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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第3期
肌动蛋白（Actin）是真核生物中普遍存在的一
种结构蛋白，是构成细胞骨架中微丝的主要组成成
分，执行重要的生理功能，如细胞分裂、细胞分化、
细胞内囊泡运输、细胞壁生物合成、共生现象、胞
吞胞吐作用以及膜的循环利用等［1-5］。Actin 基因又
被称为管家基因，具有高度保守性，在植物各器官
组织中的表达基本恒定，因此常用来作为内参基因
来研究其他特定功能基因表达量的差异。很多研究
表明，高等植物肌动蛋白的氨基酸序列相当保守，
绝大多数生物之间的相似性从 70%-100% 不等［6］。
到目前为止，已在多种高等植物，如木薯［7］、向日
收稿日期 ：2012-12-10
基金项目 ：国家自然科学基金项目（31100224），江苏省自然科学基金项目（BK2011131）
作者简介 ：李春霞，女，硕士研究生，研究方向 ：植物生理与资源利用 ；E-mail ：liyanyan317@126.com
通讯作者 ：孙力军，博士，研究方向 ：植物资源利用 ；E-mail ：shengwudiqiu@126.com
能源植物续随子肌动蛋白 Actin 基因全长序列的克隆及
序列分析
李春霞1 姚正颖2 张卫明2 孙力军2
（1. 南京师范大学生命科学学院，南京 210023 ；2. 南京野生植物综合利用研究院，南京 210042）
摘 要 ： 利用同源克隆和 RACE 技术克隆得到能源植物续随子肌动蛋白 Actin 基因的 cDNA 全长序列，该基因 cDNA 全长
1 743 bp （命名为 ElActin，GenBank 登录号为 KC182753）。序列分析表明，ElActin 开放阅读框长 1 134 bp，编码 377 个氨基酸，5
非编码区 247 bp，3 非编码区 362 bp。ElActin 与其他植物 Actin 基因的核苷酸序列同源性达到 82% 以上，氨基酸序列的同源性达
97% 以上。
关键词 ： 续随子 Actin 基因 同源克隆 RACE 序列分析
Cloning and Sequence Analysis of Actin Gene from Energy Plant
Euphorbia lathyris
Li Chunxia1 Yao Zhengying2 Zhang Weiming2 Sun Lijun2
（1. College of Life Sciences，Nanjing Normal University，Nanjing 210023 ；2. Institute for the Comprehensive Utilization of Wild Plants，
Nanjing 210042）
Abstract: Actins exist widely in plants. In this study, homologous cloning and RACE technology were employed to obtain the Actin full-
length cDNA sequence of Euphorbia lathyris （named ElActin, GenBank accession No. KC182753）. Sequence analysis showed that ElActin
contained a 1 134 bp open reading frame （ORF） encoding a 377 amino acid residues, a 5-UTR of 247 bp and a 3-UTR of 362 bp. Compared
with other plants, the homology of nucleotide sequence and amino acid sequence is above 82% and 97%, respectively.
Key words: Euphorbia lathyris Actin gene Homologous cloning RACE Sequence analysis
葵［8］、八棱海棠［9］和盐生植物碱蓬［10］等中克隆了
Actin 基因。
续随子（Euphorbia lathyris L.）属于大戟科大戟
属 2 年生草本植物，原产欧洲，现在我国南北各省
区均有栽培或野生分布［11，12］。续随子的种子油中
含有 30%-40% 类似于原油的碳氢化合物，是一种
很有开发前景的新型能源油料作物，且其脂肪酸组
成与理想柴油替代品的分子组成相似，是我国生物
柴油发展的理想原料［13-15］。但有关续随子 Actin 基
因的研究尚未见报道。本研究以能源植物续随子为
材料，利用同源克隆和 RACE 技术克隆续随子 Actin
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第3期150
基因的 cDNA 全长，以期为研究续随子的脂肪酸代
谢基因及抗性基因等功能基因的表达和调控奠定
基础。
1 材料与方法
1.1 材料
选取续随子成熟种子（种子来自本实验室），用
1 000 倍的多抗霉素加吐温 80 浸泡 4 h，自来水冲洗
5-6 次，种在培养液浸透的蛭石中，温室培养 20 d，
培养条件为 28℃，12 h 光照 /12 h 黑暗交替。采集
续随子幼苗，液氮速冻，-80 ℃储存备用。
1.2 方法
1.2.1 总 RNA 的 提 取 利 用 Beyozol 试 剂 盒（ 碧
云天生物技术研究所）提取续随子幼苗叶片的总
RNA，-80℃储存备用。利用核酸蛋白检测仪和甲醛
变性胶电泳检测总 RNA 质量。
1.2.2 反转录合成 cDNA cDNA 的合成按照 Primer
逆转录酶的说明操作进行。中间片段和 3-RACE 中
cDNA 合成的引物使用 3-CDS ：5-AAGCAGTGGTA-
T C A A C G C A G A G T A C T（3 0 ）V N - 3 （ V = A / G / C ，
N=A/G/C/T）；5-RACE 中 cDNA 合 成 的 引 物 使 用
Actin5GSP4 ：5-GAGCCTCAGTGAGCAGCACCGGA-
TG-3，将所得 cDNA 纯化，并利用加尾酶（TdT，
TaKaRa 公司）加 C 尾。
1.2.3 续随子 Actin 基因中间片段的获得 通过比对
已发表的大戟科植物及其他植物 Actin 基因核苷酸序
列，根据序列的同源性设计一对引物，用 P1、P2 表
示，用该引物扩增 Actin 中间片段。P1：5-AGCAACTG-
GGATGATGGA-3，P2 ：5-GCAATAACCAGGGAAC-
ATAGT-3。扩增程序 ：94℃ 3 min ；94℃ 50 s，55℃
50 s，72℃ 1 min，30 个循环 ；72℃ 10 min。用 1.5%
琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。得到的条带与预期
大小相符后，用生工生物工程公司的 SanPrep 柱式
胶回收试剂盒进行回收并纯化产物，按照 pMD19-T
载体体系连接片段，利用大肠杆菌 DH5α 转化，经
菌落 PCR 验证后，转至 LB 液体培养基中振荡培养，
菌液送美吉生物公司测序。
1.2.4 续随子 Actin 基因 5-RACE 和 3-RACE 的获
得 根据已获得的续随子 Actin 基因中间片段，设
计 5-RACE 扩增引物 ：5-ACCGGATGCTCCTCAGG-
TGCAACAC-3 和 5-AAGCAGTGGTATCAACGCAGA-
GTACGGGGGGGGGGGGHN-3 ；设 计 3-RACE 扩 增
引物 ：5-CACCATTGGGGCTGAGAGATTCCGA-3 和
5-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTA-
TCAACGCAGAGT-3。5-RACE 和 3-RACE 采用降落
PCR，反应条件均为 ：94℃ 30 s，72℃ 2 min，5 个
循环 ；94℃ 30 s，70℃ 30 s，72℃ 2 min，5 个循环 ；
94℃ 30 s，68℃ 30 s，72℃ 2 min，25 个循环。用 1.5%
琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，扩增产物经回收、
连接、转化及测序得到目的片段。
1.2.5 Actin 基因 CDS 全长的获得 将测序正确的
5 端、3 端及中间片段序列拼接获得全长，并通过
AlignX 软件获得其开放式阅读框，根据 ORF 设计一
对特异性引物 T1、T2，PCR 获得续随子 Actin 基因
CDS 全 长。 引 物 T1 ：5-ATGGCTGATGCTGAGGAT-
ATTCAG-3，引物 T2 ：5-TTAGAAGCACTTCCTGTG-
GACAATA-3。
1.2.6 续随子 Actin 基因序列分析 利用 Vector NT1
Advance11 软件分析续随子 Actin 基因开放读框，推
导 氨 基 酸 序 列， 利 用 NCBI 在 线 的 BLAST 程 序 对
测定序列进行核苷酸和氨基酸的同源性比对。利用
MAGA4.1 软件对测定序列进行进化树分析。
2 结果
2.1 RNA样品的质量检测
甲醛变性胶电泳（图 1）显示，续随子叶片总
RNA 电 泳 图 谱 带 型 清 晰，28S rRNA、 18S rRNA 条
带清晰，无拖尾现象。说明该试验提取的 RNA 完
整性较好。利用核酸蛋白检测仪测定 RNA 的纯度，
A260/A280 均在 1.9 左右，表明续随子叶片总 RNA 提
取质量高，可用于后续的分子生物学分析。
28S
18S
图 1 续随子叶片总 RNA 甲醛变性胶电泳
2.2 续随子Actin基因cDNA全长序列的获得
通过同源克隆获得 Actin 基因 cDNA 中间片段，
2013年第3期 151李春霞等 ：能源植物续随子肌动蛋白 Actin 基因全长序列的克隆及序列分析
测序后，再根据该片段设计用于 3RACE 和 5RACE
的 特 异 引 物， 扩 增 得 到 Actin 基 因 cDNA 全 长 序
列。Actin 基因 cDNA 中间片段、5 片段、3 片段以
及 CDS 片段大小分别为 700 bp 左右、400 bp 左右、
750 bp 左右和 1 200 bp 左右，与引物设计的预期片
段大小一致（图 2）。用 Vector NT1 Advance11 软件
对该 cDNA 序列进行分析，发现其 5- 端有 173 bp
的非编码区（5-UTR），3- 端有 335 bp 的非编码区
（3-UTR），片段末端含有 poly（A） 序列，开放阅读
框长 1 134 bp，编码 377 个氨基酸。将该基因 cDNA
命名为 ElActin，GenBank 登录号为 KC182753。
在少数位置有差异（图 4） 。
利用 MAGA4.1 软件，应用相邻连接法（neighbor
joining，NJ）绘制进化树，结果（图 5）显示，续随
子的 ElActin 推定的氨基酸序列与白桦、蓖麻、橡胶
树的 Actin 蛋白聚为一类，三者之间的亲缘关系最近。
与传统分类学将续随子与蓖麻子、橡胶树归为大戟
科的结论相符。通过上述生物信息学分析结果，可
以初步确定本试验获得的全长基因为续随子的肌动
蛋白基因。此外，续随子与其他植物同源性达 97%
以上，可以充分说明 Actin 基因具有高度的保守性，
在物种进化过程中可能执行着相近的功能。同时也
证明本试验所克隆的基因为续随子 Actin 基因，且
具有高度保守性，可能成为研究续随子其他功能基
因的内参。
3 讨论
本研究通过比对已发表植物的 Actin 基因，利
用同源克隆技术和 RACE 技术克隆得到续随子 Actin
基因的全长。在扩增 5 和 3 端序列时，采用改良的
RACE 技术。在合成 cDNA 第一条链时，在 oligod（T）
引物的 3 端引入两个简并的核苷酸 V、N（V=A/G/C，
N=A/G/C/T），使引物锚定在 Poly（A）尾的起始点，
减小 oligod（T）与 Poly（A）尾的其他部位结合的机率，
从而增大了扩增效率。另外，在 5 端加尾时，利用
Poly（C）引物代替常用的 Poly（A），同时采用降落
PCR，提高了退火温度，进一步增大了特异性条带
的扩增效率。此外，在基因扩增过程中没有使用试
剂盒，节省了试验资金，为其他真核生物的基因克
隆提供了参考。
试验克隆所得的续随子 ElActin 基因 CDS 全长
与其他植物 Actin 基因的 CDS 长度相同，均为 1 143
bp，其编码的氨基酸序列与其他植物的同源性达
97% 以上，其中，与橡胶、蓖麻的氨基酸序列同源
性达到 100%，进一步证明高等植物 Actin 基因具有
高度保守性。值得一提的是续随子 ElActin 推定的氨
基酸序列与白桦、蓖麻、橡胶树的 Actin 蛋白的亲缘
关系较近，这与传统分类学将续随子与蓖麻子、橡
胶树归为大戟科的结论相符，但与续随子与白桦并
非同一科植物的事实不符，这可能与进化树算法有
一定关系。
2000
M 1 2 3 4
bp
1000
750
500
M ：DNA Marker ；1 ：中间片段 ；2 ：5 片段 ；3 ：3 片段 ；4 ：CDS 片段
图 2 续随子 Actin 基因 cDNA 序列电泳图
完 整 的 Actin 基 因 cDNA 序 列 和 编 码 蛋 白 序
列，如图 3 所示。该蛋白氨基酸序列具有肌动蛋白
的 特 征 信 号 序 列 YVGDEAQs.KRG 和 WISKgEYDE
以 及 肌 动 蛋 白 和 肌 动 蛋 白 类 似 蛋 白 的 特 征 序 列
LLTEApLNPkaNR（图 3）。
2.3 序列同源性及系统进化分析
将得到的续随子 ElActin 核苷酸序列在 NCBI 网
站上进行在线 Blast 分析，分析结果（图 4）表明，
该基因与白桦、蓖麻、锦葵、拟南芥、陆地棉、荔枝、
麻风树、芒果、杨树及橡胶树等植物的肌动蛋白基
因高度同源。如与陆地棉和白桦的相似性达到 89%，
与同科植物蓖麻和橡胶树的相似性达到 91%，与模
式植物拟南芥的相似性达到 87%。
将续随子 ElActin 推导的蛋白氨基酸序列与其他
在 NCBI 上筛选出的相似性较高的 11 种植物的 Actin
蛋白进行了多序列比较分析，结果显示，不同植物
的 Actin 蛋白氨基酸序列相似性程度非常高，氨基
酸的序列相似性在 97% 以上，最高达到 100%，仅
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第3期152
续随子是国内外广泛研究的 40 多种能源植物中
少见的分布地域广的植物，是一种具有开发潜力的
经济植物。然而，GenBank 数据库中仅收录了几个
续随子的基因序列，这在一定程度上影响了其分子
生物学方面研究的开展。本研究克隆了续随子 Actin
基因的全长，丰富了 Actin 基因资料库，从而为续
随子内参基因的选择奠定了基础，也为克隆与研究
续随子其他基因提供了方法参考。
4 结论
本研究克隆得到能源植物续随子肌动蛋白 Actin
1
124
185
249
313
378
442
507
572
636
701
766
832
895
960
1024
1088
1154
1219
1282
1347
1410
1471
1530
1590
1650
1711
61
图 3 续随子 ElActin 核苷酸序列、推测的氨基酸序列及特征序列（下划线所示）
2013年第3期 153李春霞等 ：能源植物续随子肌动蛋白 Actin 基因全长序列的克隆及序列分析
BpACT 1
Section 1 1
RcACT 1
MpACT 1
AtACT 1
GhACT 1
LcACT 1
JcACT 1
MiACT 1
PtACT 1
HbACT 1
ElACT 1
Consensus 1
1 10 20 30 40 50 60 70 89
BpACT 90
Section 2 90
RcACT 90
MpACT 90
AtACT 90
GhACT 90
LcACT 90
JcACT 90
MiACT 90
PtACT 90
HbACT 90
ElACT 90
Consensus 90
90 100 110 120 130 140 150 160 178
BpACT 179
Section 3 179
RcACT 179
MpACT 179
AtACT 179
GhACT 179
LcACT 179
JcACT 179
MiACT 179
PtACT 179
HbACT 179
ElACT 179
Consensus 179
179 190 200 210 220 230 240 250 267
BpACT 268
Section 4 268
RcACT 268
MpACT 268
AtACT 268
GhACT 268
LcACT 268
JcACT 268
MiACT 268
PtACT 268
HbACT 268
ElACT 268
Consensus 268
268 280 290 300 310 320 330 340 356
BpACT 357
Section 5 357
RcACT 357
MpACT 357
AtACT 357
GhACT 357
LcACT 357
JcACT 357
MiACT 357
PtACT 357
HbACT 357
ElACT 357
Consensus 357
357 377
Actin 基因来源和 GenBank 登录号 ：BpACT（白桦，EU588981）；RcACT（蓖麻，XM002522148）；MpACT（锦葵，AF112538）；AtACT（拟南芥，
NM121018）；GhACT（陆地棉，AY305732）；LcACT（荔枝，HQ588865）；JcACT（麻风树，HM044307）；MiACT（芒果，HQ585999）；PtACT（杨
树，XM002331844）；HbACT1（橡胶树，JF775488）；ElACT（unassigned）
图 4 续随子 Actin 基因氨基酸序列与其他植物 Actin 基因氨基酸同源性分析
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第3期154
基因的 cDNA 全长序列 ElActin，其开放阅读框长
1 134 bp，编码 377 个氨基酸 ；ElActin 与其他植物
Actin 基因的核苷酸序列同源性达到 82% 以上，氨
基酸序列的同源性达 97% 以上。
参 考 文 献
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（责任编辑 狄艳红）
46
0.001
71
68
46
63
䱶ൠỹGossypium hirsutum AY305732
ₑ㜦ṁHevea brasiliensis JF775488
㬆哫Ricinus communis XM002522148
ⲭẖBetula platyphylla EU588981
㔝䲿ᆀEuphorbia lathyris unassigned
哫仾ṁJatropha curcas HM044307
㦄᷍Litchi chinensis HQ588865
ᶘṁPopulus trichocarpa XM002331844
㣂᷌Mangifera indica HQ585999
䭖㪥Malva pusilla AF112538
ᤏই㣕Arabidopsis thaliana NM121018
图 5 续随子 Actin 蛋白与其他植物 Actin 蛋白氨基酸序列进化树分析