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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(11):236-242
尼古丁是一类广泛存在于土豆、番茄和烟草等
茄科植物中的天然生物碱［1］，尼古丁对哺乳动物能
产生多种致病、致变、致癌效应，且易溶于水，会
污染土壤及水环境［2-4］。利用微生物来代谢尼古丁，
是治理尼古丁污染的一种有效方法。
恶臭假单胞菌 S16 是一株尼古丁高效降解菌［5］，
其利用吡咯途径代谢尼古丁［6］：尼古丁经由 N-甲基
麦斯明、假氧化尼古丁、3- 琥珀酰吡啶、6- 羟基 -3-
琥珀酰吡啶（6-Hydroxy-3-succinoyl-pyridine，HSP）、
2，5- 二 羟 基 吡 啶（2，5-Dihydroxy-pyridine，DHP）、
N-甲酰马来酰胺酸、马来酰胺酸、马来酸及富马酸，
最终进入三羧酸循环［7，8］。
2011 年， 单 加 氧 酶 HspB 及 其 编 码 基 因 hspB
被发现，其负责催化 HSP 转化成 DHP［9］。HspB 以
FAD（黄素腺嘌呤二核苷酸、氧化态）为辅基，以
NADH（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，还原态）为辅酶，
收稿日期 ：2015-03-02
基金项目 ：国家自然科学基金项目（31230002，31470223）
作者简介 ：邬志杰，男，硕士，研究方向 ：结构生物学 ；E-mail ：tankray@sjtu.edu.cn
通讯作者 ：吴更，男，博士，教授，研究方向 ：结构生物学 ；E-mail ：geng.wu@sjtu.edu.cn
恶臭假单胞菌 HspB 的单晶培养及结晶条件优化
邬志杰  吴更  唐鸿志  许平
（上海交通大学生命科学技术学院 微生物代谢国家重点实验室，上海 200240）
摘 要 ： 为了获得可用于 X 射线衍射的恶臭假单胞菌尼古丁代谢途径中关键单加氧酶 HspB 的单晶。定点突变 PCR 构建重
组质粒，大肠杆菌中诱导表达，镍柱亲和层析、烟草蚀纹病毒（Tobacco etch virus，TEV）蛋白酶酶切和凝胶过滤层析纯化，悬滴
扩散法进行结晶。成功构建重组质粒并获得高表达 ；比较了 TEV 蛋白酶柱上及透析酶切的效率，TEV 蛋白酶透析酶切效率更高 ；
确定了该纯化路线，获得电泳纯级的 HspB 蛋白。结晶条件初筛和正交优化后获得可培养 HspB 蛋白单晶的条件为 22% PEG3350、
0.1 mol/L Bis-Tris pH6.5、0.21 mol/L MgCl2、18℃、150 比例加晶种。去除标签后的 HspB 蛋白获得了分辨率 1.8 Å 的单晶。
关键词 ： 恶臭假单胞菌 ；尼古丁代谢 ；单加氧酶 ；定点突变 ；结晶
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.11.031
Monocrystal Culture and Crystallization Conditions Optimization of
HspB from Pseudomonas putida
Wu Zhijie Wu Geng Tang Hongzhi Xu Ping
（State Key Laboratory of Microbial Metabolism，School of Life Science & Biotechnology，Shanghai Jiao Tong University，Shanghai 200240）
Abstract: It was to obtain the monocrystal of HspB, the key monooxygenase in the nicotine degradation pathway from Pseudomonas
putida, for X-ray diffraction. The expression plasmid was constructed by site-directed mutagenesis PCR and was expressed in Escherichia coli.
Target protein was purified with immobilized metal-chelating affinity chromatography, TEV protease digestion and gel filtration chromatography.
Crystal culture though hanging-drop vapor-diffusion method. The recombinant plasmid was successfully constructed and expressed high.
Compared to digestion on the column, digestion in the solution during dialysis is more efficient, and the purification strategy was determined
to obtain HspB with high purity. The optimal crystallization condition was identified as 22% PEG3350, 0.1 mol/L Bis-Tris pH6.5, 0.21 mol/L
MgCl2, 18℃, seeding after orthogonal experiments. HspB with His-tag cleavaged can obtain a monocrystal which resolution reaches 1.8 Å.
Key words: Pseudomonas putida ；nicotine degradation ；monooxygenase ；site-directed mutagenesis ；crystallization
2015,31(11) 237邬志杰等 ：恶臭假单胞菌 HspB 的单晶培养及结晶条件优化
其催化底物发生羟化机制也已经明确［10］。HspB 在
整个尼古丁代谢途径中十分关键，将 hspB 基因缺失
后，P. putida S16 无法进行尼古丁代谢。因此，获
得 HspB 的结构对于研究其结构与功能的关系十分
有利。
通过基因工程构建重组质粒，在大肠杆菌中表
达外源蛋白，获得高纯度的蛋白得到单晶，并用于
X 射线衍射，这是晶体衍射学常用的方法［11］。而前
NHO
CCH2CH2COOH
+ 2 NADH + 2 H+ + O2 2 NAD
+ + 2 H CCH2CH2COH
O
2
N
+
HO
HspB
OH
2
O O
图 1 HspB 催化底物发生羟化机制
期研究也表明，可以通过大肠杆菌表达纯化得到可
溶性的带有 His 标签的 HspB 蛋白。然而其晶体的培
养却十分困难［12］。虽然 His 标签对于蛋白结构影响
较小［13］，但也有文献报道切除 His 标签可能会有利
于晶体的培养，值得尝试［14，15］，同时亦有许多蛋白
结构是通过切除 His 标签的蛋白获得的［16-18］。
本研究在前期构建的表达质粒的基础上［12］，通
过突变 PCR 定点引入 TEV 蛋白酶酶切序列，从而
实现了其重组蛋白产物能够被 TEV 蛋白酶切割，达
到去除 His 标签的目的，并利用该蛋白进行结晶研
究。旨为后续获得该蛋白结构，阐释其功能和结构
间的联系奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 质粒和菌种 表达质粒 pET28a-hspB（抽提自
大肠杆菌 DH5α），大肠杆菌 DH5α 和大肠杆菌 BL21
（DE3）均为本实验室保存。
1.1.2 主 要 试 剂 FastPfu 聚 合 酶 购 自 全 式 金 公
司，Dpn I 购自 NEB 公司，TEV 蛋白酶（带有 N 端
6×His 标签）为本实验自制，酶质粒小抽试剂盒购
自 Qiagen 公司，实验所用结晶试剂盒购自 Hampton
Research、EMBio、Jena Bioscience、Molecular
Dimension 等。其他常用试剂均为国产分析纯。
1.1.3 主要仪器 PCR 仪（EDC 810）购自东胜公司，
细胞破碎仪购自广州聚能，Ni2+-NTA 填充柱料购自
Qiagen 公司，水平与垂直电泳仪和凝胶成像仪均购
自上海天能，ÄKTA prime Plus 购自 GE，紫外分光
光度计（UV-1800）购自上海美谱达。
1.2 方法
1.2.1 引物设计、突变 PCR 及产物鉴定 为实现在↓৽ੁケਈᕅ⢙ ケਈPCR䖜ॆDH5αDpn I⎸ॆᕅ⢙䜘࠶ᒿࡇӂ㺕ᖒᡀ㕪࡫䍘㋂pET28a-hspB-TEV-Hisケਈ䍘㋂pET28a-hspB-TEV-His㕪࡫䍘㋂pET28a-hspB-TEV-His㕪࡫䍘㋂
pET28a-hspB⁑ᶯ䍘㋂ ৫䲔ਜ਼⭢สॆGATCⲴ⁑ᶯ䍘㋂؞༽㕪ਓˈ㧧ᗇ䟽㓴䍘㋂
图 2 重组质粒 pET28a-hspB-TEV-His 构建示意图
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.11238
重组 HspB 蛋白 C 端和 6×His 标签之间加入 TEV 蛋
白酶酶切识别序列（Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly）。
本研究以表达质粒 pET28a-hspB 为模板，并由此设
计 正 反 向 突 变 引 物。P1 ：5-GAAAACCTGTATTTT-
CAGGGCCACCACCACCACCACCAC-3’；P2 ：5-GC-
CCTGAAAATACAGGTTTTCCTCGAGAAAGGTTTCC-
AT-3。引物的 5 端是 TEV 蛋白酶酶切识别序列对
应的核苷酸碱基序列（下划线部分），3 端则是模板
序列（P1 的 3 端是 6×His 标签的核苷酸碱基序列 ；
P2 的 3 端是 hspB 基因 3 端序列（GenBank 登录号
GQ857548.1）。由生工生物工程（上海）有限公司
合成引物。突变 PCR 反应体系 ：FastPfu 聚合酶 0.5
μL，5×FastPfu Buffer 5 μL，5×stimulant 5 μL，2.5
mmo/L dNTP 1.5 μL，模板质粒 0.5 μL，上下游引物 0.5
μL，以 ddH2O 补至 25 μL。反应条件 ：94℃ 5 min ；
94℃ 15 s，55℃ 15 s，72℃ 3 min，25 个循环 ；72℃
10 min。产物鉴定 ：1.0% 琼脂糖凝胶电泳检测。
1.2.2 重组质粒 pET28a-hspB-TEV-His 的构建 向
20 μL PCR 产物中加入 1 μL Dpn I 进行消化，37℃，
2 h。将处理后的 PCR 产物直接转化 E. coli DH5α 感
受态细胞，筛选阳性克隆。提取质粒送上海美吉生
物医药科技有限公司测序。经 Blast 比对，测序结果
正确的质粒命名为 pET28a-hspB-TEV-His。
1.2.3 HspB 蛋 白 的 诱 导 表 达 将 pET28a-HspB-
TEV-His 转化 E. coli BL21（DE3）感受态细胞，于
卡那霉素抗性平板上筛选阳性菌落。取阳性单菌落
接种于 50 mL 液体 LB 培养基中，加入终浓度为 50
mg/mL 的卡那霉素，37℃，220 r/min 培养过夜，作
为种子液。以 1100 的接种量接种到 1 L 液体 LB
培养基中，加入终浓度为 50 mg/mL 的卡那霉素，
37℃，220 r/min 培养至 OD600 为 0.8，加入终浓度为
0.2 mmol/L 的异丙基硫代半乳糖苷（IPTG），16℃，
180 r/min 诱导过夜。4℃，4 200 r/min 离心收集菌体。
以 1 L 菌 对 应 20 mL 镍 柱 平 衡 液（25 mmol/L Tris
pH8.0，300 mmol/L NaCl，20 mmol/L 咪唑）的比例
重悬，并加入终浓度为 100 mg/L 的抑肽酶、亮抑酶
肽及 250 mg/L 的苯甲基磺酰氟，混匀。
1.2.4 镍柱亲和层析 菌液于 4℃进行细胞破碎
（1 300 bar，3 次）后，4℃，14 000 r/min 离心，去
上 清 过 镍 柱 两 遍。 镍 柱 漂 洗 液（25 mmol/L Tris
pH8.0，300 mmol/L NaCl，20 mmol/L 咪唑）漂洗柱
子 两 遍。 镍 柱 洗 脱 液（25 mmol/L Tris pH8.0，300
mmol/L NaCl，60 mmol/L、200 mmol/L 咪 唑 ）5 mL
洗脱目的蛋白。SDS-PAGE 分析。
1.2.5 TEV 蛋白酶酶切 按酶与蛋白 125 的质量
比加入 TEV 蛋白酶进行酶切。本研究中采用了两种
酶切方法。柱上酶切法 ：将蛋白上清挂柱后漂洗两
次，封闭柱子，然后加入 5 mL 镍柱漂洗液，按比例
加入 TEV 蛋白酶，混匀柱料，4℃过夜。收集漂洗
液。透析酶切法 ：在洗脱液中按比例加入 TEV 蛋白
酶，置于透析袋中，于 1 L 镍柱漂洗液（25 mmol/L
Tris pH8.0，300 mmol/L NaCl，20 mmol/L 咪唑）中 4℃
漩涡过夜。
1.2.6 镍柱除杂 在柱酶切法中直接收集酶切后
漂洗液即可 ；透析酶切法则需要将透析液流穿镍
柱，收集流出液及漂洗液。两种方法都需要用 500
mmol/L 咪唑洗脱液洗脱柱上没有酶切完全的蛋白和
TEV 酶，并进行 SDS-PAGE 检测。
1.2.7 凝 胶 过 滤 层 析 预 先 用 平 衡 缓 冲 液（25
mmol/L Tris pH8.0，300 mmol/L NaCl，2 mmol/L DTT，
1 mmol/L EDTA）平衡 Superdex200 HiLoad 16/600 凝
胶层析柱（流速 1.0 mL/min，压强上限 0.4 MPa）至
电导曲线平直。将收集的流出液及漂洗液注入 5 mL
上样环中。用一个柱体积（约 130 mL）的平衡缓
冲液洗脱并收集洗脱液。结合紫外吸收峰和 SDS-
PAGE 分析纯化效果。4℃，4 500 r/min 离心浓缩蛋
白溶液，Bradford 法测定蛋白浓度至 12 mg/mL，直
接进行点晶或使用液氮速冻，并于 -80℃保存。
1.2.8 SDS-PAGE 分析 采用 12% 分离胶和 5% 浓
缩胶制胶，电泳后使用考马斯亮蓝 R250 染色。
1.2.9 点晶 蛋白冰上解冻后，4℃，14 000 r/min
离心 5 min 后点晶。本实验采用悬滴扩散法进行结晶。
使用 48 孔（24 孔）结晶板，下槽孔中的结晶试剂
为 80 μL（160 μL）。在硅化玻片上依次滴加 1 μL 蛋
白溶液和 1 μL 结晶试剂，再将盖玻片反扣覆盖在池
孔上并用凡士林密封空隙。恒温静置培养。定期在
显微镜下观察晶体生长情况。
1.2.10 结晶条件优化 以 Index 2 试剂盒的第 83 个
条件为基础，对结晶条件做进一步优化。优化蛋白
浓度 ：尝试 13.5、12、9.5 和 7.5 mg/mL 浓度蛋白进
2015,31(11) 239邬志杰等 ：恶臭假单胞菌 HspB 的单晶培养及结晶条件优化
行点晶。设计正交实验对 pH、沉淀剂和盐离子浓度
进行优化 ：沉淀剂的浓度设置了以 1% 为单位，尝
试了 12 个梯度 ；盐离子浓度以 0.1 mol/L 为单位，
尝试了 12 个梯度；pH 以 0.1 为梯度尝试了 10 个梯度；
同时选择了不同的沉淀剂（PEG200-10000）、盐（各
类镁盐及盐酸盐）和 pH 缓冲液成分（Mes、Bis-Tris
和 HEPES），确定最优生长条件。添加剂筛选 ：控
制原结晶条件不变，在液滴中加入 0.2 μL 添加剂（96
种添加剂均来自 Additive Screen 试剂盒）后静置培养。
优化培养温度：尝试 4、8、14、18 和 20℃下培养晶体。
最后也尝试了微接种法，以获得单晶。
2 结果
2.1 pET28a-hspB-TEV-His重组质粒的构建与鉴定
突变 PCR 反应后，扩增产物由琼脂糖凝胶电泳
鉴 定， 在 4-8 kb 间 可 见 一 条 与 pET28a-hspB-TEV-
His 质粒理论大小（6.4 kb）相符的条带（图 3）。该
PCR 产物中包含环装缺刻质粒（目的产物）和痕量
模板质粒，经 Dpn I 消化后转化 DH5α，挑取单菌落
送测序，经比对，序列完全正确。
8000
bp
M 1
4000
2500
1500
1000
500
M ：DNA Marker DL2000 ；1 ：hspB 突变 PCR 产物
图 3 pET28a-hspB-TEV-His 重组质粒构建
2.2 HspB-TEV-His蛋白的镍柱亲和层析
菌体破碎后，离心收集上清，通过镍柱亲和层
析纯化，经 SDS-PAGE 检测，在 45 kD 处有目的蛋
白条带（图 4），与预期（44.6 kD）一致。上清、洗
脱液中均有目的蛋白，60 mmol/L 咪唑下可见少许杂
带（66 kD 处），判断可在之后的凝胶过滤层析中去
除，故合并洗脱液。可见，该重组蛋白表达高、可
溶性好且杂蛋白较少。
25
35
45
66
110
kD
M 1 2 3 4 5
M ：标准蛋白 Marker ；1 ：全菌蛋白 ；2 ：上清液 ；3 ：流出液 ；4 ：60 mmol/L
咪唑洗脱液 ；5 ：200 mmol/L 咪唑洗脱液
图 4 HspB-TEV-His 蛋白的镍柱亲和层析
2.3 TEV蛋白酶酶切效果比较
柱上酶切法 经 SDS-PAGE 分析（图 5），漂洗
液中只有切除 His 标签的 HspB（45 kD），洗脱液中
则存在酶切不完全仍带有 His 标签的 HspB-TEV-His
（45 kD）和 TEV 蛋白酶（27 kD）。
透析酶切法 经 SDS-PAGE 分析（图 5），流出
液中有切除 His 标签的 HspB 蛋白和少量 TEV 蛋白
酶，洗脱液中有未切开的 HspB 和 TEV 蛋白酶。
两种酶切方法均可切除 His 标签，且保证较高
的纯度。对比两者洗脱液，显然在柱酶切中未切开
的蛋白比透析酶切更多，说明透析酶切效率更高。
110
kD
M 1 2 3 4 5
66
45
35
25
HspB
TEV蛋白酶
M ：标准蛋白 Marker ；1 ：在柱酶切后漂洗液 ；2 ：在柱酶切后洗脱液 ；
3 ：透析酶切蛋白洗脱液 ；4 ：镍柱除杂流出液 ；5 ：镍柱除杂洗脱液
图 5 TEV 蛋白酶酶切效果比较
2.4 HspB的凝胶过滤层析
Superdex200 柱层析紫外吸收峰单一，峰型对称
陡峭，位置在 56 管（78.4 mL）处，此处对应于 44
kD，大小正确（图 6-A），取对应峰位置的蛋白进行
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.11240
SDS-PAGE 分析发现，纯化的蛋白为单一条带（图
6-B），达到晶体初筛所要求的纯度。收集峰尖位置
左右的 5 管蛋白进行浓缩。
-200
0
4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52 55 58 61 64 67 70
10 20 30 40 50 60 70 80 90
mL
-100
100
200
300
400
500
600
700
UV Cond
mAuA
0
110
kD
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9
66
45
35
25
18
14
B
M ：标准蛋白 Marker ；1-9 ：凝胶过滤层析收集管 53-61 ；A ：凝胶过滤成层
析紫外吸收曲线 ；B ：吸收峰对应蛋白 SDS-PAGE
图 6 HspB 的凝胶过滤层析
A B
A ：HspB 晶体初筛条件 ：25% PEG3350，0.1 mol/L Bis-Tris pH6.5，0.2 mol/L
MgCl2，14℃ ；B ：HspB 晶 体 优 化 条 件 ：22% PEG3350，0.1 mol/L Bis-Tris
pH6.5，0.21 mol/L MgCl2，18℃
图 7 HspB 晶体的优化
3 讨论
本研究所采用经典的 QuickChange 定点突变方
法［19，20］（图 2）：设计一对包含突变位点的引物，
和模版质粒退火后用 Pfu 聚合酶“循环延伸”（聚合
酶按照模版质粒延伸引物，一圈后回到引物 5 端终
止，再经过反复加热退火延伸的循环）。正反向引物
的延伸产物退火后配对成为带缺刻的开环质粒。Dpn
I 酶切延伸产物，由于原来的模版质粒来源于常规大
肠杆菌，是经 dam 甲基化修饰的，对 Dpn I 敏感而
被切碎（Dpn I 识别序列为甲基化的 GATC，GATC
在几乎各种质粒中都会出现，而且不止一次），而
体外合成的带突变序列的质粒因无甲基化而未被切
开，因此得以成功转化（大肠杆菌体内修复缺刻质
粒），即可得到突变质粒的克隆［21］。前期实验构建
了 pET28a-HspB 质 粒， 表 达 纯 化 得 到 HspB-His 蛋
白，用于结晶研究。由于晶体质量较差，不能用于
衍射［12］。蛋白 C 端序列存在超过 30 个氨基酸是非
折叠区域（Foldindex 预测），而这些氨基酸所形成
的柔性肽段，会导致蛋白在构象上的不均一，阻碍
晶体的生长［15］。然而完全或部分去除这些序列会导
致蛋白不表达或沉淀（数据未显示），暗示着该序列
对于 HspB 结构有着稳定作用。因此本研究选择去
除其 C 端的 His 标签（6×His 短肽也是柔性肽），以
提升蛋白晶体的质量。
前期实验尝试插入凝血酶酶切序列，然后发现
其无法被凝血酶切开。推测是由于其识别序列（Leu-
Val-Pro-Arg-Gly-Ser）较短，仅 6 个氨基酸，且前 3 个
氨基酸（Leu、Val 和 Pro）均是非极性氨基酸，在
2.5 HspB蛋白结晶条件初筛
经过大量的初筛条件筛选后，在 Index 2 试剂盒
（Hampton Research）的第 83 个条件下有晶体生长，
条件为 25% PEG3350，0.1 mol/L Bis-Tris pH6.5，0.2
mol/L MgCl2，14℃。晶体呈薄片状，且有孪晶现象（图
7-A），不适合 X-射线衍射数据收集，需要做进一步
的优化工作。
2.6 HspB蛋白结晶条件优化
确定的最优结晶条件是蛋白浓度 7.5 mg/mL，
22% PEG3350，0.1 mmol/L Bis-Tris pH6.5，0.21 mol/L
MgCl2，18℃，150 的比例加入晶种，蛋白溶液与
下槽液体积比为 21 的条件下，能够获得立体的块
状单晶（图 7-B），该晶体在上海光源进行 X 射线衍
射后发现分辨率达到了 1.8 Å。
2015,31(11) 241邬志杰等 ：恶臭假单胞菌 HspB 的单晶培养及结晶条件优化
表达时可能被折叠进了蛋白疏水核，没有暴露在水
环境中［22］；或者是由于其酶切位点在 Arg 和 Gly 间，
由于空间位阻，导致无法切除目的氨基酸［23］。
本研究总结了前期实验的经验，选择了 TEV 蛋
白酶作为工具酶，其主要考量在于 ：（1）其识别序
列（Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly）更长，为 7 个氨
基酸，且除了 Phe 疏水外，其余氨基酸皆亲水，不
易被折叠进疏水核内 ；（2）其酶切位点位于 Gln 和
Gly 间，离蛋白更远，会减小空间位阻的影响。
TEV 蛋白酶酶切时，需要解决了 3 个问题 ：（1）
新增的步骤带来的蛋白损失问题 ；（2）保持蛋白纯
度和性质的问题 ；（3）纯化路线的可操作性和时间
问题。因此，本研究比较了柱上酶切和透析酶切的
效率及纯化效果发现，虽然在柱酶切比较省时省力，
然而酶切效率较低，这可能是由于 TEV 蛋白酶与底
物 HspB 蛋白都带有 His 标签，因而结合在柱料上，
发生的是固固反应，分子间接触几率不如溶液反应
那么高，并且酶固定化后会降低酶活［24］；而透析酶
切是溶液反应，在酶切的同时进行咪唑浓度的稀释，
可以节省时间，方便下一步的镍柱除杂。因此最后
选择了透析酶切的策略。
蛋白的均一性是由镍柱除杂和凝胶过滤层析来
保证的。镍柱除去了未切开的 HspB 蛋白，保证产
物中仅有不带标签的 HspB 蛋白，这是无法通过凝
胶过滤层析实现的。均一性对于蛋白结晶的影响是
很大的，因此为了保持最大均一性，只取凝胶过滤
层析中紫外吸收峰半峰对应的 5 管蛋白进行浓缩点
晶，而非整个紫外吸收峰对应的蛋白［25］。这是由于
均一性越高，其蛋白的大小形状也越接近，在凝胶
过滤层析中，也就越倾向于在同一位置出峰。
因此最终确定下来的纯化路线能够获得纯度高、
较均一的 HspB 蛋白，并且没有降解存在。同时整
个纯化过程都在 4℃进行，在最终保存液中也添加
了二硫苏糖醇以保护蛋白。
培养得到的单晶在上海光源进行 X 射线衍射后
发现，虽然分辨率达到了 1.8 Å，但是在后续处理数
据时发现其仍有孪晶趋势，这可能是由于 TEV 蛋白
酶酶切后留下的肽（Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln）具有
一定的柔性所致，相比 6×His 标签，其在结晶条件
（pH6.5）下带电性更少，因而减少了同性相斥的现
象，更利于蛋白分子有序堆积［26］。因此接下来将继
续优化 C 端序列，进一步提高其构象均一性。底物
的存在有利于晶体的生长［27］，因此也将尝试进行与
底物的共结晶，进一步优化晶体。HspB 是恶臭假单
胞菌尼古丁代谢通路中的关键酶，该途径中其他酶
的结构多已见诸报道［28］，而 HspB 的结构仍旧未知。
了解 HspB 结构不仅有助于理解其功能和结构之间
的联系，完善整个吡咯途径，还对定向进化提高酶
活及进行工业化应用具有积极的指导意义。
4 结论
本研究以恶臭假单胞菌 HspB 表达质粒 pET28a-
HspB 为模板，通过 PCR 插入 TEV 蛋白酶酶切序列，
测序验证重组质粒 pET28a-HspB-TEV-His。选用大
肠杆菌 BL21（DE3）进行表达，经过镍柱亲和层析、
TEV 蛋白酶酶切、镍柱除杂以及凝胶过滤层析获得
高纯度蛋白。
优化结晶条件后，确定了单晶培养条件是蛋白
浓 度 7.5 mg/mL，22%PEG3350、0.1 mol/L Bis-Tris
pH6.5、0.21 mol/L MgCl2，18℃，以 150 的比例加
晶种，蛋白溶液与下槽液体积比为 21 的条件 ；单
晶的分辨率达到 1.8 Å。
参 考 文 献
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（责任编辑 狄艳红）