全 文 ：氨基酸和生物资源　２０１６，３８（３）：５９～６２
Ａｍｉｎｏ　Ａｃｉｄｓ　＆Ｂｉｏｔｉｃ　Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ
收稿日期：２０１６－０３－２９　　修回日期：２０１６－０６－１４
作者简介：郭艳（１９９２－），女，硕士生，现主要从事植物分子生物学研
究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｇｕｏｙａｎ１１０２＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ
＊通讯联系人：Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｈａｎｇｍｅｉ＠ｓｃｂｇ．ａｃ．ｃｎ
基金项目：中国科学院Ａ类战略性先导科技专项（ＸＤＡ１３０２０５００）
ＤＯＩ：１０．１４１８８／ｊ．ａｊｓｈ．２０１６．０３．０１３
厚藤Ａｃｔｉｎ基因片段的克隆及序列分析
郭　艳１，２，张　美＊，夏快飞１，简曙光１，陈建通１
（１．中国科学院华南植物园，广东 广州５１０６５０；２．中国科学院大学，北京１０００４９）
摘要：为研究功能基因在厚藤（Ｉｐｏｍｏｅａ　ｐｅｓ－ｃａｐｒａｅ　Ｌ）中的表达和调控提供内参基因，本文根据Ａｃｔｉｎ基因的保守区设计
简并性引物，采用ＲＴ－ＰＣＲ克隆厚藤的Ａｃｔｉｎ基因片段，然后将获得的片段连接于克隆载体上进行测序，并运用分子生物学软
件对该基因序列进行分析。结果表明，该基因片段大小为５５４ｂｐ，编码１８４个氨基酸；该序列与其他植物Ａｃｔｉｎ基因的ｃＤＮＡ
序列的同源性均在８０％以上，与氨基酸序列的同源性在９４％以上。由此得出，本研究克隆的基因序列为Ａｃｔｉｎ基因片段，将
其命名为ＩｐＡｃｔｉｎ１，并登录在ＧｅｎＢａｎｋ，登录号为ＫＵ５６４６２７。
关键词：厚藤；Ａｃｔｉｎ基因；克隆；序列分析
中图分类号：Ｑ　９４３．２ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００６－８３７６（２０１６）０３－００５９－０４
Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ａｃｔｉｎ　Ｇｅｎｅ　Ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｆｒｏｍＩｐｏｍｏｅａ　ｐｅｓ－ｃａｐｒａｅ　Ｌ
ＧＵＯ　Ｙａｎ１，２，ＺＨＡＮＧ　Ｍｅｉ　１＊，ＸＩＡ　Ｋｕａｉｆｅｉ　１，ＪＩＡＮ　Ｓｈｕｇｕａｎｇ１，ＣＨＥＮ　Ｊｉａｎｔｏｎｇ１
（１．Ｓｏｕｔｈ　Ｃｈｉｎａ　Ｂｏｔａｎｉｃａｌ　Ｇａｒｄｅｎ，Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ　５１０６５０，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ，Ｃｈｉｎａ；
２．Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ　１０００４９，Ｃｈｉｎａ）
　　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏ　ｐｒｏｖｉｄｅ　ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ　ｇｅｎｅｓ　ｆｏｒ　ｓｔｕｄｙｉｎｇ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｇｅｎｅｓ　ｉｎ　Ｉｐｏ－
ｍｏｅａ　ｐｅｓ－ｃａｐｒａｅ　Ｌ，ｗｅ　ｄｅｓｉｇｎｅｄ　ａ　ｐａｉｒ　ｏｆ　ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ａｎｄ　ｃｌｏｎｅｄ　ｔｈｅ　ｐａｒｔｉａｌ　ＡｃｔｉｎｃＤＮＡ　ｂｙ　ＲＴ－ＰＣＲ，ａｃｃｏｒｄ－
ｉｎｇ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ　ｒｅｇｉｏｎｓ　ｏｆ　ｏｔｈｅｒ　ｐｌａｎｔ　Ａｃｔｉｎｓ．Ｔｈｅ　ｃＤＮＡ　ｆｒａｇｍｅｎｔｓ　ｗｅｒｅ　ｃｌｏｎｅｄ　ｉｎｔｏ　Ｔ　ｖｅｃｔｏｒ　ａｎｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ．Ｔｈｅ　ｒｅ－
ｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｉｓ　ＤＮＡ　ｆｒａｇｍｅｎｔ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ　５５４ｂｐ，ｅｎｃｏｄｅｄ　ａ　ｐａｒｔｉａｌ　Ａｃｔｉｎ　ｗｉｔｈ　１８４ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ．Ｈｏｍｏｌｏｇｙ　ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ
ｗｉｔｈ　ｏｔｈｅｒ　Ａｃｔｉｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｉｔ　ｓｈａｒｅｄ　ｏｖｅｒ　８０％ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｉｄｅｎｔｉｔｙ　ａｎｄ　９４％ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｉｄｅｎｔｉｔｙ
ｗｉｔｈ　ｏｔｈｅｒ　Ａｃｔｉｎｓ．Ｔｈｉｓ　ｃＤＮＡ　ｉｓ　ｎａｍｅｄ　ＩｐＡｃｔｉｎ１，ａｎｄ　ｉｓ　ｒｅｇｉｓｔｅｒｅｄ　ｉｎｔｏ　ＧｅｎＢａｎｋ（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒ：ＫＵ５６４６２７）．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｉｐｏｍｏｅａ　ｐｅｓ－ｃａｐｒａｅ　Ｌ；Ａｃｔｉｎｇｅｎｅ；ｃｌｏｎｅ；ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ
０　引　言
目前，植物分子生物学研究的热点之一是发掘
野生植物资源中的优异基因并深入研究其生物学功
能。其中，研究基因生物学功能的一个重要方面就
是研究基因的时空表达模式，目前通常采用ｒｅａｌ
ｔｉｍｅ　ＲＴ－ＰＣＲ的方法进行检测，而这一研究手段通
常需要首先确定一个稳定表达的持家基因（ｈｏｕｓｅ－
ｋｅｅｐｉｎｇ　ｇｅｎｅ）作为参考，即内参基因。Ａｃｔｉｎ基因
编码肌动蛋白，在真核细胞中普遍存在，在不同组织
和细胞中恒定表达，是植物基因表达研究常用的内
参基因。肌动蛋白是高等植物细胞骨架中微丝的主
要组分，执行重要的生理功能，如细胞分裂、细胞内
物质运输、细胞内信号传导等［１，２］。研究表明，高等
植物中Ａｃｔｉｎ基因的核苷酸序列高度保守，可通过
设计简并性引物来扩增不同植物物种的Ａｃｔｉｎ基因
片段。到目前为止，已在许多种高等植物如木薯
（Ｍａｎｉｈｏｔ　ｅｓｃｕｌｅｎｔａ　Ｃｒａｎｔｚ）［３］、花生（Ａｒａｃｈｉｓ　ｈｙ－
ｐｏｇａｅａ　Ｌ）［４］、豌豆 （Ｐｉｓｕｍ　ｓａｔｉｖｕｍ）［５］、向日葵
（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ　ａｎｎｕｕｓ）［６］、火龙果（Ｈｙｌｏｃｅｒｅｕｓ　ｕｎｄａ－
ｔｕｓ）［７］、多浆植物霸王（Ｚｙｇｏｐｈｙｌｌｕｍ　ｘａｎｔｈｏｘｙ－
ｌｕｍ）［８］、盐生植物碱蓬（Ｓｕａｅｄａ　ｇｌａｕｃａ）［９］中克隆获
得了Ａｃｔｉｎ基因片段。
厚藤（Ｉｐｏｍｏｅａ　ｐｅｓ－ｃａｐｒａｅ　Ｌ）也称马鞍藤、沙
藤、二叶红薯、马蹄草等，为旋花科（Ｃｏｎｖｏｌｖｕｌａｃｅ－
ａｅ）多年生草质藤本；茎极长而匍匐地面；叶互生，形
如马鞍；花期全年，以夏季最盛；聚伞花序，花冠漏斗
状，辐射对称，粉红色至浅紫红色［１０］。厚藤性喜高
郭艳 等：厚藤Ａｃｔｉｎ基因片段的克隆及序列分析
温、干燥和阳光充足的环境，耐盐、抗风和耐旱性极
佳；多生长于热带亚热带地区的海滨沙滩及路边向
阳处；在我国分布于浙江、福建、台湾、广东、广西和
海南等地［１１］。厚藤具有重要的药用价值，其组织中
含有多种药用成分，具有祛湿消肿的功能，是一种常
用民间草药［１２］。厚藤是典型的海滩植物，同时也是
沙砾不毛之地防风固沙的第一线植物，具有绿化、美
化环境和防风固沙的作用［１３，１４］。因此，厚藤是一种
优异的野生植物资源，在海岛和海岸带（特别是珊瑚
砂环境）植被恢复及防风固沙方面有非常重要的应
用价值。此外，由于厚藤的抗逆性极强，通过分子生
物学的手段研究厚藤的抗逆分子机制具有重要的科
学意义。针对植物功能基因特别是抗逆基因的研究
不仅可以了解这些基因的功能，而且有助于更好地
利用这些研究结果定向地改造植物性状，使其更好
地服务于人类社会。目前，有关厚藤的功能基因研
究方面未见报道。本文通过克隆厚藤的Ａｃｔｉｎ基因
并分析其序列，为后续克隆厚藤的功能基因，并研究
功能基因的表达模式提供内参基因。
１　材料与方法
１．１　实验材料选取
厚藤于２０１５年１０月引种自广东省汕尾市鲘门
镇的海滩，并栽培于本实验室。取成熟叶片样品，用
ＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ的水清洗后，采用锡箔纸包裹，立即冻存
于液氮中，之后置于－８０℃超低温冰箱中保存备用。
１．２　试剂和主要仪器
大肠杆菌ＤＨ５α菌株由本实验室保存。ＲＮＡ
的提取采用 Ｍａｇｅｎ公司 ＨｉＰｕｒｅ　Ｐｌａｎｔ　ＲＮＡ　Ｋｉｔｓ
（Ｒ４１５１）。ｃＤＮＡ链的合成依照全式金公司ＴｒａｎｓＳ－
ｃｒｉｐｔ　Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ　ｇＤＮＡ　Ｒｅｍｏｖａｌ　ａｎｄ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅ－
ｓｉｓ　ＳｕｐｅｒＭｉｘ的说明书进行。ＤＮＡ回收采用 Ｍａ－
ｇｅｎ公司 ＨｉＰｕｒｅ　Ｇｅｌ　Ｐｕｒｅ　ＤＮＡ　Ｋｉｔｓ。高保真Ｔａｑ
酶采用 ＴａｋａＲａ公司的 Ｐｒｏｂｅｓｔ　ＴＭ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒ－
ａｓｅ。本论文所用的ｐＭＤ－１８Ｔ载体从 ＴａＫａＲａ公
司购买，其他常规生化试剂均购自中国科学院喀斯
玛科苑商城。
本研究所使用的主要仪器包括紫外／可见分光
光度计（ＮａｎｏＤｒｏｐ　ＮＤ　１０００，赛默飞世尔科技有限
公司）、ＰＣＲ仪（Ａ３００Ｆａｓｔ　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ，杭州朗
基科学仪器有限公司）、琼脂糖凝胶电泳系统
（ＪＹ３００Ｃ，北京君意东方电泳设备有限公司）、凝胶
成像分析系统 （ＪＳ－６８０Ｂ，上海培清科技有限公司）
等。其他常规仪器如移液器、培养箱、摇床、冰箱等
均为本实验室自备。
１．３　方法
１．３．１　引物合成
通过查询 ＮＣＢＩ网站上（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｔｄ．
ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）上公布的多种植物的Ａｃｔｉｎ基因序
列，经序列同源性比对后，设计简并性引物ＡｃｔｉｎＰ１
和ＡｃｔｉｎＰ２，引物序列见表１。采用该简并引物扩增
厚藤Ａｃｔｉｎ基因的ｃＤＮＡ片段。推测该目的Ａｃｔｉｎ
基因的ｃＤＮＡ片段长度为６００ｂｐ左右。所需引物
由广州英潍捷基公司合成。
表１　厚藤Ａｃｔｉｎ基因片段克隆使用的简并引物序列
Ｔａｂ．１　Ｐｒｉｍｅｒｓ　ｆｏｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　Ａｃｔｉｎｇｅｎｅ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｆｒｏｍ
Ｉｐｏｍｏｅａ　ｐｅｓ－ｃａｐｒａｅ　Ｌ
引物 序列（５′→３′）
ＡｃｔｉｎＰ１ ＧＴＧＧＴＣＧＴＡＣＡＡＣ（Ａ／Ｔ）ＧＧＴＡＴＴＧＴＧ
ＡｃｔｉｎＰ２ ＧＡ（Ａ／Ｃ／Ｔ）ＣＣＴＣＣＡＡＴＣＣＡＧＡＣＡＣＴＧ
１．３．２　总ＲＮＡ提取
取厚藤的成熟叶片提取总ＲＮＡ，按照 Ｍａｇｅｎ公
司ＨｉＰｕｒｅ　Ｐｌａｎｔ　ＲＮＡ　Ｋｉｔｓ（Ｒ４１５１）的操作说明书提
取。对提取的总ＲＮＡ进行ＮａｎｏＤｒｏｐ　ＮＤ　１　０００紫外
可见分光光度计浓度检测和琼脂糖凝胶电泳。
１．３．３　ｃＤＮＡ单链的合成及Ａｃｔｉｎ片段的扩增
采用两步法以总ＲＮＡ为模板进行逆转录反应
获取ｃＤＮＡ第一链。ｃＤＮＡ单链的合成依照全式
金公司 ＴｒａｎｓＳｃｒｉｐｔ　Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ　ｇＤＮＡ　Ｒｅｍｏｖａｌ　ａｎｄ
ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ＳｕｐｅｒＭｉｘ的说明书进行。
以厚藤叶片的ｃＤＮＡ单链为模板，采用高保真
ＤＮＡ聚合酶Ｐｒｏｂｅｓｔ　ＴＭ ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ扩增厚藤
Ａｃｔｉｎ基因。所采用的引物为ＡｃｔｉｎＰ１和ＡｃｔｉｎＰ２，
ＰＣＲ反应体积为５０μＬ。ＰＣＲ扩增反应体系为：１０
ｘ　ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ　５μＬ，１０ｍｍｏｌ·Ｌ
－１　ｄＮＴＰ　Ｍｉｘｔｕｒｅ
４μＬ，１０μｍｏｌ·Ｌ
－１　ＡｃｔｉｎＰ１　１μＬ，１０μｍｏｌ·Ｌ
－１
ＡｃｔｉｎＰ２　１μＬ，Ｐｒｏｂｅｓｔ　
ＴＭ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　０．５μＬ，
ｃＤＮＡ模板２μＬ，ｄｄＨ２Ｏ２３６．５μＬ。各种成分混匀后
置于ＰＣＲ仪上进行反应。采用的ＰＣＲ反应程序为：
①９４℃预变性５ｍｉｎ；②９４℃变性３０ｓｅｃ、５６℃退火
４５ｓｅｃ、７２℃延伸４５ｓｅｃ，３０个循环；③７２℃延伸１０ｍｉｎ。
采用１％的琼脂糖凝胶电泳对获得的ＰＣＲ产
物进行电泳检测，并获得单一的 ＤＮＡ 条带，即为
ＰＣＲ扩增得到的Ａｃｔｉｎ基因片段。Ａｃｔｉｎ片段依照
Ｍａｇｅｎ公司 ＨｉＰｕｒｅ　Ｇｅｌ　Ｐｕｒｅ　ＤＮＡ　Ｋｉｔｓ说明书进
行琼脂糖凝胶电泳回收。ＤＮＡ片段回收后用普通
Ｔａｑ酶进行３′末端加Ａ处理。
１．３．４　阳性克隆的筛选与鉴定
将回收的ＤＮＡ片段连接于ｐＭＤ－１８Ｔ载体，
转化大肠杆菌感受态ＤＨ５α菌株，连接及转化方法
·０６·
氨基酸和生物资源
均参照ＴａＫａＲａ公司的说明书。将转化后的菌液涂
布在ＬＢ固体培养基（含 Ａｍｐｉｃｉｌｉｎ／ＩＰＴＧ／Ｘ－Ｇａｌ）
上，进行蓝白斑筛选，白色菌落可初步确定为阳性克
隆。随机挑取白色菌落进行菌落ＰＣＲ鉴定，提取质
粒，送至广州英潍捷基公司测序。
１．３．５　序列的生物信息学分析
序列的比较、翻译等在 ＯＭＩＧＡ 生物软件上进
行，序列同源性分析采用ＢＬＡＳＴ程序，在ＮＣＢＩ（ｈｔ－
ｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）网站上进行。
２　结果与分析
２．１　总ＲＮＡ检测结果
以厚藤的成熟叶片为材料提取总ＲＮＡ，经检测
ＯＤ２６０ｎｍ／ＯＤ２８０ｎｍ平均比值为２．１７，表明所提取
的总 ＲＮＡ 具有较高的纯度；电泳检测表明，２８Ｓ
ｒＲＮＡ、１８ＳｒＲＮＡ条带清楚（图１），表明总ＲＮＡ未
发生降解，可进行下一步的逆转录反应；总ＲＮＡ浓
度为７５ｎｇ·μＬ
－１。获得的总ＲＮＡ可以用于下一
步ＲＴ－ＰＣＲ扩增实验，获得ｃＤＮＡ。
图１　厚藤叶片总ＲＮＡ琼脂糖凝胶电泳检测
Ｆｉｇ．１　Ａｇａｒｏｓｅ　ｇｅｌ　ｅｌｅｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ｄｅｃｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｏｔａｌ
ＲＮＡ　ｉｎ　Ｉｐｏｍｏｅａ　ｐｅｓ－ｃａｐｒａｅ　Ｌ　ｌｅａｖｅｓ
２．２　ＲＴ－ＰＣＲ扩增
以逆转录反应获得的ｃＤＮＡ第一链做为ＰＣＲ
反应的模板，采用简并性引物 ＡｃｔｉｎＰ１和 ＡｃｔｉｎＰ２
进行常规ＰＣＲ扩增。获得的ＰＣＲ产物经电泳检测
显示，在６００ｂｐ左右有一条特异性的条带（图２），推
测有可能是我们所需要的厚藤Ａｃｔｉｎ基因的ｃＤＮＡ
片段，可进行下一步的ＤＮＡ片段回收。
２．３　阳性克隆的鉴定与测序
特异性ＤＮＡ片段经切胶回收后，连接于ｐＭＤ－
１８Ｔ载体上，并将连接产物转化大肠杆菌感受态
ＤＨ５α菌株。将转化菌液涂布于ＬＢ固体（含Ａｍｐｉ－
ｃｉｌｉｎ／ＩＰＴＧ／Ｘ－Ｇａｌ）培养基平板上进行蓝白斑筛选，
白色菌落可初步确定为阳性克隆。随机挑取白色单
菌落，用引物ＡｃｔｉｎＰ１和ＡｃｔｉｎＰ２进行菌落ＰＣＲ检测
（反应体系中未加菌落为阴性对照），得到的扩增片段
图２　厚藤Ａｃｔｉｎ基因的扩增
Ｆｉｇ．２　Ａｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｃｔｉｎｇｅｎｅ　ｆｒｏｍＩｐｏｍｏｅａ
ｐｅｓ－ｃａｐｒａｅ　Ｌ
大小约为６００ｂｐ（图３），与ＲＴ－ＰＣＲ结果一致，表明
这些克隆为阳性克隆，可以提取质粒，进行测序。
图３　重组克隆的菌落ＰＣＲ检测
Ｆｉｇ．３　Ｃｏｌｏｎｙ　ＰＣＲ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｃｌｏｎｅ
注：Ｍ：ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ；Ｃ：未加菌落的阴性对照；１－３：三个阳性单
菌落
Ｎｏｔｅ：Ｍ：ＤＮＡ　ｍａｒｋｅｒ；Ｃ：ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ；１－３：ｐｏｓｉｔｉｖｅ
ｃｌｏｎｅｓ
２．４　序列分析
随机挑取３个阳性克隆，扩增培养后提取质粒，
将重组质粒进行测序，结果表明，３个阳性克隆均插
入相同的ｃＤＮＡ序列，大小均为５９８ｂｐ，表明我们所
获得的Ａｃｔｉｎ基因在厚藤叶片中表达量最高，因此才
最容易被扩增出来。去掉两端的简并性引物序列之
后，获得的ｃＤＮＡ片段大小为５５４ｂｐ，该片段编码１８４
个氨基酸（图４）。将该基因命名为ＩｐＡｃｔｉｎ１。并将该
序列登录在ＧｅｎＢａｎｋ上，序列号为ＫＵ５６４６２７。
将该 ｃＤＮＡ 片 段 在 ＮＣＢＩ 数 据 库 中 进 行
ＢＬＡＳＴ分析，发现该序列与烟草的Ａｃｔｉｎ基因（ＸＭ
＿００９７８９２６０．１）同源性最高，相对应区域的核苷酸序
列一致性达到了８７％，与其他植物的核苷酸序列一
致性也均在８０％以上。氨基酸序列分析表明，该
Ａｃｔｉｎ片段（１８４个氨基酸）与芝麻的 Ａｃｔｉｎ蛋白
（ＡＨＹ３５１６７．１）的对应区域仅有一个氨基酸的差
别，氨基酸序列一致性达到９８％，与其他植物Ａｃｔｉｎ
的氨基酸序列一致性也均在９０％以上。结果表明，
所获得的厚藤ＩｐＡｃｔｉｎ１的ｃＤＮＡ片段确实为植物
中高度保守的Ａｃｔｉｎ基因片段，可用于下一步的研
究工作中。
·１６·
郭艳 等：厚藤Ａｃｔｉｎ基因片段的克隆及序列分析
图４　厚藤Ａｃｔｉｎ（ＩｐＡｃｔｉｎ１）ｃＤＮＡ片段的核苷酸序列
及推测的氨基酸序列
Ｆｉｇ．４　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎｄ　ｄｅｄｕｃｅｄ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ
ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　Ａｃｔｉｎ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｆｒｏｍＩｐｏｍｏｅａ　ｐｅｓ－ｃａｐｒａｅ　Ｌ
３　讨论与分析
植物肌动蛋白 （Ａｃｔｉｎ）是组成细胞骨架微丝的
基本成分，通常在不同组织和细胞中普遍存在并稳
定表达。正是由于Ａｃｔｉｎ基因具有这种稳定表达特
征，通常被认定为持家基因。在功能基因表达模式
的研究中，通常需要选择一个稳定表达的持家基因
作为分子内标，用来消除不同ＲＮＡ样品在操作过
程中可能存在的差别，从而对基因表达的定量分析
进行归一化［１５，１６］。目前，在多个植物物种中，已采
用Ａｃｔｉｎ基因作为稳定表达的内参基因，对其功能
基因的表达进行定量分析。
在本研究中，已成功地克隆了厚藤的Ａｃｔｉｎ基
因ＩｐＡｃｔｉｎ１。序列分析表明，在核苷酸序列同源性
比较方面，ＩｐＡｃｔｉｎ１片段与其他植物Ａｃｔｉｎ基因的
同源性均在８０％以上；在编码的氨基酸序列同源性
比较方面，其同源性也达到了９０％以上。由序列分
析结果结合以往的研究，我们可以推测出，本研究所
获得的ＩｐＡｃｔｉｎ１基因可能也是一个高度保守的持
家基因。本实验采用厚藤的成熟叶片为材料，提取
ＲＮＡ，通过逆转录扩增Ａｃｔｉｎ基因片段，随机挑取
的３个重组克隆经测序均编码同一个Ａｃｔｉｎ基因片
段，由于植物体内的Ａｃｔｉｎ基因通常由多基因编码，
表明所获得的Ａｃｔｉｎ基因可能是厚藤植株内表达最
丰富的Ａｃｔｉｎ基因，进一步确定了该基因可用作内参
基因，可以用于后续厚藤功能基因表达模式的研究。
厚藤是一种分布广泛的滨海适生植物，耐盐碱
和耐旱性极佳，蕴藏着丰富的抗逆基因资源。本项
目组正致力于发掘厚藤的抗逆遗传资源，并克隆抗
逆功能基因。而要深入研究这些功能基因的表达模
式及调控机制，通常需要内参基因作为对照。目前，
还没有研究报道厚藤的基因克隆方面的工作，而对
厚藤的抗逆分子机制的研究也还未起步。在本论文
中，我们首次报道了厚藤ＩｐＡｃｔｉｎ１基因的克隆和序
列分析，为后续克隆厚藤的抗逆功能基因和分析基
因表达模式提供了可供参考的内参基因，为进一步
研究厚藤的抗逆分子机制奠定了工作基础。
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·２６·