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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第8期
八角（Illicium verum Hook. f.）是我国南方重要
经济林木之一，其干果和茴油为我国传统的出口产
品。同时，八角中的莽草酸是制造抗病毒药物奥司
他韦的合成原料之一，特别用于流感的防治，2009
年的 H1N1 新流感及 2013 年 H7N9 流感亦使用奥司
他韦作治疗［1］。中国八角干果 90% 来自广西和云
南，截至 2011 年底，全国八角干果年产量 13.32 万 t，
而广西、云南产量总和占全国总产量的 93.62%［2］。
因而，发展八角产业，对推动西部暖湿山区农民致富，
收稿日期 ：2013-11-15
基金项目 ：云南省“十一五”科技攻关项目（2006NG26），云南省自然科学基金项目（2010ZC234）
作者简介 ：冯丹，女，硕士，研究实习员，研究方向 ：林木遗传育种 ；E-mail ：fengdan1220@hotmail.com
通讯作者 ：陈海云，女，副研究员，研究方向 ：经济林良种选育及栽培 ；E-mail ：kmchenhy@163.com
吴涛，男，博士，助理研究员，研究方向 ：林木遗传育种 ；E-mail ：ynafwt@126.com
正交试验优化八角 ISSR-PCR 反应体系
冯丹1，2 宁德鲁1 陈少瑜1，2 李勇杰1 张艳丽1 吴涛1，2 陈海云1
（1. 云南省林业科学院，昆明 650201 ；2. 云南省森林植物培育与开发利用重点试验室 国家林业局云南珍稀濒特森林植物保护和繁育
重点试验室，昆明 650201）
摘 要 ： 利用正交试验设计研究 Taq DNA 聚合酶、DNA 模板、引物（UBC 886）、dNTP、Mg2+ 浓度 5 个因素对云南八角
ISSR-PCR 反应的影响，建立其最佳反应体系。结果表明 ：25 μL 的反应体系中 5 个因子的最佳水平为 ：Mg2+ 3 mmol/L、Taq DNA
聚合酶 0.5 U、DNA 模板 0.016 ng、引物 0.8 μmol/L、dNTPs 0.2 mmol/L。PCR 最佳反应程序为 ：94℃预变性 5 min ；94℃变性 30 s，
46℃退火 45 s，72℃延伸 1 min，40 次循环 ；72℃最后延伸 7 min，4℃保存。
关键词 ： 八角 ISSR-PCR 反应 正交设计 体系优化
Optimization of ISSR-PCR Reaction System of Anise（Illicium verum
Hook. f.）Based on Orthogonal Design
Feng Dan1，2 Ning Delu1 Chen Shaoyu1，2 Li Yongjie1 Zhang Yanli1 Wu Tao1，2 Chen Haiyun1
（1. Yunnan Academy of Forestry，Kunming 650201 ；2. Yunnan Provincial Key Laboratory of Cultivation and Exploitation of Forest
Plants，Yunnan Laboratory for Conservation of Rare，Endangered & Endemic Forest Plants，Public Key Laboratory of the State Forestry
Administration，Kunming 650201）
Abstract: Based on orthogonal design experiments, five main factors in ISSR-PCR amplification system, including Mg2+ concentration,
Taq DNA polymerase, DNA template, primer（UBC 868）and dNTPs, were studied to optimize the system for Illicium verum Hook. f.. The
results showed that the optimized system was a total volume of 25 μL containing 3 mmol/L Mg2+, 0.5 U Taq DNA polymerase, 0.016 ng DNA
template, 0.8 μmol/L primer and 0.2 mmol/L dNTPs. The optimal amplified procedure was started with predegeneration at 94℃ for 5 minutes,
followed by 40 cycles of 30 seconds for denaturalization at 94℃, 45 seconds of annealing at 46℃, 60 seconds of extension at 72℃ ；7 minutes of
extension at 72℃ and indefinitely remain at 4℃.
Key words: Illicium verum Hook. f. ISSR-PCR Orthogonal design Reaction system
改善生态环境具有重要意义。云南八角种质资源极
为丰富，实生群体分布广泛，在早实、丰产、质优、
抗性好的果实品质等方面具有丰富的多样性。这些
丰富的种质资源不仅是新品种选育的物质基础，同
时也是八角产业可持续发展的物质基础。科学合理
地保护开发和利用这些丰富的种质资源，对八角产
业的可持续发展具有重要的意义。
我国学者已从形态特征及分布、良种选育、栽
培管理和病虫害防治等方面对八角做了大量研究工
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第8期66
作［3-5］，利用分子生物技术对八角展开研究是近一
年来才开始的，且仅限于用 AFLP［6］和 RAPD［7］进
行八角遗传多样性分析。简单重复序列间区标记
（ISSR）是一种在 PCR 中直接使用微卫星序列进行
DNA 扩增的分子标记技术［8］。由于 ISSR 技术具备
操作简单、快速、高效、重复性好、耗资低等特点，
近年来被广泛应用于植物的遗传连锁图谱构建、种
质资源鉴定、基因鉴定和植物分类等各方面工作［9］。
但是，对于不同的物种，反应体系的各因子的浓度
将影响扩增结果。基于此，本试验选择云南省不同
地区的八角作为试验材料，采用正交设计对反应体
系中 Mg2+ 浓度、Taq DNA 聚合酶、DNA 模板、引物
和 dNTPs 等 5 个因子进行试验和分析，旨在摸索出
一个适合八角 ISSR-PCR 反应的最佳体系，为八角
今后相关的分子遗传分析工作奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
试验材料来源于云南省文山州麻栗坡县、广南
县和富宁县 3 个居群。DNA 提取参照陈海云［10］的
方法。用微量紫外分光光度计和 0.8% 的琼脂糖凝
胶电泳对所提取的 DNA 进行检测，根据 DNA 模板
浓度梯度稀释结果［11］，DNA 模板浓度调至 2×10-3
ng/μL。随机从以上 4 个居群中分别取出两个单株，
等量混合后作为 ISSR-PCR 反应的 DNA 模板。
Taq DNA 聚合酶、MgCl2 等试剂购自天根生化
科技（北京）有限公司。引物参照加拿大哥伦比亚
大学（UBC）公布的 ISSR 引物序列，由上海生工生
物工程技术服务有限公司合成。经引物初步筛选，
选择有扩增产物但效果欠佳的 UBC886（3-VDVCT-
CTCTCTCTCTCT-5）作为 ISSR-PCR 体系优化引物。
1.2 方法
1.2.1 ISSR-PCR 体 系 的 正 交 设 计 本 试 验 采 用 5
因 素 4 水 平 正 交 试 验 设 计［12］，Taq DNA 聚 合 酶、
Mg2+、dNTPs、引物和 DNA 模板的各浓度梯度，见
表 1，正交试验共 25 个反应体系（表 2）。反应总
体积为 25 μL，各体系中均加入 2.5 μL 的 10×PCR
buffer，其他各因素按表 2 加样，用 ddH2O 补足 25
μL，用 20 μL 灭菌矿物油覆盖。
反应在 Bio Rad C1000 Touch PCR 基因扩增仪上
进行。PCR 扩增反应的程序为 ：94℃预变性 5 min ；
94℃变性 30 s，46℃退火 45 s，72℃延伸 1 min，循
环 40 次 ；72℃延伸 7 min，12℃保存。
1.2.2 反应体系和扩增程序稳定性检测 扩增产
物用 2% 的琼脂糖凝胶电泳检测。电泳缓冲液为
0.5×TBE，将扩增产物与溴酚蓝指示剂按照 6∶1 混
合后取 10 μL 加入点样孔，以 5 μL 的 D2000（天根）
为 Marker，120 V 恒压电泳 90 min，用 Gene Genius
Bio 凝胶成像系统拍照分析。用 3 个不同种源的 12
个云南八角单株检测最佳反应体系和程序的稳定性。
1.2.3 数据处理 根据电泳图为每个处理中的可识
别条带赋值，将有条带记为“1”，无条带记为“0”，
采用 SPSS19.0 进行极差分析和方差分析，同时参考
条带的亮度和背景清晰度进行判断，选出最佳体系。
2 结果
2.1 正交试验分析
2.1.1 正交试验扩增的电泳图谱直观分析 八角
ISSR-PCR 正交试验电泳图如图 1 所示，由于不同
处理间 Mg2+、Taq DNA 聚合酶、DNA 模板、引物和
dNTPs 浓度不同，ISSR-PCR 的扩增结果也有明显的
差异。处理组合 2、4、17、18 和 24 扩增条带明亮，
背景较为清晰。其中处理组合 2（A3B3C1D1E4）和
4（A3B1C4D4E1）的扩增主带明亮，背景清晰，表
明这两个处理在八角 ISSR-PCR 反应体系的正交试
验设计中效果最佳。
2.1.2 正交试验数据分析 根据电泳图为每个处理
表 1 正交试验的因素及水平
水平
因素
Mg2+（mmol/L） Taq DNA 聚合酶（U） DNA 模板（ng） 引物（μmol/L） dNTPs（mmol/L）
1 1 0.5 0.004 0.2 0.2
2 2 1 0.008 0.4 0.4
3 3 1.5 0.012 0.6 0.6
4 4 2 0.016 0.8 0.8
2014年第8期 67冯丹等 ：正交试验优化八角 ISSR-PCR 反应体系
中的可识别条带赋值（表 2），将有条带记为“1”，
无条带记为“0”，然后对正交试验进行极差分析，
结果见表 3。极差分析中，Ki（i= 1，2，3 和 4）代
表各因素同一水平下的条带数之和，R 表示同一因
素不同水平间的极差值。极差值反映了每个因素
对 ISSR-PCR 反应的影响程度，R 值越大，说明该
因素对试验结果影响越大。从极差 R 值可以看出，
dNTPs 和 DNA 模板对八角 ISSR-PCR 反应的影响最
大，极差值为 25 ；其次是引物，极差值为 18 ；Mg2+
和 Taq DNA 聚合酶的极差值均小于空白组的极差值，
分别为 16 和 17。各因素的主效应对八角 ISSR-PCR
反应影响的顺序为 ：dNTPs>DNA 模板 > 引物 >Taq
DNA 聚合酶 >Mg2+ 浓度。
为进一步确定各因素对八角 ISSR-PCR 反应正
交试验的影响，本试验利用 SPSS19.0 进行了方差分
析和多重比较。结果（表 4）表明，Mg2+ 浓度和引
表 2 ISSR-PCR 反应因素水平的 L25（45）正交试验设计
体系
水平
A（Mg2+） B（Taq DNA 聚合酶） C（DNA 模板） D（引物） E（dNTPs） 空白 条带
1 4 4 2 1 3 3 7
2 3 3 1 1 4 4 7
3 1 3 3 4 3 1 0
4 3 1 4 4 1 4 7
5 1 1 1 1 1 1 1
6 1 3 2 3 1 1 4
7 1 1 4 1 2 1 0
8 2 3 1 2 2 4 4
9 4 2 1 4 4 1 6
10 2 1 1 1 3 1 3
11 3 4 3 2 1 1 6
12 4 1 1 2 1 1 4
13 1 2 1 3 1 4 3
14 1 4 1 4 2 2 3
15 3 2 2 1 2 1 4
16 2 1 2 4 1 3 6
17 2 4 4 3 4 1 6
18 3 1 1 3 3 2 6
19 1 1 2 2 4 2 0
20 4 3 4 1 1 2 4
21 1 1 3 1 4 4 0
22 1 4 1 1 1 3 3
23 1 2 4 2 3 3 0
24 4 1 3 3 2 3 6
25 2 2 3 1 1 2 3
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
M 17 18 19 20 21 22 23 24 25
11 12 13 14 15 16 M
2000
bp
1000
750
500
250
100
2000
bp
1000
750
500
250
100
M ：DNA Marker ；1-25 ：L25（45）正交试验设的 25 个处理
图 1 L25（45）正交试验设的 PCR 产物电泳结果
物对试验结果的影响达到显著水平（P<0.05），而
DNA 模板、Taq DNA 聚合酶和 dNTPs 对试验结果的
影响未达到显著水平（P>0.05）。多重比较结果表明，
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第8期68
Mg2+ 浓度在水平 1 时，扩增条带少且背景模糊，与
其他 3 个水平间存在显著差异，当 Mg2+ 浓度达到 2-4
mmol/L 之间时，扩增条带较多，其中 Mg2+ 浓度在 3
mmol/L 时，扩增条带明亮，背景清晰 ；引物浓度在
0.6-0.8 μmol/L 范围内时，扩增条带最多，结合主带
亮度和背景清晰度等方面考虑，引物的最适浓度为
0.8 μmol/L ；Taq DNA 聚合酶在 1.5-2.0 U 时对正交
试验结果影响显著，但是结合极差分析中各因素对
正交试验结果影响的排序，Taq DNA 聚合酶的最适
浓度为 0.5 U。综上所述，在 25 μL 的八角 ISSR-PCR
体系中，5 个因素的最佳组合为 A3B1C4D4E1，即
Mg2+ 浓 度 3 mmol/L、Taq DNA 聚 合 酶 0.5 U、DNA
模板 0.016 ng、引物 0.8 μmol/L 和 dNTPs 0.2 mmol/L。
2.2 ISSR-PCR系统稳定性检测
根据正交试验和方差分析得到最佳优化体系
（A3B1C4D4E1），随机选择 12 个八角单株（每个居
表 4 正交试验方差分析
因素 均方 df F Sig.
多重比较
1 2 3 4
Mg2+ 32.08 3 29.95 0.000* \ 0.000* 0.000* 0.000*
0.000* \ 0.037* 0.161
0.000* 0.037* \ 0.383
0.000* 0.161 0.383 Taq DNA 聚合酶 3.78 3 3.529 0.062 \ 0.864 0.401 0.015*
0.864 \ 0.383 0.022*
0.401 0.383 \ 0.100
0.015* 0.022* 0.100 模板 1.68 3 1.568 0.264 \ 0.732 0.112 0.317
0.732 \ 0.100 0.253
0.112 0.100 \ 0.556
0.317 0.253 0.556 引物 5.813 3 5.427 0.021* \ 0.498 0.011* 0.063
0.498 \ 0.008* 0.037*
0.011* 0.008* \ 0.383
0.063 0.037* 0.383 dNTPs 1.113 3 1.039 0.421 \ 0.248 0.147 0.609
0.248 \ 0.767 0.556
0.147 0.767 \ 0.383
0.609 0.556 0.383 群各 4 株）进行扩增，以便进一步检测该反应体系
的稳定性。结果（图 2）表明，12 个单株均能获得清
晰、多态性高、重复性好的条带，表明本试验正交
设计优化八角 ISSR-PCR 反应体系稳定可靠。
3 讨论
目前，八角分子标记和基因序列方面的研究
仅限于潘晓芳等［6］对八角属 8 个种和八角 47 个品
种（类型）进行的 AFLP 遗传多样性分析，陈海云
等［7］ 基于 RAPD 技术对云南 23 个八角优良无性
系进行的遗传多样性分析，刘文倩等［14］用核糖体
DNA 内转录间隔区（ITS）序列对披针叶八角（I.
laceolatum）进行的聚类分析。本研究初始根据已报
道的八角属的地枫皮（I. difengpi）［15］和黄花八角（I.
parviflorum）［16］ISSR 反 应 体 系 建 立 八 角 ISSR-PCR
表 3 正交试验极差分析
因素
水平
R
K1 K2 K3 K4
Mg2+ 14 22 30 27 16
Taq DNA 聚合酶 33 16 19 25 17
模板 40 21 15 18 25
引物 32 14 25 22 18
dNTPs 41 17 16 19 25
空白 34 16 22 21 18
2014年第8期 69冯丹等 ：正交试验优化八角 ISSR-PCR 反应体系
试验体系时，未能得到理想的扩增结果，先通过单
因素试验［11］获知八角 DNA 模板用量远低于普通
ISSR-PCR 反应体系时方能得到较为满意的结果。在
此基础上，进一步通过正交试验设计获得了理想的
扩增结果。
由于 ISSR-PCR 分子标记技术的扩增结果受引
物、Taq DNA 聚合酶、Mg2+ 浓度和 dNTPs 浓度等多
种因素的影响，且各因素间又可能存在互作效应，
因此确定最适八角 ISSR-PCR 体系就显得尤为必要。
前人研究表明，DNA 模板为 102-105 拷贝数时有利
于 ISSR-PCR 试验［13］，所以，当本试验正交优化设
计最终选用 0.016 ng 的 DNA 模板时，ISSR-PCR 反
应取得了较好的扩增效果。为获得重复性好、可靠
性高的扩增谱带，本试验还通过正交试验对影响八
角 ISSR-PCR 反 应 的 其 他 4 个 因 素 Mg2+ 浓 度、Taq
DNA 聚合酶、引物和 dNTPs 在 4 个不同的浓度水平
上进行了优化。Mg2+ 和 dNTPs 是 Taq DNA 聚合酶活
性所必需的因素，两者之间能相互结合形成复合物，
dNTPs 浓度过低会降低 PCR 产物的产量，过高会造
成浪费，且会降低 Mg2+ 的有效浓度［13］。此外，引
物浓度和 Taq DNA 聚合酶浓度也是 PCR 特异性反应
的关键，二者浓度过高可能产生非特异性扩增产物，
而浓度过低则会影响扩增效果。总之，Mg2+ 浓度、
Taq DNA 聚合酶、DNA 模板、引物和 dNTPs 各因素
对 PCR 反应的影响既独立又互补。因此，今后在设
计正交试验时，不但应兼顾各因素主效应，同时还
应该考虑各因素间可能存在的交互作用，以便获得
条带明亮、背景清晰、可靠性高的扩增图谱。
4 结论
通过直观、极差、方差和多重比较，最终确定
了处理 4，即 Mg2+ 浓度 3 mmol/L、Taq DNA 聚合酶 0.5
2000
bp
1000
750
500
250
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 MMM
图 2 3 个居群 12 个单株样本的 ISSR-PCR 扩增结果
U、DNA 模板 0.016 ng、引物 0.8 μmol/L 和 dNTPs 0.2
mmol/L 为最佳的水平组合。
参 考 文 献
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（责任编辑 狄艳红）