全 文 ：收稿日期:2009-04-10;　修订日期:2009-11-11
基金项目:国家自然科学基金项目(No.30760308);
国家 “十一五 ”科技支撑计划项目(No.2007BAI30B03)
作者简介:安惠霞(1984-),女(回族),新疆乌鲁木齐人 ,现为石河子大学
在读硕士研究生 ,学士学位 ,主要从事中药药理学研究工作.
＊通讯作者简介:古力娜 ·达吾提(1965-), 女(维吾尔族),新疆伊犁人 ,
现任新疆维吾尔自治区维吾尔医医院副主任药师 ,学士学位 ,主要从事中
药药理学研究工作.
地锦草提取物对红色毛癣菌酶活性的影响
安惠霞1 ,李治建 1 ,古力娜·达吾提 2＊ ,斯拉甫·艾白2, 3
(1.新疆石河子大学药学院 ,新疆 石河子　832000;
2.新疆维吾尔自治区维吾尔医医院 ,新疆 乌鲁木齐　830049;
3.新疆维吾尔自治区维吾尔医药研究所 ,新疆 乌鲁木齐　830049)
摘要:目的 研究地锦草提取物对红色毛癣菌角鲨烯环氧化酶和 β -(1, 3)-D-葡聚糖合成酶的影响 ,探讨其抗真菌作
用机制。方法 药物干预红色毛癣菌后分离菌体 , 按试剂盒要求处理样品 ,利用酶联免疫法和荧光分光光度法 , 研究地锦
草提取物对红色毛癣菌角鲨烯环氧化酶和 β -(1, 3)-D-葡聚糖合成酶活性的作用。结果 地锦草提取物 256 μg·
ml-1时 , 可显著降低红色毛癣菌中角鲨烯环氧化酶的活性(P<0.01);不同浓度的地锦草提取物 , 均可降低红色毛癣菌 β
-(1, 3)-D-葡聚糖合成酶的活性(P<0.01)。结论 地锦草提取物抗真菌机制可能与抑制角鲨烯环氧化酶和 β -(1,
3)-D-葡聚糖合成酶的活性有关。
关键词:地锦草提取物;　角鲨烯环氧化酶;　酶联免疫吸附试验;　β -(1, 3)-D-葡聚糖合成酶;　荧光分光光度法
中图分类号:R962;R291.5　　文献标识码:A　　文章编号:1008-0805(2010)04-0787-02
StudyontheEffectofEuphorbiahumifusaExtractonEnzymaticActivityofTrichophyton
rubrum
ANHui-xia1 , LIZhi-jian1 , Gulnar·Dawuti2 , Silafu·Aibai2, 3
(1.ShiheziUniversity, Shihezi832000 , China;2.XinjiangUighurMedicalHospital, Urumqi830049, China;
3.InstituteofXinjiangUighurMedicine, Urumqi830049, China)
Abstract:ObjectiveTostudytheeffectofEuphorbiahumifusaextract(EHE)onsqualeneepoxidaseandβ -(1, 3)-D-glu-
cansynthaseofT.rubrumanditsmechanism.MethodsTreatedT.rubrumwithEHE, studiedtheefectsofEHEonsqualence
epoxidaseactivityinT.rubrumcellmembranebyELISAtestandβ -1, 3-glucansynthaseactivityinT.rubrumcelwalbyfluo-
rospectrophotometry.ResultsTheELISAtestresultsshowedthatsqualeneepoxidaseactivitywasdecreasedsignificantly(P<
0.01, vsgrowthcontrol)inT.rubrumwhentheconcentrationofEHEwas256 μg· ml-1.Thefluorospectrophotometrytestre-
sultsshowedthatβ -(1, 3)-D-glucansynthaseactivitywasdecreasedsignificantlyinT.rubrumtreatedwithlow, middleand
highconcentrationsofEHE(P<0.01, vsgrowthcontrol).ConclusionTheantifungalmechanismmayberelatedtoitsinhibition
onsqualeneepoxidaseandβ -(1, 3)-D-glucansynthaseactivityinfungus.
Keywords:Euphorbiahumifusaextract;　Squaleneepoxidase;　Elisatest;β -1, 3-D-glucansynthase;　Fluorospectro-
photometry
　　红色毛癣菌 T.rubrum是临床常见的皮肤癣菌 , 也是浅部真
菌病的主要病原菌 , 其中 69.5%的皮肤癣菌病是由红色毛癣菌
感染所致 [ 1, 2] 。地锦草 Euphorbiahumifusa是维吾尔医常用药材 ,
临床主要用于治疗手癣 、体癣 、足癣 、花斑癣及银屑病等 [ 3] 。文
献报道 [ 4～ 8] ,地锦草具有显著的抗真菌作用 , 尤其对毛癣菌属
Trichophyton的红色毛癣菌最敏感。为了探讨地锦草提取物抗皮
肤癣菌的作用机制 , 本实验研究了地锦草提取物对红色毛癣菌角
鲨烯环氧化酶活性和 β -(1, 3)-D-葡聚糖合成酶的影响 , 为
地锦草的开发利用提供实验依据。
1 　材料
1.1　 药物 地锦草提取物(EHE,批号:20080117), 由新疆维吾
尔医药研究所药剂室提供 , 提取方法及质量控制 , 参照 《中华人
民共和国药品标准· 维吾尔药分册》中百癣夏塔热片之地锦草
提取方法及质量控制 [ 9] , 用二甲基亚砜(DMSO)溶解制成浓度为
102.4mg· ml-1的储存液 ,存于 -60℃冰箱备用。
1.2 　菌株 红色毛癣菌 T.rubrum 1株 , 菌株编号:XYZT.r
40001, 由新疆医科大学真菌与真菌病研究中心菌种保藏库
(XYZ)提供。
1.3　试剂 RPMI-1640培养基和三氮吗啡琳丙磺酸(MOPS),
美国 Gibco公司产品;沙堡氏琼脂培养基(SDA),北京奥博星生
物科技有限公司产品 ,批号:20080228;真菌角鲨烯环氧化酶酶联
免疫分析试剂盒(FungussqualenceepoxidaseELISAkit),美国 Us-
cnlife公司产品 , 编号:EN1007fu;GENMED真菌细胞 β -(1, 3)-
D-葡聚糖合成酶活性定量检测试剂盒 ,美国 GENMEDSCIENTI-
FICSINC产品 ,编号:GMS50276.1v.A。
1.4 　仪器 FM型生化培养箱 , 上海福玛实验设备有限公司产
品;BHC-1300Ⅱ A型生物安全柜 , 苏州安泰空气技术有限公司
产品;Alegra64R型高速低温离心机 , 美国 Beckman公司产品;
JY92-Ⅱ型超声波细胞粉碎仪 , 宁波新芝科器研究所;Bio-Rad
550型酶标仪 ,美国伯乐公司产品;F2500荧光光度计 ,日本日立
·787·
LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2010VOL.21NO.4 时珍国医国药 2010年第 21卷第 4期
高新科技公司产品。
2　方法
2.1　实验分组及药物干预 实验分生长对照组(空白生长对照
菌)和 EHE低 、中 、高浓度组(EHE的浓度由低向高依次为 64,
128, 256 μg· ml-1)。参照美国临床实验室标准化委员会(NC-
CLS)推荐的《产孢丝状真菌的液基稀释法抗真菌药物敏感性试
验方案》(M38-A)[ 10] ,将不同浓度的 EHE和红色毛癣菌(XYZ
T.r40001)在 26 ℃孵育 7 d, 收集菌丝样品用于酶活性测定。
2.2 　角鲨烯环氧化酶活性测定 收集培养液 , 1 000 g离心 10
min分离得到菌丝样品 , 用 PBS(pH7.0)缓冲溶液漂洗 3次 , 每
次 1 000 g离心 10min,弃上清。每组精密称取菌丝样品 0.3 g,
各 3份 , 分别加入 PBS(pH7.0)缓冲溶液 1 ml, 置于冰浴上超声
破碎细胞 , -20℃放置过夜 , 次日反复冻融 2次 , 5 000 g离心 5
min,取上清 , 严格按照 ELISA试剂盒说明书进行酶活性测定。
2.3　 β -(1, 3)-D-葡聚糖合成酶活性测定 收集培养液 , 准
备 5 ml待测的新鲜真菌细胞(OD600范围在 0.4 ～ 0.8之间 ,即 1
～ 2×107细胞 /ml), 移入到预冷的 5 ml离心管 , 置于冰槽里 5
min,放进 4℃离心机离心 10 min,速度为 3 000 g, 小心抽去上清
液 , 加入 250 μlGENMED裂解液 , 充分混匀 , 转移到预冷的 1.5
ml离心管 , 加入 100μlGENMED强化液 , 强力涡旋振荡 15 s,置
于冰槽里 1 min,重复 5次 ,加入 250μlGENMED, 充分混匀 ,放进
4℃离心机离心 10 min,速度为 1 000 g,小心移取 500 μl上清液
到新的预冷的 1.5 ml离心管 , 即刻放进 -70℃保存或置于冰槽
里继续后续操作。严格按照试剂盒说明书进行酶活性测定。
2.4　统计学分析 测定结果均以 x±s表示 , 采用 PEMS3.1数
据处理软件 , 组间比较采用 t检验。
3　结果
3.1 　对红色毛癣菌角鲨烯环氧化酶活性的影响 ELISA实验结
果表明 , 各实验浓度 EHE均可使红色毛癣菌(T.rubrum)角鲨烯
环氧化酶的活性降低。 EHE为 256 μg· ml-1时 , 对角鲨烯环氧
化酶活性的影响有显著性差异(P<0.01)。结果见表 1。
表 1　EHE对红色毛癣菌角鲨烯环氧化酶活性的影响( x±s)
组别 EHE浓度C/μg· ml-1
酶活性 C/U· ml-1
1 2 3
酶活性平均值
C/U· ml-1
生长对照 - 17.81 19.74 19.89 19.15 ±1.16
EHE低浓度 64 18.26 18.48 19.44 18.73 ±0.63
EHE中浓度 128 19.00 17.89 16.41 17.77±1.30
EHE高浓度 256 14.11 14.19 15.37 14.56±0.71**■#
　　EHE高浓度组与生长对照组比较 , **P<0.01;EHE高浓度组与低浓度组比
较 , ■P<0.05;高浓度组与中浓度组比较 , #P<0.05;n=3
3.2　 对红色毛癣菌 β -(1, 3)-D-葡聚糖合成酶活性的影响
实验结果表明 , 不同浓度的地锦草提取物 , 均可降低红色毛癣菌
β -(1, 3)-D-葡聚糖合成酶的活性(P<0.01)。结果见表 2。
表 2　EHE对红色毛癣菌 β -(1, 3)-D-葡聚糖合成酶活性的影响( x±s)
组别 EHE浓度C/μg· ml-1
酶活性 C/U· ml-1
1 2 3
酶活性平均值
C/U· ml-1
生长对照 - 73.88 69.77 67.99 70.55 ±3.02
EHE低浓度 64 51.82 54.16 48.46 51.48 ±2.87**
EHE中浓度 128 34.91 35.75 40.61 37.09±3.08**■■
EHE高浓度 256 30.98 33.97 26.03 30.33±4.01**■■+
　　EHE高 、中 、低浓度组与生长对照组比较 , **P<0.01;EHE高 、中浓度组与低
浓度组比较 , ■■P<0.01;EHE高浓度组与中浓度组比较 , +P>0.05;n=3
4　讨论
角鲨烯环氧化酶是真菌细胞膜麦角甾醇生物合成通路中的
一个重要酶 ,它能使角鲨烯转变成羊毛甾醇。目前 ,临床常用的
烯丙胺类及硫脲类药物 ,通过作用于角鲨烯环氧化酶 , 导致真菌
重要膜成分麦角甾醇生物合成受抑而缺陷 , 发挥抑菌作用;角鲨
烯的最终积聚 , 脂滴沉积于细胞壁及细胞浆内 , 导致膜破裂和细
胞死亡 , 发挥杀菌作用 [ 11] 。 ELISA实验表明 , 地锦草提取物 256
μg· ml-1时 , 可显著降低红色毛癣菌中角鲨烯环氧化酶的活性
(P<0.01), 因此 ,其抗真菌机制可能与抑制角鲨烯环氧化酶的
活性 , 影响麦角甾醇的生物合成有关。
真菌细胞壁的主要物质为碳水化合物 , 主要有甘露聚糖蛋
白 、几丁质和 β -葡聚糖(β -1, 3-glucansynthase)组成。 β -葡
聚糖是细胞壁的主要成分 ,占细胞干重的 48% ～ 60%,由 β -(1,
3)键(67%)和 β -(1, 6)键(14%)连接而成 ,它保证细胞渗透压
的稳定性 ,并且在细胞生长和分裂过程中起重要作用 [ 12] 。抑制
了 β -(1, 3)-葡聚糖合成酶 , 就可致细胞壁结构破坏 ,细胞破裂
死亡。荧光分光光度法研究得出结论 , 不同浓度的地锦草提取
物 , 均可降低红色毛癣菌 β -(1, 3)-D-葡聚糖合成酶的活性
(P<0.01)。地锦草提取物在 64 μg· ml-1时 , 就可显著降低红
色毛癣菌中 β -(1, 3)-D-葡聚糖合成酶的活性(P<0.01), 且
存在剂量依赖性。因此 ,地锦草提取物抗真菌机制 ,可能是通过
抑制 β -(1, 3)-D-葡聚糖合成酶 , 导致多聚葡聚糖的合成受
阻 , 细胞生长周期停滞 , 真菌细胞壁的完整性被破坏 ,真菌细胞内
渗透压不稳定 ,最终导致真菌细胞溶解死亡。
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