全 文 ：微孔草 Actin基因核心片段的
克隆及序列分析
吴淑娟 ,张一弓 ,张丽静 ,傅 华
(农业部草地农业生态系统学重点开放实验室 兰州大学草地农业科技学院 ,甘肃 兰州 730020)
摘要:提取微孔草 Microula sikkimensis 叶片的总 RNA , 并以其为模板 , 运用 RT-PCR 方法扩增出 Actin 基
因的核心序列。通过连接 、转化后对阳性克隆进行 PCR鉴定并测序 , 序列分析结果表明:微孔草 Actin 基因
核心片段长 599 bp , 编码 199 个氨基酸。将该序列与 GenBank 中已注册的植物 Actin 基因序列进行同源性
比较 ,发现它们之间的同源性在 84%以上 , 氨基酸序列同源性在 95%以上 , 具有高度的保守性。
关键词:微孔草;Actin基因;序列分析
中图分类号:S565.9　　　文献标识码:A　　　文章编号:1001-0629(2010)04-0097-05
＊ 　肌动蛋白(actin)是真核生物细胞中普遍存在
的一种重要的蛋白质 ,构成细胞骨架中的微丝系
统 ,参与真核生物细胞的许多重要的生命活动。
肌动蛋白是单一多肽链的球状蛋白质(G-actin),
由 375 ～ 377个氨基酸残基所组成 ,分子量为 42
kD 。生物体中包含 7个肌动蛋白基因 ,编码不同
的肌动蛋白同工蛋白质[ 1] 。肌动蛋白在高等植物
形态发生的细胞分裂和伸长过程中起着关键的调
节作用[ 2] ,参与植物体的重要生理过程 ,包括细胞
结构变化 、染色体结构调整 、基因转录控制 、mR-
NA 加工和运输等[ 3] 。另外 ,高等植物的肌动蛋
白在进化过程中保持高度的保守性和同源性 ,且
具有组织和器官特异性的表达[ 1] 。由于 Actin 基
因在各种组织中恒定表达 ,因而常被作为一种重
要的看家基因用以比较不同来源的目的基因表达
量的差异[ 4] 。这些基因高度相似 ,通过多轮复制
由一个基因祖先进化而来[ 5] 。肌动蛋白最初是
1941年在脊椎动物骨骼细胞中发现并命名的[ 1] 。
目前 ,已经在许多高等植物中克隆到该基因。
微孔草Microula sikk imensis ,属紫草科微孔
草属二年生草本植物 ,是我国特有的耐高寒的优
质高效野生油料植物[ 6] 。现知全世界共有微孔草
属植物 29个种 ,其中 25个种为我国特有种[ 7] ,主
要分布于我国陕西西南部 、甘肃 、青海 、四川西部 、
西藏东部和南部[ 8] ,且大多数分布在海拔 2 700 ～
4 500 m 高山草地 、砾石坡地 、山地林边及灌丛天
然植被中[ 7] ,其具有耐寒 、耐旱 、光合作用强等特
点[ 9] 。微孔草草籽中含有 18 种氨基酸[ 10] ,种子
中的不饱和脂肪酸含量占总量的 86.46%,亚油
酸的含量 35.10%,γ-亚麻酸含量高达6.37%[ 11] ,
表明其蕴含着丰富的基因资源 ,并已初步受到关
注。因此 ,克隆这种特有植物的看家基因 Actin
作为内标参照 ,将为微孔草优质基因资源的筛选
和利用以及其特殊生理性状的研究提供依据和奠
定基础。
1　材料与方法
1.1 试验材料　微孔草块根采自甘南天祝 ,在
人工气候箱中培养 ,长出植株后取其新鲜叶片作
为试验材料。大肠杆菌 DH5α感受态细胞购自天
根生化科技有限公司(北京)。pGEM-T 载体 、T4
连接酶购自 BIO BASIC INC.。UNIQ-10 柱式
T rizol总 RNA 抽提试剂盒购自上海生工生物工
程 技 术 服 务 有 限 公 司。 PrimeScriptTM1st
St rand cDNA Synthesis Kit 、 Taq 酶均 购自
TaKaRa 。DNA快速纯化/回收试剂盒购自北京
鼎国生物技术有限公司。
27 卷 04 期
Vol.27.No.04 草　业　科　学PRATACULTURAL SCIENCE 97-10104/2010
＊收稿日期:2009-11-05基金项目:国家重点研究发展计划“973”(2007CB108903);国家自然科学基金(30800801);第二届草业科学研究生论坛;国家科技支撑计划(2008BADB3B08)作者简介:吴淑娟(1985-),女 ,甘肃兰州人 ,在读硕士生。 E
mail:cconnie07@126.com通信作者:傅华　E m ail:fuh ua@l zu.edu.cn
1.2 试验方法
1.2.1总 RNA的提取　以微孔草新鲜叶片为材
料提取总 RNA ,提取方法参照试剂盒说明书 。用
1%琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 质量并测定
OD 260/ 280值。
1.2.2 RT-PCR 扩增　cDNA 第一链的合成参照
试剂盒说明书。
根据 GenBank 中已知肌动蛋白的基因序列 ,
采用 DNAman软件设计引物 。
A1:5 -G TGG TCG TACAAC(A/T)GG-
TA TTGTG-3
A2:5 -GA(A/C/T)CCTCCAATCCAGA-
CACTG-3 。
PCR反应体系:TaKaRa Taq(5 U/μL)0.25
μL , 10 ×PCR Buf fe r(Mg 2+ Plus)5 μL , dNTP
Mix ture 4 μL ,模板 DNA 2.5 ng ,引物(1)1 μL ,
引物(2)1 μL ,灭菌蒸馏水 up to 50 μL 。
PCR反应条件:94 ℃预变性 5 min , 94 ℃变
性 30 s ,56 ℃退火 45 s , 72 ℃延伸 50 s , 30个循
环 ,最后72 ℃延伸10 min 。PCR扩增产物用 1%
琼脂糖凝胶检测 。
1.2.3 目的片段的回收 、纯化　目的片断的回收
和纯化参照试剂盒说明书 。
1.2.4阳性克隆的筛选与鉴定　回收的 PCR 产
物连接到 pGEM -T 载体 ,转化感受态大肠杆
菌 ,然后进行蓝白斑筛选 ,将阳性克隆经 PCR鉴
定后 ,送至上海生工测序 。
1.2.5 序列分析　运用 NCBI 和分子生物学软件
DNAman进行序列的比对和分析。
2　结果与讨论
2.1 总 RNA 质量的检测　以微孔草叶片为
材料提取的总 RNA 经凝胶电泳检测 ,结果显示
28S rRNA 和 18S rRNA的条带比较清晰(图 1),
经紫外分光光度计测定 OD260/ 280值为 1.92 ,表明
所提取的 RNA质量较好。
2.2 RT-PCR 扩增　以 cDNA 为模板 ,用引物
A1和 A2进行 PCR扩增 。用 1%琼脂糖凝胶电
泳检测结果(图 2)。从图 2可以看到 ,在接近 600
bp处有 1条清晰的条带 ,推测为目的条带。
2.3 阳性克隆的鉴定　将回收纯化的目的片
段连接到 pG EM-T 载体上 ,转化大肠杆菌 DH5α
感受态细胞 ,进行蓝白斑筛选。挑选菌落单一的
阳性克隆培养过夜 ,并进行 PCR检测 ,琼脂糖凝
胶电泳得出条带的大小与 RT-PCR一致(图 3)。
98 PRATACULTURAL SCIENCE(Vo l.27.No.04) 04/ 2010
图 3　微孔草 Actin基因阳性克隆菌体　　　
PCR产物的凝胶电泳　　　
　注:M 为 DNA marker;1 为阳性克隆菌体 PCR产物。
2.4 序列测定结果与分析 　测序得到 1 段
599 bp的序列 ,编码 199个氨基酸(图 4)。将该
序列在GenBank中进行 Blast 搜索 ,发现该序列
与已克隆得到的其他植物的 Actin基因的同源性
都在 84%以上 。目前 GenBank 中已注册的 Ac-
tin基因已超过 30 000个[ 12] 。随机选取蓖麻 Ric-
inus communis 、白莎蒿 Artemisia blepharolepis 、
红三叶 Tri f ol ium pratense 、霸王 Zygophy l lum
xanthoxy lum 、水稻 Oryza sat iva 和拟南芥 Ara-
bidopsis thaliana 6种植物的 Actin氨基酸序列 ,
运用 DNAman软件将这 6种植物与微孔草进行
氨基酸多重性比较(图 5),对比结果显示:它们之
间的同源性在 95%以上 ,确定该序列为微孔草的
Actin核心片段 。将该基因片段在 GenBank 中注
册 ,登录号为 GU171357。
图 4　微孔草肌动蛋白核心片段的核苷酸序列及推测的氨基酸序列
9904/ 2010 草　业　科　学(第 27 卷 04 期)
图 5　微孔草 Actin氨基酸序列片段与其他植物该基因氨基酸序列多重比较
　注:1.篦麻 , 大戟科 , GenBank 登陆号 XM002522148;2.白沙蒿 , 菊科 , GenBank 登陆号 FJ587512;3.红三叶 , 豆科 ,
GenBank 登陆号 AY372368;4.霸王 ,蒺藜科 , GenBank 登陆号 EU019550;5.水稻 , 禾本科 , GenBank 登陆号 AY212324;
6.拟南芥 ,十字花科 , GenBank 登陆号 AY120779;7.微孔草 ,紫草科 , GenBank 登陆号 GU171357。
　　制作上述 6 种植物和微孔草的进化树 ,结果
显示 ,它们之间的同源性都在 95%以上 ,其中蓖
麻 、白沙蒿和拟南芥的同源性最高 ,达到 99%,红
三叶 、水稻 、霸王与这 3种植物的同源性分别为
96%、97%和 98%。微孔草与其他 6种植物的同
源性都在 96%。选取的这 7种植物都隶属于不同
的科 ,生长环境也有所不同 ,但是它们的 Actin 基
因的同源性却很高 ,由此可见 ,高等植物的 A ctin
基因是一种高度保守的看家基因。
3　结论
试验所得微孔草的 A ct in基因核心片段序列
长 599 bp ,编码 199个氨基酸 ,将该序列与 Gen-
Bank 中已注册的植物 Actin 基因序列进行同源
性比较 ,其核苷酸序列的同源性均在 84%以上 ,
氨基酸序列同源性都在 95%以上 ,充分说明 Ac-
t in基因不论在核苷酸还是在氨基酸水平上都具
有高度的保守性和同源性 ,可作为内标参照 ,为今
后研究微孔草其它基因的功能提供依据和奠定基
础 。
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Cloning and sequence analysis of Actin gene fragment of Microula sikkimensis
WU Shu-juan , ZHANG Yi-gong , ZHANG Li-jing , FU Hua
(Key Labo rato ry o f G rassland A gro-ecosystem ,M inist ry of Ag riculture , Co llege of Pastoral
Ag riculture Science and Technology , Lanzhou Universi ty ,Gansu Lanzhou 730020 ,China)
Abstract:Total RNA of Microula sikk imensis was ext racted f rom leaf.The act in gene f ragment w as
amplif ied by reverse t ranscription polymerase chain reaction RT-PCR and then cloned into pGEM-T
vector.The gene f ragment w as sequenced af ter identi fying the po sitive clone by PCR.The resul ts re-
vealed that the actin gene f ragment f rom M.sikkimensis contains 599 bp and encodes a protein of 199
amino acids.Similarity comparison w ith o ther actin gene sequence in the GenBank showed that it
shared over 84% of nucleot ide sequence simi lari ty and ove r 95%of amino acid sequence similari ty wi th
other actin , which suggests that actin g ene of M.sikk imensis was highly conservative.
Key words:Microula sikkimensis;Actin gene;sequence analysis
本期出现的植物和动物种名
植物:
芒萁 Dicranopteris pedata 毛竹 P hy llostachys heterocycla cv.Pubescens
莓叶委陵菜(雉子筵 ,毛猴子)Potenti lla f ragarioides 蒙古冰草 Agropy ron mongolicum
蒙古韭 A llium mongolicum 苜蓿 Medicago sativa
纳罗克非洲狗尾草 Setaria sphacelata cv.Narok 柰李 P runus salicina va r.Co rdata cv.Younai
拟南芥 Arabidopsis thaliana 柠条 Caragana korshinski i
牛枝子 Lespedeza potaninii 披碱草 E lymus dahuricus
平托花生 Arachis pintoi cv.Amarillo 普那菊苣 Cichorium intybus cv.Puna
千叶蓍 Achillea mille f ollium 沙打旺(斜茎黄芪)Astragalus adsurgens
杉木 Cunninghamia lanceolata 少花蒺藜 Cenchrus pauci f lorus
水稻 Oryza sativa 喜旱莲子草(水花生)Alternanthera philoxeroides
玉米 Zea mays 瓣蕊唐松草(马尾黄连)Thalictrum petaloideum
梯牧草 Phleum p ratense 天山羽衣草 Alchemilla tianschanica
威提特东非狼尾草 Pennisetum clandestinum cv.Whittet 微孔草 Microula sik kimensis
无芒雀麦 Bromus inermis 五节芒 Miscanthus f lorid ulus
细果苔草 Carex stenocar pa 细茎冰草 Agrop yron trachycaulum cv.Slender
细叶韭 A llium tenuissimum 细枝盐爪爪 K ali dium gracile
狭叶柴胡 Bupleurum scorz oneri f oli um 狭叶米口袋 Gueldenstaedtia stenophy lla
线叶嵩草 Kobresia capilli f olia 细叶苔草 Carex stenophy lla
斜茎黄芪 Astragalus adsurgens 新疆杨 Populus alba var.pyr amida lis (下转 126 页)
10104/ 2010 草　业　科　学(第 27 卷 04 期)