62（4）：408-423.
［13］ Heebøll-Nielsen A, Justesen SF, Thomas OR. Fractionation
of whey proteins with high-capacity superparamagnetic ion-
exchangers［J］. Journal of Biotechnology, 2004, 113（1）：247-
262.
［14］ Huang X, Zhuang J, Chen D, et al. General strategy for
designing functionalized magnetic microspheres for different
bioapplications［J］. Langmuir, 2009, 25（19）：11657-11663.
［15］ Duan H, Shen Z, Wang X, et al. Preparation of immunomagnetic
iron-dextran nanoparticles and application in rapid isolation of
E. coli O157 ：H7 from foods［J］. World Journal of Gastroente-
rology, 2005, 11（24）：3660-3664.
［16］ Kavaz D, Odabas S, Denkbas EB, et al. A practical methodology for
IgG purification via chitosan based magnetic nanoparticles［J］.
Digest journal of Nanomaterials and Biostructures, 2012, 7（3）：
1165-1177.
［17］ Hradil J, Pisarev A, Babič M, et al. Dextran-modified iron oxide
nanoparticles［J］. China Particuology, 2007, 5（1）：162-168.
［18］ 李玉珍 , 刘学涌 , 陈晓凯 , 等 . 两亲磁性高分子微球与人血清
白蛋白的相互作用［J］. 中国药学杂志 , 2004, 39（9）：682-
684.
［19］ Teng S F, Sproule K, Husain A, et al. Affinity chromatography on
immobilized “biomimetic” ligands ：synthesis, immobilization
and chromatographic assessment of an immunoglobulin G-binding
ligand［J］. Journal of Chromatography B ：Biomedical Sciences
and Applications, 2000, 740（1）：1-15.
［20］ Katsos NE, Labrou NE, Clonis YD. Interaction of L-glutamate
oxidase with triazine dyes ：selection of ligands for affinity
chromatography［J］. Journal of Chromatography B, 2004, 807（2）：
277-285.
［21］ Albarghouthi M, Fara DA, Saleem M, et al. Immobilization of
antibodies on alginate-chitosan beads［J］. International Journal
of Pharmaceutics, 2000, 206（1）：23-34.
［22］ Deshpande SS. Enzyme immunoassays ：from concept to product
development［M］. Springer, 1996.
［23］ Kong Y. Ligand binding on ladder lattices［J］. Biophysical
Chemistry, 1999, 81（1）：7-21.
［24］ Gao J, Gu H, Xu B. Multifunctional magnetic nanoparticles ：
design, synthesis, and biomedical applications［J］. Accounts of
Chemical Research, 2009, 42（8）：1097-1107.
［25］ Dios AS, Díaz-García ME. Multifunctional nanoparticles ：
analytical prospects［J］. Analytica Chimica Acta, 2010, 666（1）：
1-22.
［26］ Füglistaller P. Comparison of immunoglobulin binding capacities
and ligand leakage using eight different protein A affinity
chromatography matrices［J］. Journal of Immunological Methods,
1989, 124（2）：171-177.
（责任编辑 李楠）