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Cloning and Prokaryotic Expression of Sweet Sorghum Succinic Semialdehyde Dehydrogenase SbSSADH

甜高粱琥珀酸半醛脱氢酶SbSSADH基因克隆及原核表达



全 文 :·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(7):83-90
收稿日期 :2015-03-24
基金项目 :国家自然科学基金项目(31271790,31471558)
作者简介 :王龙海,男,硕士,研究方向 :甜高粱分子遗传育种 ;E-mail :kdswanglonghai@163.com
通讯作者 :朱莉,女,副研究员,硕士生导师,研究方向 :植物抗逆分子生物学 ;E-mail :zhuli01@caas.cn
甜高粱琥珀酸半醛脱氢酶 SbSSADH 基因克隆及
原核表达
王龙海1,2  杨泽伟1,2  朱莉2  黄大昉2  郎志宏2
(1. 西南科技大学生命科学与工程学院,绵阳 621010 ;2. 中国农业科学院生物技术研究所,北京 100081)
摘 要 : γ- 氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)代谢旁路是 TCA 循环的一个代谢支路,广泛存在于动植物和微生物中,
植物 GABA 代谢旁路与植物生物和非生物胁迫响应相关。琥珀酸半醛脱氢酶(SSADH)是 GABA 旁路的一个关键酶,对 GABA 途
径在生物体内发挥功能起着至关重要的作用。通过检索 MaizeGDB 和 Gramene 数据库获得甜高粱 SbSSADH 基因信息,利用同源克
隆的方法获得了甜高粱 SbSSADH 基因。序列分析结果表明,SbSSADH 基因与玉米、甘蔗在核酸序列的相似度为 94.77%,但前端约
200 bp 的信号肽部分差异较大。通过以 pET-28a 为表达载体构建 SbSSADH 原核表达系统,Rosetta 菌株为表达菌,表达出约 50 kD
的 SSADH 蛋白,将纯化的蛋白进行酶活分析,纯化蛋白具有琥珀酸半醛脱氢酶活性,并且受酶抑制剂 ATP 和 AMP 的抑制。
关键词 : 甜高粱 ;SSADH ;蛋白表达 ;酶活测定
DOI :10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.07.013
Cloning and Prokaryotic Expression of Sweet Sorghum Succinic
Semialdehyde Dehydrogenase SbSSADH
Wang Longhai1,2 Yang Zewei1,2 Zhu Li2 Huang Dafang2 Lang Zhihong2
(1. Southwest University of Science and Technology,School of Life Science and Engineering,Mianyang 621010 ;2. Biotechnology Research
Institute,Chinese Academy of Agriculture of Science,Beijing 100081)
Abstract: Gamma-aminobutyric acid(GABA)shunt is a metabolism bypass of tricarboxylic acid cycle(TCA)and widely existed in
animals, plants and micro-organism. The activity of the GABA shunt is drastically enhanced in response to biotic and abiotic stress. Succinic
semialdehyde dehydrogenase(SSADH), which can oxidize succinic semialdhyde into succinate, is one kind of key enzymes in the metabolic
pathway of the γ-aminobutyric acid(GABA)shunt, and plays an important role in biological functioned of GABA shunt in organisms.
Objective :This study aimed to construct the prokaryotic expression vector of Sweet Sorghum SSADH and express the soluble protein in E.coli.
With the primers designed according to the homologous genes sequence provided by MaizeGDB and Gramene databases and mRNA from sweet
sorghum as a template, SSADH gene cDNA was cloned with RT-PCR. Sequence analysis showed that SbSSADH gene have 94.77% similarity
with Corn and Sugarcane SSADH gene, but the forward 200 bp signal peptide sequence of SSADH gene are different. The construct harboring
the truncated SSADH gene fragment without the signal peptide sequence of SbSSADH were transformed into E. coli Rosetta cell, respectively.
The expression and purification of proteins were detected with SDS-PAGE, and the enzyme activity of soluble protein SSADH was analyzed
with enzymatic dynamics analysis. Results showed that we cloned the cDNA of SSADH from sweet sorghum, constructed the pET-28a-SSADH
prokaryotic expression vector, and obtained the soluble protein :the result of enzymatic kinetics analysis indicated that the expressed protein
has activity of Succinic semialdehyde dehydrogenase and activity have been inhibited by AMP and ATP. In this study the SSADH prokaryotic
expression vector was constructed successfully and recombinant expression soluble protein of SSADH has Succinic semialdehyde dehydrogenase
activity.
Key words: Sweet Sorghum ;SSADH ;protein expression ;enzyme assay
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.784
γ- 氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)代谢
旁路是 TCA 循环的一个重要的旁路代谢途径,广
泛存在于动植物及微生物中 ;该旁路起始于 α-酮
戊二酸,α-酮戊二酸经脱羧后转变为谷氨酸 ;而谷
氨酸进入线粒体后在谷氨酸脱羧酶(Glutamic acid
decarboxylase,GAD)作用下生成 GABA ;GABA 经
γ-氨基丁酸转氨酶(γ-aminobutyric acid transaminase,
GABA-T)催化反应生成琥珀酸半醛(Succinic semi-
aldehyde,SSA);而琥珀酸半醛在琥珀酸半醛脱氢酶
SSADH 作用后生成琥珀酸,直接回到 TCA 循环(图
1)[1-4]。GABA 途径与哺乳动物大脑神经系统功能
显著相关[5-8],该途径也出现在非神经元细胞、植
物细胞、简单真核细胞和原核细胞中[9-11]。植物
GABA 途径可以增强其对生物和非生物逆境胁迫响
应的能力[12]。
琥 珀 酸 半 醛 脱 氢 酶(Succinic semialdehyde
dehydrogenase,SSADH)是 GABA 代谢途径中的一
个关键酶[10,13-15]。目前对于 SSADH 的研究多集中
于拟南芥 ;研究表明拟南芥 SSADH 基因对于增强拟
南芥响应各种生物和非生物胁迫起着主要的作用。
拟南芥 SSADH 基因的 T-DNA 插入突变导致植株矮
小、叶片坏死以及对热和 UV-B 敏感并且导致突变
体中 H2O2 的积累 ;由于突变体表皮毛细胞对光照敏
感,所以突变体暴露在高光照条件下,H2O2 迅速积
累并导致细胞死亡[12,14,16-18];最新的研究表明拟
南芥的 SSADH 基因还与拟南芥叶片的极性发育和伸
长有关[19]。因此,有研究认为拟南芥 SSADH 基因
的功能与防御环境胁迫,阻止活性氧自由基的积累
有关。在水稻中 SSADH(OsALDH5)基因在幼叶、
幼根、茎和穗中的表达量低,但是在干旱胁迫下上
调表达[20]。
SSADH 基因是乙醛脱氢酶(aldehyde dehydro-
genase,ALDH)超基因家族中的一员,属于第五
亚 家 族(ALDH5), 是 一 类 NAD(P)+ 依 赖 的 酶
类[21-25];而 AMP 和 ATP 是 SSADH 酶 的 竞 争 性 抑
制剂 ;AMP 和 ATP 进入反应中与 SSADH 结合,随
即形成复合体,替代了 NAD(P)+ 的位置,从而阻
止反应的发生[10,14,15,26]。
甜高粱(Sorghum bicolor L. Moench)是一种耐
盐碱、耐贫瘠、耐旱的作物 ;作为一种常见的 C4 能
源植物,甜高粱具有广阔的应用前景。甜高粱生物
产量高,每公顷甜高粱可以获得籽粒 2 250-4 500
kg,产糖大约 75 t[27];抗逆性强、适应性广,以
耐受各种恶劣的气候和土壤环境 ;用途广且产品
多,可用于生产糖浆、粮食、乙醇、饲料以及造纸
业,在不同区域和不同条件下可以生产多种产品,
实现甜高粱原料的多级利用[28]。高粱本身具有许
多优良的抗逆特性,然而 GABA 途径在高粱的抗逆
特性中所发挥的作用还不明确 ;SSADH 这个关键酶
所发挥的作用未见报道。因此,本实验通过对甜高
粱 SbSSADH 基因克隆、原核表达并测定其酶活,初
步验证甜高粱 SSADH 蛋白的功能,旨在为甜高粱
SbSSADH 基因在甜高粱的抗逆研究奠定理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物品种 甜高粱品种 Keller,由本实验室
保存,水培发芽。
1.1.2 菌 株 与 载 体 pEASY-Blunt 载 体 购 自 Trans
Gene 公司 ;pET-28a 载体由中国农业科学院生物技
术研究所林敏实验室惠赠 ;TOP10 感受态细胞购自
康为世纪生物科技有限公司 ;Rosetta 感受态细胞为
本实验室保存。
1.1.3 试剂 Trizol 溶液购自 Invitrogen 公司 ;反转
录试剂盒购自 Thermo Fisher 公司 ;高保真聚合酶
KOD plus 购自 TOYOBO 公司 ;dNTP 和限制性内切
酶 BamH I、Hind Ⅲ、Xba I 购自 TaKaRa 公司;2×Taq
Mix 购自康为世纪生物科技有限公司 ;T4 Ligase 购
自 Progema 公司 ;IPTG 购自北京普博欣生物科技有
限公司 ;其余常规生化试剂购自国药集团化学试剂
TCA cycle
α-KG Glutamate Glutamate
GAD
CytosolMitochondria
Succinate
SSADH GABA-T
NADH + H+ NAD+
SSA GABA GABA
α-KG :α-酮戊二酸 ;GAD :谷氨酸脱羧酶 ;GABA :γ-氨基丁酸 ;GABA-T :
γ-氨基丁酸转氨酶 ;SSA :琥珀酸半醛 ;SSADH :琥珀酸半醛脱氢酶
图 1 GABA 代谢途径示意图[10]
2015,31(7) 85王龙海等 :甜高粱琥珀酸半醛脱氢酶 SbSSADH基因克隆及原核表达
有限公司。
1.1.4 引物合成和测序 由北京诺赛基因组研究中
心公司完成。
1.2 方法
1.2.1 总 RNA 的 提 取 和 cDNA 第 1 链 的 合 成 取
100 mg 甜高粱新鲜叶片液氮中研磨后,采用 Trizol
法提取总 RNA[29]。按照 Thermo Fisher 公司的反转
录试剂盒进行反转录反应 ;总反应体系 20 μL。反应
体系及过程 :甜高粱总 RNA 5 μL,Oligo dT Primer 1
μL、dNTP 1 μL、RNase free ddH2O 5 μL,65℃ 处 理
5 min,冰上放置 2 min ;再向上述体系中依次加入 :
5×M-MLV Buffer 4 μL、RNase inhibitor 1 μL、dNTP
2 μL、M-MLV 1 μL,42℃处理 1 h,70℃处理 5 min。
反转录产物 -20℃保存备用。
1.2.2 全 长 基 因 的 获 得 根 据 从 MaizeGDB 和
Gramene 数据库获得的序列信息,以 Primer Premier
5.0 设 计 一 对 引 物 ssadh 1F 和 ssadh 1R。ssadh 1F :
5-ATGGCGATGGCGATGATGAC-3 ;ssadh 1R :
5-TCAACCCAAGTTTCCCATGC-3。以反转录产物为
模板,ssadh1F 和 ssadh 1R 引物扩增获得目的片段 ;
PCR 扩增条件 :94℃ 2 min ;94℃ 15 s,55℃ 30 s,
68℃ 2 min,35 个循环 ;68℃ 5 min。PCR 产物经电
泳回收 ;连接 pEASY-Blunt 载体,并命名为 SSADH-
Blunt 载体并测序。
1.2.3 表 达 载 体 引 物 设 计 及 SSADH 序 列 PCR 扩
增 根据获得 SSADH 基因序列,以信号肽预测网站
SignalP 4.1 Server(http ://www.cbs.dtu.dk/services/Sig
nalP/)预测 SSADH 基因信号肽,信号肽部分 198
bp。用 Primer Premier 5.0 设计一对原核表达载体引
物 PeSSADH 1F 和 PeSSADH 1R,该引物设计未带
信 号 肽。PeSSADH 1F :5-GGATCCGACGGGAAGA-
CCATCGAGGT-3 和 PeSSADH 1R 5-AAGCTTTCAA
CCCAAGTTTCCCATGC-3,下划线分别为 BamH Ⅰ
和 Hind Ⅲ酶切位点。以 SSADH-Blunt 质粒为模板,
用 引 物 PeSSADH 1F、PeSSADH 1R 扩 增 PeSSADH
基因片段。PCR 扩增条件 :94℃ 2 min ;94℃ 15 s,
56℃ 30 s,68℃ 2 min,35 个循环;68℃ 5 min。PCR
产物经 1% 琼脂糖凝胶电泳检测后回收目的片段。
1.2.4 原核表达载体 pET-28(a)-SSADH 的构建
用 BamH Ⅰ 和 Hind Ⅲ 双 酶 切 pET-28a vector 和
PeSSADH PCR 扩增产物 ;双酶切产物经回收后用
T4 连接酶 16℃连接过夜。将连接产物转化 TOP10
感受态。取 200 μL 转化菌液涂布于 Kan+ 浓度为 50
μg/mL 的 LB 固体培养基上并 37℃过夜培养。挑取
单菌落进行 PCR 检测及酶切验证。将验证正确的质
粒送测序对测序验证正确的重组质粒转化大肠杆菌
Rosetta,并鉴定阳性克隆。
1.2.5 目的蛋白表达、纯化 取验证正确的菌株
于 LB 液体培养基中培养,培养至 OD600=0.5 时加
入 IPTG(终浓度为 0.25 mmol/L)诱导表达 8 h。50
mL 体系培养菌液并收集表达菌株细胞,以 15 mL 的
PBS 缓冲液(含 2 mmol/L 的 PMSF)重悬。然后超
声破碎,离心收集上清液和沉淀。通过 Ni-NTA 柱纯
化目的蛋白。用考马斯亮蓝 G250 测蛋白浓度,-80℃
保存蛋白样品。
1.2.6 酶活的测定 参考 Hillel Fromm 等的酶活测
定方法,以琥珀酸半醛(SSA)和 NADP 为反应底
物, 以 100 mmol/L 的 焦 磷 酸 钾 和 100 mmol/L 的 β-
巯基乙醇为反应缓冲液。加入酶液测定其 10 min 内
A340nm 的吸光度值的变化,并根据吸光度值的变化
量计算酶活[26]。酶活计算公式 :units/mL enzyme=
(△A340nm Test-△A340nm Blank)×3/(6.22×0.1) 及
units/mg protein=(units/mL enzyme)/(mg protein/
mg enzyme)。
2 结果
2.1 甜高粱SSADH基因片段的获得
以甜高粱叶片 cDNA 为模板,利用引物 ssadh
1F 和 ssadh 1R PCR 扩增目的片段,PCR 产物大小
为 1.6 kb 左右,符合预期设计片段大小(图 1)。测
序结果显示,该片段大小 1 584 bp,编码 527 个氨
1500
bp
M 1 2
1000
M :DNA Marker ;1,2 :PeSSADH 基因电泳条带
图 1 PeSSADH PCR 产物电泳检查
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.786
基酸,同时分析发现,N 端有 66 个氨基酸是线粒体
信号肽序列。与其他物种 SSADH 基因的核酸序列比
对结果(图 2)表明,与玉米的 SSADH 基因相似性
为 90.76%-95.33%,与甘蔗的 SSADH 基因相似性为
97.6%,但是不同物种 SSADH 基因前端的信号肽序
列差异较大。
1
1
1
1
1
1
1
61
55
61
61
1
61
61
121
106
121
121
19
121
103
181
166
181
181
79
181
163
241
226
241
241
139
241
223
SORGHUM_BICOLOR_SSADH_CDS
SOLANUM LYCOPERSICUM SSADH
SACCHARUM OFFICINARUM SSADH
ZEA_MAYS__SSADH_1_CDS
ZEA_MAYS__SSADH_2_CDS
ZEA_MAYS__SSADH_3_CDS
ZEA_MAYS__SSADH_4_CDS
SORGHUM_BICOLOR_SSADH_CDS
SOLANUM LYCOPERSICUM SSADH
SACCHARUM OFFICINARUM SSADH
ZEA_MAYS__SSADH_1_CDS
ZEA_MAYS__SSADH_2_CDS
ZEA_MAYS__SSADH_3_CDS
ZEA_MAYS__SSADH_4_CDS
SORGHUM_BICOLOR_SSADH_CDS
SOLANUM LYCOPERSICUM SSADH
SACCHARUM OFFICINARUM SSADH
ZEA_MAYS__SSADH_1_CDS
ZEA_MAYS__SSADH_2_CDS
ZEA_MAYS__SSADH_3_CDS
ZEA_MAYS__SSADH_4_CDS
SORGHUM_BICOLOR_SSADH_CDS
SOLANUM LYCOPERSICUM SSADH
SACCHARUM OFFICINARUM SSADH
ZEA_MAYS__SSADH_1_CDS
ZEA_MAYS__SSADH_2_CDS
ZEA_MAYS__SSADH_3_CDS
ZEA_MAYS__SSADH_4_CDS
SORGHUM_BICOLOR_SSADH_CDS
SOLANUM LYCOPERSICUM SSADH
SACCHARUM OFFICINARUM SSADH
ZEA_MAYS__SSADH_1_CDS
ZEA_MAYS__SSADH_2_CDS
ZEA_MAYS__SSADH_3_CDS
ZEA_MAYS__SSADH_4_CDS
SORGHUM_BICOLOR_SSADH_CDS
SOLANUM LYCOPERSICUM SSADH
SACCHARUM OFFICINARUM SSADH
ZEA_MAYS__SSADH_1_CDS
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ZEA_MAYS__SSADH_4_CDS
SORGHUM_BICOLOR_SSADH_CDS
SOLANUM LYCOPERSICUM SSADH
SACCHARUM OFFICINARUM SSADH
ZEA_MAYS__SSADH_1_CDS
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ZEA_MAYS__SSADH_3_CDS
ZEA_MAYS__SSADH_4_CDS
SORGHUM_BICOLOR_SSADH_CDS
SOLANUM LYCOPERSICUM SSADH
SACCHARUM OFFICINARUM SSADH
ZEA_MAYS__SSADH_1_CDS
ZEA_MAYS__SSADH_2_CDS
ZEA_MAYS__SSADH_3_CDS
ZEA_MAYS__SSADH_4_CDS
301
286
301
301
199
301
283
361
346
361
361
259
361
343
421
406
421
421
319
421
403
参比序列 :高粱 SSADH 序列、番茄 SSADH 序列、甘蔗 SSADH 序列、玉米 SSADH 的 4 个同源序列
图 2 高粱 SSADH 基因 cDNA 序列与其他物种序列的比对结果
2015,31(7) 87王龙海等 :甜高粱琥珀酸半醛脱氢酶 SbSSADH基因克隆及原核表达
2.2 重组表达载体pET-28a-SSADH的构建及鉴定
当以全长基因构建至 pET-28a 时,未诱导出目
的蛋白;后将去除信号肽的 SbSSADH 基因(1 386 bp)
连接至原核表达载体 pET-28a,构建得到重组表达
载体 pET-28a-SSADH,质粒鉴定结果(图 3)显示,
重组质粒用 BamH Ⅰ和 Hind Ⅲ双酶切鉴定,1% 琼
脂糖凝胶电泳显示可以得到 1.4 kb 片段。
2.4 甜高粱SSADH蛋白的纯化
原核表达的蛋白融合了 6 个组氨酸标签 His6,
采用 Ni-NTA 柱亲和层析方法纯化可溶性蛋白中的
目标蛋白,经 SDS-PAGE 检测。如图 4 所示,经不
同的咪唑洗脱后,在 60 mmol/L 和 100 mmol/L 可以
获得洗脱的纯化蛋白,SDS-PAGE 结果(图 5)显示,
纯化的蛋白约在 50 kD 处,与理论值 49.1 kD 基本相
符。利用考马斯亮蓝 G250 法测定表达的可溶性蛋
白和纯化蛋白的浓度,分别为 9.628 mg/mL 和 1.972
mg/mL。
1500
bp
M M1 2 3 4
1000
1 :BamH Ⅰ单酶切 ;2 :Xba I 单酶切 ;M :DNA Marker ;3,4 :BamH Ⅰ、
Hind Ⅲ双酶切
图 3 重组质粒酶切鉴定图
2.3 SSADH蛋白的诱导表达
将 重 组 质 粒 pET-28a-SSADH 转 化 表 达 菌 株
Rosetta, 经 IPTG 诱 导 目 的 蛋 白 表 达。 分 别 选 取
IPTG 浓度为 0.25、0.5、0.75 和 1 mmol/L 四个梯度,
诱导时间 4、8、16 和 24 h 四个时间点,SDS-PAGE
检测目的蛋白的表达,结果(图 4)显示,在 0.5
mmol/L 的 IPTG 浓度、24℃诱导 8 h 的条件下目的蛋
白表达达到峰值。
70
kD
M 1 2 3 4
50
M :蛋白质 Marker ;1-4 :IPTG 的浓度分别是 0.25、0.5、0.75 和 1 mmol/L,
诱导 8 h 后蛋白原核表达情况(图中箭头指示的是目的蛋白条带)
图 4 不同浓度 IPTG 诱导 SSADH 的表达情况
M 1 2 3 4 5 6
M :蛋白质 Marker ;1 :全菌破碎液 :;2 :破碎液上清 ;3 :流穿液 ;4 :40
mmol/L 咪唑洗脱液 ;5 :60 mmol/L 咪唑洗脱液 ;6 :100 mmol/L 咪唑洗脱液
图 5 SDS-PAGE 检测 SSADH 蛋白的表达及纯化情况
2.5 SSADH蛋白的酶活鉴定
检测可溶性总蛋白和纯化蛋白的酶活,可溶性
总蛋白和纯化蛋白均检测到琥珀酸半醛脱氢酶的活
性,通过计算可以看出可溶性总蛋白的酶活是 0.122
U/mL,根据蛋白浓度计算,酶活为 0.013 3 U/mg 蛋
白 ;纯化蛋白的酶活是 0.083 U/mL,与纯化蛋白的
浓度相除,得到酶活为 0.042 U/mg 蛋白,为了进一
步检测测量酶活的准确性,加入酶抑制剂 AMP 和
ATP 后琥珀酸半醛脱氢酶的酶活被完全抑制(图
6),进一步证明了纯化蛋白具有琥珀酸半醛脱氢酶
的活性。
3 讨论
GABA 途径是 TCA 循环的一个重要支路,与动
植物的生长发育密切相关。SSADH 是其中的一个关
键酶,催化琥珀酸半醛 SSA 形成琥珀酸并进入 TCA
循环。在动植物中,一旦缺乏 SSADH 会对生长发育
造成很大的影响,研究表明,在小鼠中缺乏 SSADH
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.788
导致产生氧化应激、线粒体病变、低谷胱甘肽水平;
而人缺乏 SSADH 导致智力发育障碍、语言能力低
下、癫痫、共济失调、睡眠障碍、精神紊乱[30-37]。
目前,研究植物 GABA 代谢途径与植物抗逆的关系
主要集中在谷氨酸脱羧酶 GAD 和 γ-氨基丁酸转氨
酶 GABA-T,而对于 SSADH 与植物抗逆的研究还处
于较为基础的阶段。目前关于 SSADH 的研究较多的
是拟南芥 ;研究表明拟南芥的 SSADH 基因的 T-DNA
插入突变体表现为植株矮小、叶片坏死、叶面积指
数下降且对热胁迫和 UV-B 敏感[10,12,15]。关于甜高
粱 SbSSADH 基因的研究以及功能解析还未见报道。
本研究从甜高粱品种 Keller 中克隆得到 SSADH
基因,序列比对分析表明甜高粱 SbSSADH 基因与拟
南芥、甘蔗、水稻和玉米等基因序列相似度达 80%-
95%,而截掉信号肽的部分的相似度高达 95%,仅有
个别碱基的差异,说明 SSADH 基因在高等植物中还
是比较保守的。有文献[4]报道,真核生物蛋白在原
核系统中表达时,由于信号肽的存在容易导致原核
表达蛋白的失败,所以本实验选择表达的蛋白是去
掉信号肽。前期研究表明 SSADH 蛋白在线粒体中发
挥功能,我们根据蛋白结构预测 SSADH 蛋白的亚
细胞定位信号也表明在线粒体中。我们分析了几种
植物的信号肽序列,信号肽序列表现出了物种特异
性 :在单子叶植物中,包括玉米、高粱、甘蔗等的
信号肽部分(G+C)的含量达到 72.8%,而双子叶植
物包括番茄、烟草信号肽部分(G+C)的含量仅有
46.5%,明显低于单子叶植物,这种特殊的高(G+C)
含量的结构是否与基因功能的发挥有一定的联系,
目前还无相关的研究报道,有待进一步的深入研究。
4 结论
本研究表达获得的可溶性总蛋白和纯化后的蛋
白均表现出琥珀酸半醛脱氢酶的活性,并且纯化后
的蛋白活性有大幅度的提高,加入 AMP 和 ATP 酶
抑制剂后酶活完全被抑制,这与此前关于这一酶类
的报道相吻合。
参 考 文 献
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(γ-hydroxybutyric aciduria)[J]. Journal of Pharmacology and
0.5
0.4
0.3
0.2AB
S
0.1
0
-0.1
0 2 4
时间/min
6 8 10
ABS Blank
ABS crude protein
ABS pure protein
ABS pure protein+ATP
ABS pure protein+AMP
图 6 重组 SSADH 蛋白酶反应动力学
2015,31(7) 89王龙海等 :甜高粱琥珀酸半醛脱氢酶 SbSSADH基因克隆及原核表达
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(责任编辑 马鑫)