全 文 ：文章编号:1001 － 4829(2014)03 － 1091 － 05
收稿日期:2013 － 07 － 10
基金项目:国家自然科学基金(31260424) ;公益性行业(农业)
科研 专 项 (201103018);“十 二 五 科 技 支 撑 项 目 ”
(2012BAD19B06-07)
作者简介:练冬梅(1987 －) ，女，福建永安人，在读硕士生，研究
方向为植物病原 线 虫，E-mail:woshildm1987 @ 163． com，
18876178352，* 为通讯作者。
象耳豆根结线虫 actin基因的克隆与分析
练冬梅1，2，赵志祥2，陈绵才2* ，王会芳2
(1．海南大学环境与植物保护学院，海南 海口 571101;2．海南省农科院农业环境与植物保护研究所，海南 海口 571100)
摘 要:采用 ＲT-PCＲ、cDNA 末端快速扩增法(ＲACE) ，克隆了象耳豆根结线虫生长发育关键基因 actin 的全长 cDNA 序列(登录
号:KF534787) ，并与 NCBI 核酸数据库进行序列比对，结果表明:序列全长 1298 bp，包含一个全长 1125 bp的开放阅读框 OＲF，编
码 375 个氨基酸，起始密码子在 82 位，终止密码子在 1207 位，与已知的其它物种的 actin具有高度的保守性，与马铃薯腐败线虫和
松才线虫 actin的同源性分别为 99． 20 %和 98． 67 %，与秀丽隐杆线虫、人类相似性分别达到 98． 67 %和 97． 33 %。系统发育分析
表明，象耳豆根结线虫 actin可能是 β-actin，同时也发现了象耳豆根结线虫 actin与人类的胞质 actin(β-actin)更相似。本研究填补
了 GenBank数据库中象耳豆根结线虫内标参照基因的空白。
关键词:象耳豆根结线虫;Actin基因;全长 cDNA
中图分类号:S476 + ． 15 文献标识码:A
Cloning and Analysis of actin Gene in Meloidogyne enterolobii
LIAN Dong-mei1，2，ZHAO Zhi-xiang2，CHEN Mian-cai2* ，WANG Hui-fang2
(1． Environment and Plant Protection College，Hainan University，Hainan Haikou 571101，China;2． Institute of Environment ＆ Plant Pro-
tection，Hainan Academy of Agricultural Sciences，Hainan Haikou 571100，China)
Abstract:The full length cDNA of actin gene (accession number:KF534787)，which is crucial to the growth and development of Meloido-
gyne enterolobii，was cloned by using ＲT-PCＲ，rapid amplification of cDNA ends (ＲACE)and compared with NCBI． The result showed
that the sequence had 1298 bp，including one complete OＲF with 1125 bp，start codon at 82 site and stop codon at 1207 site，encoding 375
amino acids，which was highly conservative with known actin of other species． Meloidogyne enterolobii actin protein sequence presented 99．
20 % and 98． 67 % identity to Ditylenchus destructorto and Bursaphelenchus xylophilus，98． 67 % and 97． 33 % identity to Caenorhabditis el-
egans and Homo sapiens，respectively． Meloidogyne enterolobii actin gene might be β-actin by the construction of the evolutionary tree． It also
indicated that this actin was more similar to the human cytoplasmic actin(β-actin)than to human muscle actin(α-actin)． The results of this
study would provide basis for actin used as a reference gene of Meloidogyne enterolobii for further study．
Key words:Meloidogyne enterolobii;Actin gene;Full length cDNA
象耳豆根结线虫(Meloidogyne enterolobii)最早
于 1983 年由杨宝君等在海南儋州的象耳豆树上发
现并鉴定和命名［1］，后经徐建华等证明国外学者广
泛报道的玛雅根结线虫(M． mayaguensis)为 M． en-
terolobii 的异名［2］。近年来，M． enterolobii 的迅速传
播也引起了学者的广泛关注。2008 年，欧洲首次报
道 M． enterolobii，同年，欧洲植物保护组织(EPPO)报
道中国出口欧洲的玫瑰花上截获到该线虫，EPPO
对该线虫进行风险评估，认为对中欧地区作物存在
较大威胁［3］。在国内，M． enterolobii 近年来也陆续
被报道，目前在海南岛已普遍分布，广东省也有发
现［4］。随着我国现代农业和设施农业的发展，温室
和设施大棚不断增加而导致土壤温度的上升，使得
M． enterolobii 入侵内陆地区成为可能，这将给全国
的农作物生产带来威胁。近年来对 M． enterolobii 的
研究备受关注，但对于其功能基因及功能基因组等
分子生物学研究报道很少。
在真核细胞中，肌动蛋白(actin)是一种重要的
收缩蛋白。actin是引起肌肉收缩的主要成分之一，
在非肌肉组织中，actin是细胞骨架的重要组成部
1901
2014 年 27 卷 3 期
Vol. 27 No. 3
西 南 农 业 学 报
Southwest China Journal of Agricultural Sciences
表 1 引物序列
Table 1 Primer sequences
引物类别
Primers category
引物名称
Primers name
引物序列
Primer sequences
基因片段引物 ActinF 5’-GAGAAGATCTGGCACCACAC-3’
ActinＲ 5’-TTCTCCTTGATGTCACGGAC-3’
5’ＲACE基因特异引物 5GSP 5’-GCGTGTGGCAAAGCATAACCTTCATAG-3’
5NGSP 5’-CTTGGATGGCAACATACATGGCAGGC-3’
3’ＲACE基因特异引物 3GSP 5’-GAAGCACCTCTCAACCCAAAGGCTAACCG-3’
GeneＲacerTM试剂盒提供引物 GeneＲacerTM5’primer 5’-CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3’
GeneＲaceTM 5’nested primer 5’-GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA-3’
GeneＲacerTM3’primer 5’-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3’
分，参与许多过程，如细胞运动，内吞作用，胞外分
泌，吞噬作用，细胞器运动，蛋白运输和信号转
导［5 ～ 8］。actin是高度保守的蛋白质，包括哺乳动物
和线虫。它被广泛用作分子标尺，预测物种之间的
进化距离，评估种群变化［9 ～ 10］。在脊椎动物中，ac-
tin蛋白有 3 类亚型:α、β和 γ。其中 α-actin蛋白存
在于肌肉组织中，β-actin和 γ-actin蛋白是存在于胞
质中。近来已经从众多的物种中克隆到 actin，例
如，人类［11］、鼠［12］、果蝇(Drosophila)［13］、松材线虫
(Bursaphelenchus xylophilus)［14］。众所周知，要深入
研究 M． enterolobii 其它功能基因，内标参照是必不
可少的。采用 ＲACE-PCＲ 技术成功克隆了象耳豆
根结线虫肌动蛋白基因 actin 的全长 cDNA序列，为
进一步开展研究其功能基因的表达和调控奠定基
础。
1 材料与方法
1． 1 虫源
M． enterolobii原始种群来源于海南省农业科学
院植保所线虫圃，在室内用改进的贝尔曼漏斗法分
离得到。
1． 2 引物
参考戴素明［15］actin 引物 actin F 和 actin Ｒ，扩
增 M． enterolobii actin基因片段。根据已分离得到的
目的片段分别设计 5’和 3’ＲACE 特异性引物
5GSP、5NGSP和 3GSP，引物由上海生工合成，序列
见表 1。
1． 3 M． enterolobii总 ＲNA的提取
收集 M． enterolobii(约 50 μl) ，加入 100 μl 的
Trizol，用匀浆器迅速充分研磨，加入 900 Trizol 补足
至 1 mL，充分吹打混匀后静置 5 min。然后加入 200
μl的氯仿，剧烈震荡 15 s后静置 2 ～ 3 min。12 000
r /min离心 15 min，小心吸取上清并加入等体积异
丙醇，静置 10 min后 12 000 r /min 离心 10 min。小
心吸弃上清，沉淀用 75 %乙醇洗涤 1 次，稍晾干后
将沉淀溶于 30 μl ＲNase free 水。以紫外分光光度
计和琼脂糖凝胶电泳检测 ＲNA浓度和纯度。
1． 4 M． enterolobii actin基因核心序列的克隆
以 M． enterolobii 总 ＲNA 为模板，用反转录酶
(TaKaＲa Prime ScriptTM II 1st Strand cDNA Synthesis
Kit)进行反转录，合成 cDNA 第一链。再以 cDNA
第一链为模板，进行 PCＲ扩增。扩增体系为:1． 0 μl
cDNA，10 × PCＲ 缓冲液 2． 0 μl，1． 0 μl dNTP (10
mmol /L)，0． 2 μl Taq DNA聚合酶(5 U) ，1． 0 μl ac-
tinF(10 mol /L) ，1． 0 μl actinＲ (10 mol /L) ，用
ddH2O补足至 20 μl。反应程序为:94 ℃预变性 4
min，94 ℃变性 30 min，55 ℃退火 30 s，72 延伸 45 s，
共 30 个循环，最后 72 ℃延伸 10 min。反应完毕后
取 5 μl于 1． 2 %琼脂糖凝胶进行电泳分析。割胶
回收 PCＲ 产物，用 pEASY-T1 载体连接，经 Amp 抗
性筛选和阳性克隆鉴定后送上海生工测序。
1． 5 M． enterolobii actin 基因 cDNA 全长序列的获
得
以 M． enterolobii 总 ＲNA 为模板，利用 ＲLM-
ＲACE GeneＲacerTM Kit(Invitrogen)合成带 3’接头
和 5’接头的 cDNA第一链。
以带 3’接头的 cDNA 第一链为模板，3GSP 和
GeneＲacerTM3’Primer为引物，进行 3’端的 cDNA扩
增;以带 5’接头 cDNA第一链为模板，5GSP 和 Gen-
eＲacerTM5’Primer 进行 5’端的 cDNA 扩增，将扩增
产物稀释 100 倍以后，以 5NGSP 和 GeneＲaceTM 5’
Nested Primer进行巢式 PCＲ 扩增。然后电泳检测，
纯化 3’和 5’ＲACE PCＲ 产物后再进行连接、转化和
测序。测序结果与核心序列进行拼接，得到 actin 基
因的全长 cDNA序列。
1． 6 序列分析和系统树构建
使用 DNAman、BioXM、Clustalw等生物软件进
2901 西 南 农 业 学 报 27 卷
28 S
18 S
5 S
M
图 1 总 ＲNA琼脂糖凝胶电泳
Fig． 1 The electrophoresis of ＲNA
行序列分析，Blast 搜索在 NCBI(www． Ncbi． nlm．
nih． gov /BLAST)网站上进行，开放阅读框(OＲF)与
氨基酸序列的预测采用 BioXM 软件，并与 GenBank
中其他物种的相关序列进行比对分析，利用 MEGA4
软件，NJ法建立氨基酸的系统进化树。
2 结果与分析
2． 1 总 ＲNA的提取及 actin基因核心序列的克隆
琼脂糖凝胶电泳检测总 ＲNA的完整性(图 1) ，
以紫外分光光度计测总 ＲNA 纯度，A260 /A280是 1．
92，表明所提取的 ＲNA完整性以及纯度均可满足后
续实验的要求。以此为模板，actin F和 actin Ｒ为引
物进行 ＲT-PCＲ 反应，扩增得到 400 bp 左右的 cD-
NA片段(图 2)，将该片段回收，与 pEASY-T1 载体
相连，菌落 PCＲ 检测后测序。测序后，得到 398 bp
序列。
2． 2 M． enterolobii actin基因 3’和 5’端序列的克隆
以带 3’接头的 cDNA 第一链为模板，3GSP 和
GeneＲacerTM3’Primer 为引物，扩增得到约 1000 bp
产物(图 3a) ，经回收、克隆、测序后，得到 905 bp 序
列。同时，以带 5’接头 cDNA 第一链为模板，5GSP
和 GeneＲacerTM5’Primer进行 5’端的 cDNA扩增，将
M
398 bp
图 2 M． enterolobiiatcin基因 ＲT-PCＲ基因
Fig． 2 The results of ＲT-PCＲ for M． enterolobiiatcin
扩增产物稀释 100 倍以后，以 5NGSP和 GeneＲaceTM
5’Nested Primer进行巢式 PCＲ扩增，得到约 500 bp
(图 3b) ，经回收、克隆、测序后，得到 499 bp序列。
2． 3 全长 cDNA 序列的特征分析
将得到的 3’和 5’端的序列与核心序列进行拼
接，得到 actin基因的全长 cDNA序列，并在 NCBI中
登录，获得核酸序列登录号:KF534787。序列分析
表明:该序列共 1298 个碱基，包含一个全长 1125 bp
的开放阅读框 OＲF，起始密码子在 82 位，终止密码
子在 1207 位，共编码 375 个氨基酸，蛋白质分子量
为 48． 43KDa，理论等电点为 4． 826，具有 2 个核输
出信号位点(NES1，170 ～ 181;NES2，212 ～ 222)，为
亮氨酸(Leueine)丰富区域，对蛋白质在细胞核和细
胞质间的运输具有重要作用［16］。与 GenBank 中注
册的 actin 基因序列的相似性均在 80 %以上，与其
他肌动蛋白的氨基酸序列的相似性达 90 %以上，符
合 actin基因氨基酸编码区高度保守的特点，也说明
真核生物的肌动蛋白基因是高度保守的。
2． 4 M． enterolobii actin 蛋白质的序列比对及系统
进化分析
经 Blastx分析，发现根据该 cDNA 推导的蛋白
序列与马铃薯腐烂茎线虫、松才线虫、秀丽隐杆线虫
905 bp
499 bp
M M 1 2
a b
M:DL2000;1:第一次扩增产物;2:巢式 PCＲ扩增
M:DL2000 marker;Lane1:First ＲCＲ product ofactin 5’ＲCE;Lane2:Second ＲCＲ product of actin 5’ＲCE
图 3 M． enterolobii actin基因 3’(a)或 actin基因 5’(b)ＲCE结果
Fig． 3 The results of 3’ＲACE-PCＲ (a)or 5’ＲACE-PCＲ(b)
39013 期 练冬梅等:象耳豆根结线虫 actin基因的克隆与分析
和人类的 actin蛋白序列存在很高的相似性，相似度
在 97 %以上(图 4)。利用 DNAMAN 软件分析，象
耳豆根结线虫 actin 蛋白质的序列与马铃薯腐败线
虫(Ditylenchus destructorto)和 B． xylophilus 相似性分
别为为 99． 20 %和 98． 67 %，与秀丽隐杆线虫(Cae-
norhabditis elegans)、人类(Homo sapiens)相似性分别
达到 98． 67 %和 97． 33 %。
将本研究所获得的 M． enterolobii actin蛋白的氨
基酸全长序列与 Gen Bank 中注册的 B． xylophilus、
腐生线虫(Panagrellus redivivus)、C． elegans、马来丝
虫(Brugia malayi)等 6 个物种的 β-actin，以及 H． sa-
piens、斑马鱼(Danio rerio)等 5 个物种的 α-actin，采
用 MEGA4，以邻位相连法(Neighbor-Joining，NJ)构
建进化树，多序列比对等参数的设置采用默认设置
值。β-actin和 α-actin蛋白各成一支，本试验中得到
的 M． enterolobii 的 actin cDNA推导的氨基酸序列聚
类于 β-actin类群，可推测本试验中所得 actin 可能
是属于 β-actin(图 5)。
3 讨 论
本研究利用 ＲACE 末端序列延伸方法，成功克
隆到了 M． enterolobii actin 基因的全长 cDNA 序列。
对于高度保守的基因 actin来说，利用此方法比传统
的筛选 cDNA 文库的方法更加快捷。M． enterolobii
actin的成功克隆将为其提供有用的内标和功能研
究奠定了物质基础。
由进化树分析可知，所克隆到的象耳豆根结线
虫 actin 基因可能是 β-actin，而且与 H． sapiens 肌肉
组织 actin(α-actin)和 H． sapiens 胞质 actin(β-actin)
相比，其与后者更为相似。
在不同的细胞中，肌动蛋白是一种具有高而稳
定表达水平的管家基因，已有学者研究其上游部分
* indicates the residue is identical to that in the M． enterolobii sequence
图 4 M． enterolobii 、D． destructorto、B． xylophilus、C． elegans、H． sapiens actin基因蛋白同源性比较
Fig． 4 Alignment of the amino acid sequences of M． enterolobiiwith those of D． destructorto，B． xylophilus，C． elegans and H． sapiens
4901 西 南 农 业 学 报 27 卷
分支上的数字代表置信值，系统进化树右边为各物种名称
图 5 β-actin和 α-actin蛋白的系统进化树
Fig． 5 Phylogenetic tree of β-actin and α-actin
的启动子和增强子，并用于转基因研究［17］。目前研
究线虫 actin最多的是 C． elegans，C． elegans 的 actin
在调节体壁肌肉收缩［18］及早期胚胎发育中均发挥
了重要的作用［19］。关于 actin蛋白对于象耳豆根结
线虫的生长发育以及其他功能的研究还有待深人。
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( 责任编辑 陈 虹)
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