全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第2期
纳豆激酶（Subtilisin NAT）是由枯草芽孢杆菌
分泌表达的高效纤维蛋白溶解酶，最早从传统的日
本大豆发酵产品纳豆中发现［1］。纳豆激酶对纤维蛋
白显示了极高的底物特异性［2］，其血栓溶解活性是
纤溶酶的 4 倍［3，4］。纳豆激酶可以直接溶解交联状
的血栓块，还可以催化血纤维蛋白溶酶原转化为血
纤维蛋白溶酶，增加体内血栓溶解因子的合成，失
活纤维蛋白溶解抑制剂等［4-7］。纳豆激酶除了溶解
血栓外，还可以降血压、血脂和胆固醇［8］，诱导晚
期玻璃体分解，治疗玻璃体视网膜紊乱病人等［6］。
收稿日期 ：2012-09-29
基金项目 ：中国农业科学院科技经费项目（201211）
作者简介 ：李淑英，女，博士，助理研究员，研究方向 ：微生物生化与分子生物学 ；E-mail ：lishuying@caas.net.cn
通讯作者 ：唐选明，男，副研究员，研究方向 ：食品科学 ；E-mail ：tangxuanming@caas.net.cn
纳豆激酶生产菌 BSNK-5 鉴定及发酵条件优化
李淑英1  聂莹1  杜欢1  赵仲麟2  袁超2  李燕3  宋晓燕4  唐选明1
（1. 中国农业科学院农产品加工研究所，北京 100193 ；2. 河南农业大学理学院，郑州 450002 ；3. 郑州轻工业学院食品与生物工程学院，
郑州 450002 ；4. 河南农业大学食品科学技术学院，郑州 450002）
摘 要 ： 对分离的纳豆激酶生产菌 BSNK-5 进行初步鉴定 ；并对其液体发酵产酶条件进行了初步研究，旨在提高纳豆激酶的
产量。通过鉴定 BSNK-5 为枯草芽孢杆菌属菌株。试验优化了发酵培养基的最适氮源和碳源种类及百分含量，发酵培养基的起始
pH 值，最适种子接种量，发酵温度，培养时间等。最终确定了两个最适的产酶条件，在该条件下，BSNK-5 通过液体发酵产纳豆
激酶的活力高达 1 160 U/mL，比优化前提高 283%。
关键词 ： 枯草芽孢杆菌 纳豆激酶 液体发酵
Identification of BSNK-5 and Optimization of the
Fermentation Conditions
Li Shuying1 Nie Ying1 Du Huan1 Zhao Zhonglin2 Yuan Chao2 Li Yan3
Song Xiaoyan4 Tang Xuanming1
（1. Institute of Agro-products Processing Science and Technology，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100193 ；2. College of
Sciences，Henan Agricultural University，Zhengzhou 450002 ；3. School of Food and Biological Engineering，Zhengzhou University of Light
Industry，Zhengzhou 450002 ；4. College of Food Science and Technology，Henan Agricultural University，Zhengzhou 450002）
Abstract:  Nattokinase production bacteria BSNK-5 was preliminarily identified. The effects of liquid fermentation on nattokinase activity
produced by BSNK-5 were studied in order to improve production yield. BSNK-5 is a Bacillus subtilis. Different carbon sources, nitrogen sources,
pH, inoculate size；temperature, and time were optimized. Two optimum culture conditions were obtained. The nattokinase activity was 1 160 U/mL
under the optimum culture conditions, which was 283% times of the former culture conditions.
Key words:  Bacillus natto Nattokinase Liquid fermentation
与临床应用的溶栓药物相比，纳豆激酶具有溶纤活
性高、安全可靠、无毒副作用、半衰期长、在胃肠
道中稳定性好等优点。该蛋白除了静脉注射外，还
可以口服，生产成本低廉［6，9］，具有重要的开发价值。
优化培养基组成和发酵工艺，可以明显提高芽
孢杆菌的纳豆激酶产量［9-11］。本试验对分离筛选的
纳豆激酶生产菌 BSNK-5 进行了菌落形态观察和分
子鉴定 ；并采用单因素和正交试验对筛选菌株产纳
豆激酶的液体发酵条件进行了初步研究，以期提高
纳豆激酶产量，为该酶的进一步扩大培养奠定基础。
2013年第2期 185李淑英等 ：纳豆激酶生产菌 BSNK-5 鉴定及发酵条件优化
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌 种 纳 豆 枯 草 芽 孢 杆 菌（Bacillus natto）
BSNK-5，由本实验室分离并保存。
1.1.2 主 要 试 剂 纤 维 蛋 白 原（ 牛 血， 批 号 ：
140626-201009）、尿激酶标准品（1 280 U/支）和凝
血酶（560 U/支）均购于中国药品生物制品检定所，
LB Broth Ultrapure（USB），酵母浸粉（南通香地生
物有限公司），胰蛋白胨（OXOID），其余试剂均为
国产分析纯。
1.1.3 培 养 基 斜 面 和 种 子 培 养 基 ：LB 培 养 基。
液 体 发 酵 培 养 基 ：氮 源， 碳 源，Na2HPO4 0.6%，
NaH2PO4 0.1%，MgSO4 0.05%，CaCl2 0.02%，pH7.0。
1.1.4 仪器 立式压力蒸汽灭菌锅（YXQ-LS-50A，
上海博迅实业有限公司医疗设备厂）、恒温培养振荡
器（ZHWY-200H，上海智城分析仪器制造有限公司）、
台式高速离心机（TG16MW，湖南赫西仪器装备有
限公司）、电热恒温培养箱（DHP-9082 型，上海一
恒科学仪器有限公司）。
1.2 方法
1.2.1 菌种鉴定 形态学鉴定 ：LB 培养基培养菌株
BSNK-5，用光学显微镜和扫描电子显微镜观察拍照。
分子生物学鉴定 ：提取 BSNK-5 的基因组，细
菌 16S rDNA 扩增引物及方法参照文献［12］，扩增
片 段 送 Invitrogen 公 司 测 序。 测 序 结 果 在 NCBI 网
站利用 Blast 进行比对，调出相似序列，用 Clustal
X1.83 和 MEGA 3.1 软件构建系统发育树［13］。
1.2.2 菌种的培养 用接种环挑取斜面菌种，接于
种子培养基（装液量 10 mL/50 mL）中，37℃，200
r/min 摇床培养 24 h。然后根据试验设计，以不同的
接种量接于液体发酵培养基（装液量 20 mL/100 mL）
中，设置不同温度，200 r/min 摇床培养不同时间。
1.2.3 产酶条件的优化
1.2.3.1 最适氮源优化 固定碳源为 2% 的葡萄糖，
分别采用浓度为 1% 的大豆蛋白胨、胰蛋白胨、蛋
白胨和酵母浸粉为氮源，其他试剂同 1.1.3 配置液体
发酵培养基。以 3% 的接种量接菌种于液体发酵培
养基中，37℃、200 r/m 摇床培养 72 h。离心收集上
清液测纳豆激酶活力，以确定最佳氮源。每个试验
重复 3 次。
1.2.3.2 最适碳源优化 据 1.2.3.1 确定最佳氮源为
酵母浸粉，故采用氮源为 1% 的酵母浸粉，碳源分
别采用浓度为 2% 的葡萄糖、麦芽糖、蔗糖和木糖，
其他试剂同 1.1.3 配置液体发酵培养基。以 3% 的接
种量接菌种于液体发酵培养基中，37℃、200 r/min
摇床培养 72 h。离心收集上清液测纳豆激酶活力，
以确定最佳碳源。每个试验设 3 个重复。
1.2.4 酶活测定方法（纤维蛋白平板法） 琼脂糖 -
纤维蛋白平板的配制 ：含有 1% 琼脂糖的 pH7.2 PBS
溶液，50℃恒温水浴 45 min，加入凝血酶（最终
活性 0.05 U/mL）和同样温度下水浴 10 min 的等量
含有 0.1% 纤维蛋白原的 pH7.2 PBS 溶液，混匀。9
cm×9 cm 的培养皿加入 35 mL 此溶液，凝固后用直
径 5 mm 打孔器打孔，上样 10 μL（菌株发酵液的上
清液），37℃恒温培养 18 h，测量溶解圈的直径，计
算溶解圈的面积，根据尿激酶标准曲线计算酶的活
力单位。
尿激酶标准曲线的制作参考马明等［14］的方法。
2 结果
2.1 BSNK-5菌种鉴定
2.1.1 形态特征 LB 平板划线，37℃培养 24 h 后，
菌落圆形，乳白色，不透明，边缘不整齐，表面干燥，
有皱褶，用接种环挑菌落有拉丝现象，菌落与培养
基不结合，菌落正反面颜色相同。显微镜下个体形
态观察，菌株杆状，两端钝圆，革兰氏染色呈阳性，
产芽孢，芽孢椭圆形，中生或近中生（图 1）。
图 1 BSNK-5 显微镜形态观察
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第2期186
2.1.2 16S rDNA 序列分析及系统发育构建 PCR 扩
增 所 得 BSNK-5 菌 株 16S rDNA 全 长 1 509 bp， 将
BSNK-5 的 16S rDNA 测 序 结 果 经 Blast 比 对， 与
BSNK-5 菌株 16S rDNA 同源性较高的菌株均为枯草
芽孢杆菌菌株，从中选择 15 条同源性高于 99% 的
16S rDNA 序列构建系统发育树，结果（图 2）显示，
BSNK-5 菌株与 Bacillus subtillis 属菌株在同一分枝
上，结合菌株形态特征，初步鉴定 BSNK-5 为枯草
芽孢杆菌属菌株。
可计算出纳豆激酶的纤溶活性，即相当于尿激酶的
活力单位。
2.3 产酶条件的优化
2.3.1 最适氮源的优化 固定碳源为 2% 的葡萄糖，
分别采用浓度为 1% 的大豆蛋白胨、胰蛋白胨、蛋
白胨和酵母浸粉为氮源，其他试剂同 1.1.3 配置液体
发酵培养基。以 3% 的接种量接菌种于液体发酵培
养基中，37℃、200 r/min 摇床培养 72 h。离心收集
上清液测纳豆激酶活力，以确定最佳氮源。每个试
验重复 3 次，结果见图 4。
BSNK-5
Bacillus subtilis strain ZLY
Bacillus subtilis strain TUL322
Bacillus subtilis subsp. subtilis strain SB 3295
Bacillus subtilis strain Acj 115
Bacillus sp. LS02
Bacillus subtilis strain zj2008
Uncultured bacterium clone ZT-5-7
Bacillus subtilis strain CD-25
Bacillus subtilis strain WD20
Bacillus subtilis strain PAB1C8
Bacillus subtilis strain JM1C6
Bacillus subtilis strain JM1C5
Bacillus subtilis strain K21
Bacillus subtilis strain PRE23
Bacillus subtilis strain SMY
图 2 BSNK-5 的系统发育树
0
100
200
300
400
500
600
0
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U
/m
L
ⓦ䀓സ䶒〟mm2
50 100 150 200 250 300 350
y=1.9769x106.33
R2=0.9824
图 3 尿激酶标准曲线
图 4 不同氮源对菌株产纳豆激酶的影响
བྷ䉶㳻ⲭ㜘 㳻ⲭ㜘 㜠㳻ⲭ㜘 䞥⇽⎨㊹
1200
1000
800
600
400
200
0
㓣䉶
◰䞦
⍫࣋
IU
/m
L
由图 4 可知，不同氮源对纳豆激酶的产生有很
大的影响，4 种氮源的产酶量差距很大，以酵母浸
粉为最高，达到 1 115 U/mL，大豆蛋白胨其次，胰
蛋白胨最低。酵母浸粉是微生物源的培养基成分，
相比于动植物源蛋白胨和大豆蛋白胨，可能更易于
微生物的吸收利用。故选取酵母浸粉为最佳氮源。
2.3.2 最适碳源的优化 由图 5 可知，4 种碳源均
适宜菌种的发酵，产酶量都较高，单糖葡萄糖和木
糖的产酶量相当，二糖蔗糖和麦芽糖的产酶量相当；
但以二糖为碳源时 BSNK-5 的产酶量较单糖的产酶
量高，而两种二糖中以麦芽糖为碳源时菌种产酶量
最高，达到 986 U/mL，与李文亮等［15］的研究一致，
且麦芽糖的价格比较适宜，来源比较广泛，适宜工
业化生产，故碳源采用麦芽糖为最佳。
2.3.3 培养条件对产酶量的影响 本研究在确定了
最佳氮源和碳源的试验基础上设计 6 因素 5 水平的
完全随机正交试验，考察不同浓度的氮源和碳源，
不同起始 pH 的发酵培养液，不同接种量、培养温
2.2 尿激酶的标准曲线
测量不同浓度尿激酶在纤维蛋白平板上 2 个互
相垂直的溶解圈直径，并计算溶解圈的面积，重复
试验 3 次，求平均值，制作尿激酶标准曲线，得出
了尿激酶的活力与溶解圈面积呈线性关系，结果见
图 3。
由 图 3 可 知， 尿 激 酶 标 准 曲 线 线 性 关 系 为
y=1.9769x-106.33，R2=0.9824。此标准曲线可用于测
定纳豆激酶的活性，根据纳豆激酶溶解圈面积大小，
2013年第2期 187李淑英等 ：纳豆激酶生产菌 BSNK-5 鉴定及发酵条件优化
度和发酵时间对 BSNK-5 发酵产纳豆激酶的影响。
正交试验设计见表 1，试验结果见表 2。
shiokara［17，18］，日本纳豆［5］，韩国的 hungkook-jang
soy sauce［19，20］，Doen-jang［21］，台湾土壤［22］，中国
的豆豉［2，23］和亚洲发酵虾酱［24］中分离到了纳豆激
酶生产菌。为了得到更多优势菌株，人们仍在不同
的产品和环境中筛选纳豆激酶生产菌株。
其次，通过物理或化学方法诱变选育纳豆激酶
高产菌株。夏丽等［25］通过紫外线直接照射涂菌蛋
白平板，筛选到一个高产突变株，其纤溶活性比出
发菌株提高了 8.81%。关志伟等［26］通过盐酸羟胺和
紫外线复合诱变获得一株高产纳豆激酶突变株，其
产酶活性比野生菌提高了 68%。刘新梅等［27］通过
对纳豆菌原生质体紫外诱变得到一株高产纳豆激酶
菌株，其发酵液的酶活力比诱变前提高了 74.5%。
再者，对纳豆激酶生产菌发酵条件优化提高纳
豆激酶的产量。优化培养基组成和发酵工艺，可以
明显提高芽孢杆菌的纳豆激酶产量［9-11］。研究发现，
液体发酵培养基的氮源、碳源及其百分含量，液体
表 1 正交试验设计简表
水平
酵母浸
粉（%）
麦芽糖
（%）
温度
（℃）
时间
（h）
pH
接种量
（%）
1 0.5 1 30 24 6 1
2 1 2 35 36 6.5 2
3 1.5 3 37 48 7 3
4 2 4 43 60 7.5 4
5 2.5 5 47 72 8 5
表 2 正交试验结果
试验号 A B C D E F 纳豆激酶活力（U/mL）
1 1 1 1 1 1 1 676
2 1 2 2 2 2 2 825
3 1 3 3 3 3 3 864
4 1 4 4 4 4 4 904
5 1 5 5 5 5 5 904
6 2 1 2 3 4 5 986
7 2 2 3 4 5 1 252
8 2 3 4 5 1 2 825
9 2 4 5 1 2 3 386
10 2 5 1 2 3 4 986
11 3 1 3 5 2 4 904
12 3 2 4 1 3 5 825
13 3 3 5 2 4 1 749
14 3 4 1 3 5 2 904
15 3 5 2 4 1 3 904
16 4 1 4 2 5 3 786
17 4 2 5 3 1 4 749
18 4 3 1 4 2 5 1160
19 4 4 2 5 3 1 864
20 4 5 3 1 4 2 749
21 5 1 5 4 3 2 476
22 5 2 1 5 4 3 1160
23 5 3 2 1 5 4 825
24 5 4 3 2 1 5 749
25 5 5 4 3 2 1 904
㪑㨴㌆ 㭇㌆ 哖㣭㌆ ᵘ㌆
1200
1000
800
600
400
200
0
㓣䉶
◰䞦
⍫࣋
IU
/m
L
图 5 不同碳源对菌株产纳豆激酶的影响
由表 2 可知酵母浸粉和麦芽糖的百分含量，发
酵培养基的起始 pH 值，菌种接种量，培养温度，
发酵时间对 BSNK-5 液体发酵产纳豆激的量有明显
影响。25 个平行试验中有 2 个试验结果是相同的，
酶活最高达到 1 160 U/mL，这两个最佳的液体发酵
培养条件分别为：（1）2% 的酵母浸粉、3% 的麦芽糖、
最适 pH 为 6.5、接种量为 5%、培养温度为 30℃、
培养时间为 60 h ；（2）2.5% 的酵母浸粉、2% 的麦
芽糖、最适 pH 为 7.5、接种量为 3%、培养温度为
30℃、培养时间为 72 h。
3 讨论
纳豆激酶突出的生物学功能，特别是在血栓溶
解方面的优势使其成为了当今研究的热点。目前关
于纳豆激酶的研究主要是提高该酶的产量，主要途
径集中于以下几个方面。
首先，筛选纳豆激酶高产菌株。自从 1987 年
Sumi 等［1］ 第一次在纳豆食品中发现了纳豆激酶
以来，人们相继在一些海洋生物［14］，如 skipjack
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第2期188
发酵培养基的 pH 值，菌种接种量，培养温度，发
酵时间等各个因素都会明显影响纳豆芽孢杆菌的生
长状态，从而影响到酶的产量。芽孢杆菌在营养缺
乏或不适的环境极易形成芽孢，进入休眠状态，从
而停止产酶，这也是芽孢杆菌在实际生产应用中的
一个瓶颈。
本 研 究 对 实 验 室 分 离 的 纳 豆 激 酶 高 产 菌 株
BSNK-5 进行鉴定，结合形态学观察确认为枯草芽孢
杆菌属菌株。对 BSNK-5 发酵产纳豆激酶的各个因
素进行了初步的探讨研究，通过优化该菌株发酵过
程中的发酵培养基的氮源、碳源及其百分含量，液
体发酵培养基的 pH 值，菌种接种量，培养温度和
发酵时间，尽量使菌株处于最适生长环境，提高纳
豆激酶的产量。试验结果也进一步证实在优化条件
下，BSNK-5 的纳豆激酶产量明显提高，高达 1 160
U/mL。与之前相比（发酵条件优化前 BSNK-5 的纳
豆激酶酶活力为 303 U/mL），活性提高到 283%。
4 结论
通过形态学观察和分子鉴定，BSNK-5 为枯草
芽孢杆菌属菌株。对影响 BSNK-5 液体发酵产纳豆
激酶的不同因素进行了初步探讨研究。由液体发酵
产酶的单因素和正交试验结果表明纳豆激酶的最佳
产酶条件为 ：（1）2% 酵母浸粉，3% 麦芽糖，0.6%
Na2HPO4，0.1% NaH2PO4，0.05% MgSO4，0.02%
CaCl2，pH6.5，接种量为 5%，30℃发酵培养 60 h ；
（2）2.5% 酵母浸粉，2% 麦芽糖，0.6%Na2HPO4，0.1%
NaH2PO4，0.05% MgSO4，0.02% CaCl2，pH7.5，接种
量为 3%，30℃发酵培养 72 h。在最适产酶条件下纳
豆激酶的活性为 1 160 U/mL，是之前的 283%。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）