全 文 ：·技术与方法·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第10期
DNA 荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybrid-
ization，简称 FISH）技术的发展标志着传统细胞遗传
学向分子细胞遗传学的跨越，是 20 世纪 80 年代初
开始发展起来的一种重要的非放射性标记原位杂交
技术［1］。随着技术的不断改进，探针类型从最初的
DNA 重复序列和多拷贝基因家族序列发展到单或低
拷贝序列，然而，单低拷贝序列探针 DNA 片段较短，
结合率低、信号弱既不易杂交又不易检测，为克服
这方面的困难，发展了大片段克隆 DNA 作探针。主
要是细菌人工染色体（BAC），以其标记探针进行荧
光原位杂交（BAC-FISH），由于克隆的外源片段一
般为 100 kb 以上，其探针与靶 DNA 序列相遇的机
收稿日期 ：2013-04-10
基金项目 ： 中国热带农业科学院热带生物技术研究所基本科研业务费（ITBB130504），现代农业产业技术体系（甘蔗）建设专项资金
（CARS-20-6-11）
作者简介 ：甘仪梅，女，博士，助理研究员，研究方向 ：甘蔗遗传育种 ；E-mail ：ganyimeigl@126.com
通讯作者 ：杨本鹏，男，研究员，研究方向 ：甘蔗生物技术 / 耕作栽培 ；E-mail ：y-bp@163.com
BAC-FISH 在植物基因组研究中的应用
甘仪梅1  曾凡云2  张树珍1  杨本鹏1
（1. 中国热带农业科学院甘蔗研究中心 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 农业部热带作物生物学与遗传资源利用重点实验室
海口 571101 ；2. 中国热带农业科学院环境与植物保护研究所，海口 571101）
摘 要 ： 细菌人工染色体荧光原位杂交（BAC-FISH）是将包含不同特性的 BAC 克隆直接定位到染色体上的技术，其在植物
基因组学和分子细胞遗传学研究中具有不可替代的作用。综述其在各种植物染色体鉴定和核型分析、图谱构建、植物起源与进化
分析、基因定位以及 FISH 的分辨率等植物基因组学研究的应用进展。
关键词 ： BAC-FISH 植物基因组 核型分析 基因定位 物理图谱
Application of BAC-FISH in Plant Genomics Research
Gan Yimei1 Zeng Fanyun2 Zhang Shuzhen1 Yang Benpeng1
（1. Sugarcane Research Center of Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology of
Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Tropical Crops，Ministry of Agriculture，
Haikou 571101 ； 2. Environment and Plant Protection Institute of Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，Haikou 571101）
Abstract:  Fluorescence in situ hybridization of bacterial artificial chromosome（BAC-FISH）is a new technology that BAC clones with
different characteristics can be targeted directly to chromosomes, which plays an irreplaceable role in researches of plant genomics and molecular
cytogenetics. We reviewed the application of the identification and karyotype analysis of chromosomes, the construction of genetic and physical
maps, comparative mapping analysis, the origin and evolution of plants, the physical location of genes as well as the resolution and sensitivity
analysis of FISH.
Key words:  BAC-FISH Plant genome Karyotype analysis Gene mapping Physical map
会大，杂交信号检出率大大提高，而且准确可靠，
大大促进植物尤其是二倍体物种基因组的研究，现
已成为植物核型分析［2-5］、基因定位［6-8］、物理图谱
构建［9，10］及比较作图［11-15］等植物分子细胞遗传学
和基因组学研究的有力工具。
1 BAC-FISH 技术及其优势
与 常 规 FISH 技 术 相 比， 由 于 BAC 克 隆 探 针
片段大，往往含有更多重复序列，在原位杂交中会
产生更严重的干扰。因此，需要针对性的制作封
阻 DNA 以去除重复序列的干扰，而 Cot-1DNA 是在
BAC-FISH 中应用最广的封阻 DNA。所以，除了探
针的标记及纯化、探针与染色体的杂交、信号检测
2013年第10期 59甘仪梅等 ：BAC-FISH 在植物基因组研究中的应用
3 个步骤外，BAC-FISH 技术还增加了 Cot-1DNA 的
制备和 Cot-1DNA 对探针的封阻［6，16］。
由于基因组大片段克隆 BAC 探针的使用，BAC
探针突出其应用上的优势。首先，BAC 克隆的外源
DNA 插入片段较大，信号检出率明显提高。一般来
说，在最理想的杂交和检出条件下，靶 DNA 越长，
探针接触靶 DNA 的几率越高，FISH 的灵敏度也就
越高。由于 BAC 含有大的插入片段，扩大了探针与
杂交位点相遇的机会，使功能基因的染色体定位效
率显著提高，且产生的信号强度较强，无须再次放
大等步骤，因而杂交信号检出效率得到很大的提高。
Jiang 等［9］曾报道 BAC 探针在间期核及中期分裂相
中的信号检出率为 50%-90% ；其次，BAC-FISH 不
会降低定位的精确度和分辨率。原位杂交中染色体
上的杂交信号的覆盖范围在 1 Mb 左右，100 kb 的探
针与 1 kb 左右的探针杂交结果的信号覆盖范围基本
相同［7］。为进一步提高 BAC-FISH 的分辨率，彭仁
海［17］则利用 Pima90BAC 文库筛选出来的两个 BAC
克隆 150-D-24 和 182-F-9 依次在雷蒙德氏棉的有丝
分裂中期染色体、减数分裂粗线期染色体以及 DNA
纤维上进行双色 FISH 发现，两个克隆信号间的距离
依次为 0.21 μm、3.8 μm 和 128.4 μm，说明在不同靶
DNA 上的分辨率差异明显增强，估算出两个克隆间
的实际距离为 419.8 kb。另外，BAC 克隆的 DNA 插
入片段较大，便于构建真核生物基因组的物理图谱，
并且一旦得到目标克隆便可根据其大量序列数据信
息更容易的克隆到目的片段，为加速分离和克隆目
的基因的进程，并最终为目的序列的克隆提供了更
强有利的工具。
2 BAC-FISH 在植物基因组研究中的应用
BAC-FISH 作为一种确定基因片段在染色体上
位置最直接、高效的方法，在染色体鉴定和核型分析，
图谱构建、比较作图和进化研究、基因定位和染色
体作图分辨率研究等植物基因组研究中得到了越来
越广泛的应用。
2.1 BAC-FISH在染色体鉴定及其核型分析中的应用
染色体鉴定是细胞遗传学研究的基础。对许多
植物，特别是染色体小或相似的植物，染色体鉴定
非常困难。核型分析（karyotype analysis）是在对染
色体进行测量、计算的基础上，进行分组、排列（按
长臂的大小或总的长度依次排列）、配对并进行形态
分析的过程。早期的植物染色体核型分析及结构研
究主要对染色体进行测量比较以及基于高度重复序
列的 FISH 进行分析，然而与动物相比，植物的细胞
具有细胞壁，并富含各种次生物质，多数植物染色
体小、形态相似。因此，这种核型分析往往不够准
确，严重阻碍了植物染色体结构的研究及其核型分
析。随着 BAC-FISH 技术和遗传连锁图的发展，从
遗传连锁图中选择 RFLP 或 SSR 等分子标记，再从
BAC 文库中筛选相应 BAC 克隆，标记 BAC 探针进
行 BAC-FISH，分辨出各条染色体，从而在各种植物
中进行准确的染色体核型分析，如马铃薯［2，18］、苜
蓿［19］、水稻［2，18］、芸苔［13］、高粱［3，5］、羽扇豆［20］
和棉花［21-24］。
Dong 等［2］利用马铃薯（Solanum bulbocastanum，
2n=2x=24）遗传图谱不同染色体上的 RFLP 标记作
为探针筛选 BAC 文库，获得全部 12 条染色体上的
特异 BAC 克隆，标记为探针与有丝分裂中期染色体
进行原位杂交，清楚地分辨出各条染色体。Kim 等［3］
开发出一套高粱的（Sorghum bicolor（L.）Moench，
2n=20）染色体特异 BAC 克隆，与前者不同的是，
他们利用多色原位杂交技术，将这一套染色体特异
BAC 探针同时在一个制片上杂交，成功在一个分裂
相中同时识别出全部染色体，为真正的核型分析奠
定了基础。2005 年，Kim 等［5］在此基础上利用先前
的混合探针 BAC-FISH 技术对高粱染色体进行了核
型分析，并根据染色体的长度提出了一个高粱的染
色体命名，将各连锁图中的染色体命名进行了统一。
2009 年，Tang 等［25］利用五色 BAC-FISH 技术作出
了首张马铃薯全基因组细胞遗传学图，应用这张
图，构建了整合遗传连锁图和物理图的标准的粗线
期染色体核型图。Cheng 等［2］开发出一套水稻染色
体臂特异的 BAC 克隆，结合水稻的着丝粒特异序列
pRCS2 在减数分裂粗线期染色体进行了更加精细的
核型分析。Wang 等［21］从一个棉花高密度遗传图谱
上选择各染色体特异 SSR 标记，并筛选另一个以雄
性不育恢复系材料 0-613-2R 构建的 BAC 文库，开
发出一套完整的四倍体棉染色体特异 BAC 克隆，利
用其 BAC-FISH 杂交信号作为染色体特异细胞学标
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第10期60
记，准确地识别出陆地棉 26 条染色体。利用这套陆
地棉染色体特异 BAC 克隆为探针进行的 BAC-FISH，
Gan 等［23，24］将四倍体海岛棉和达尔文氏棉，二倍
体 D 基因组的瑟伯氏棉、三裂棉、克劳茨基棉、戴
维逊氏棉、辣根棉和旱地棉的全部染色体都准确鉴
定出来。Wang［22］采用陆地棉 A 亚组的染色体特异
的 22 个 BAC 克隆在 A 基因组亚洲棉有丝分裂中期
染色体上进行 BAC-FISH，准确鉴定了亚洲棉的 13
条染色体。
利用染色体特异 BAC 克隆作为分子细胞学标记
进行染色体识别及核型分析具有物理信号识别，结
果正确可靠，不受外界因素干扰的特点，不同于经
典的核型分析技术，不会因制片过程影响染色体的
形态而导致错误的识别结果。
2.2 BAC-FISH在图谱构建的应用研究进展
BAC-FISH 为物理图的构建起着重要的作用。当
前构建覆盖整条染色体或整个基因组的物理图的方
法主要有 3 种 ：一是通过指纹识别大片段基因组克
隆，如 BAC 克隆组装成 DNA 重叠群 ；二是利用缺
失或易位等细胞遗传学片段，将遗传作图的分子标
记物理定位到特定的染色体上 ；三是通过 BAC-FISH
将 DNA 克隆直接定位到染色体上。尽管每个方法都
有其优缺点，而基于 FISH 的方法则可用克隆识别染
色体位置，将克隆直接定位到与常染色质或异染色
质有关的染色体区域，且短时间内费用比较低。而
BAC-FISH 则是最有效的方法，它可将遗传连锁图
和染色体图完全整合起来。例如，Cheng 等［4］用 18
个标记筛选的 BAC 克隆定位到水稻减数分裂粗线
期 10 号染色体上，这个 FISH 图显示出了水稻整条
10 号染色体遗传重组的分布和着丝粒的遗传位置和
物理位置。相似的基于 BAC-FISH 的物理图已经在
许多植物中构建，包括高粱［5，26，27］、玉米［15］、甘
蓝［28， 29］、大豆［30，31］、水稻 5 号染色体［32］、番茄［33， 34］
和马铃薯［25］。此外，BAC-FISH 还可以进行 BAC 重
叠群辅助作图。通过 BAC-FISH 技术将 BAC 重叠群
定位到常染色质或异染色质区域［25-34］，片段 BAC
重叠群在染色体上的方向，从而进行图位克隆［36-38］，
也将为填补图谱中和基因组测序中存在间隙提供宝
贵的信息。
此外，BAC-FISH 为饱和的遗传图谱构建提供了
一个重要的辅助工具。通常由于标记的数量及自身
特性及分布情况，遗传连锁图构建中遗传标记的分
布与其真实的物理分布并不是一致的，利用标记筛
选 BAC 文库得到相应的 BAC 克隆，然后运用 BAC-
FISH 技术构建相应的物理图谱草图，然后与遗传图
谱比较即可显示标记的真实位置及分布情况，从而
对连锁群的覆盖度等情况作以初步评估。Kim 等［5］
比较遗传标记与其 BAC 克隆物理定位发现，尽管
在连锁图上某些标记的遗传位置位于连锁群的中
部，但大部分克隆呈近染色体末端分布，并发现两
个在连锁群上的遗传标记，虽然它们之间的遗传距
离超过该连锁群总长的 50%，但其相应的 BAC 信号
显示它们的物理距离非常靠近，这些可能反映了在
高粱染色体远端的遗传重组的高度活跃的特性。这
一点亦可指导我们进行饱和连锁图的构建。例如，
De Donato 等［28］ 通过选择遗传图谱中位于连锁群
末端标记，筛选 BAC 进行 FISH 定位，然后比较标
记的物理位置是否达到染色体的末端来初步评价连
锁群的饱和程度发现，1 号和 5 号染色体末端标记
的物理位置达到了染色体的末端，因此认为这两条
连锁群的标记基本完全覆盖染色体。Kim 等［3］根
据这一方法对高粱的连锁群覆盖度进行了评价，认
为染色体 B 和 D 的覆盖度基本达到染色体的末端。
Wang［21］应用 BAC-FISH 对物理图谱和遗传图谱进
行比较作图分析，发现遗传图中位于连锁群中部的
部分标记的相应克隆杂交显示，其位于染色体的末
端或近末端处，暗示棉花基因组中染色体的远端往
往是重组活跃区段。另外，以染色体 A6 上的两个
末端标记的阳性 BACs 47N15 和 75F07 进行物理定
位发现，它们位于染色体末端，证明该连锁群上的
标记已经覆盖该染色体了。
2.3 比较作图和进化研究中的应用进展
来自某个物种的 BAC 克隆作探针在相近物种中
杂交进行比较作图。与比较传统的遗传连锁作图相
比，此 FISH 作图有以下优点 ：（1）不要求作图群
体 ；（2）不依赖于多态性，因此一个物种的所有克
隆都可在另一物种中作探针 ；（3）易于识别两物种
进化过程中的重排事件，如复制。
2013年第10期 61甘仪梅等 ：BAC-FISH 在植物基因组研究中的应用
近年来，番茄和马铃薯间的 BAC-FISH 比较作
图发展迅速，两物种间存在良好的共线［34，38，39］，
短臂常染色质区存在倒位现象［38，40］，比以前报道的
基于比较遗传图分析有更多的染色体重排现象［38］。
关于拟南芥和甘蓝间的 BAC-FISH 比较作图有不少
报道［11，12，41］，拟南芥和甘蓝早在大约 150-200 万
年前分开，且可直接连接两个物种间的共线性及基
因组内复制［11，12，41，42］。其他植物也有相关报道，
如稻属和高粱属［43］，水稻和芭蕉［44］，高粱和玉米［45］，
以及高粱和草类植物［15，46］。
通过基于 BAC-FISH 技术研究不同种间的比较
作图，加快了植物间系统发育与进化研究的发展。
Zhang 等［47］ 根据 RFLP 标记从小麦的 A/D 供体种
Triticum monococcum 和 Aegilops tauschii BAC 文库中
筛 选 出 了 56 个 BAC 克 隆， 进 行 BAC-FISH， 发 现
有 BAC 克隆偏向杂交到 D-genome 的散在重复序列
并同时分辨出异源六倍体小麦的不同亚组，测序后
发现这些序列都是转座子元件，这些元件在小麦基
因组进化的重要性。同时根据 BAC-FISH 鉴定出的
各种重复序列发现其中两个 BACs 与重复 DNA 家族
pSc119 相似，一个 BAC 克隆与 pAs1 相似，此外他
们还鉴定出几个新的重复序列类型 ：一个 BAC 克隆
杂交到除水稻以外的小麦等谷类作物的着丝粒区域；
一个 BAC 克隆杂交到小麦、燕麦、黑麦和大麦的亚
端粒染色体区域 ；一个 BAC 克隆包含特定的重复序
列，并杂交到小麦 5 对 D 组染色体上及 4 个 BAC 克
隆杂交到六倍体小麦 4A 染色体长臂的远端，这些
重复序列都对植物基因组进化有重要的作用。
BAC-FISH 比较作图方法最大的困难在于在一个
物种中可产生强烈的信号而在相关物种的信号很弱
或者没有。一般来说，两物种间的系统进化距离越远，
产生的信号就越弱［14，42］，如许多高粱 BAC 克隆在
玉米染色体上可产生许多有用的信号［14，15］，但在水
稻染色体上的信号却很弱或没有［14］。
2.4 BAC-FISH 在基因定位中的应用
目前，在植物中利用分子标记技术，开发出大
量的重要基因、QTL 位点等相紧密连锁的标记，从
而促进对其基因位点的物理定位及图位克隆研究，
BAC-FISH 技术的应用则为其定位研究和图位克隆提
供了一个重要手段。首先，根据连锁图谱，利用与
目的基因紧密连锁的分子遗传标记如 SSR、RFLP 或
cDNA 等即可筛选出相应的阳性 BAC 克隆，由于标
记与基因位点间紧密连锁的关系，该克隆的物理位
置即可反映相应基因位点的物理位置，但其精确程
度则取决于标记与基因位点间的连锁紧密程度，这
一功能在水稻上得到更广泛的应用。Jiang 等［9］利
用与水稻白叶枯病抗性基因 Xa-21 紧密连锁的标记
从其抗性近等基因系材料 IR-BB21 构建的 BAC 文
库中筛选出多个阳性克隆，BAC-FISH 结果显示它
们的信号位点在中期和间期染色体上都位于同一染
色体的长臂上，并且双色探针杂交的信号出现重
叠，验证克隆间的包含重叠区段的紧密连锁关系。
Nakalmura 等［48］构建与 Pi-ta2 连锁的 800 kb 的 BAC
重叠群，通过 BAC-FISH 将 Pi-ta2 定位在水稻第 12
号染色体的近着丝粒区域中 ；Gomez 等［8］用来源于
玉米 cDNAsh2 基因筛选高粱 BAC 文库，筛选出的
BAC 阳性克隆通过 FISH 定位在 D 型染色体上。Yan
等［7］将几个重要水稻抗性基因分别定位到水稻第 4
号染色体的长臂和短臂上。Lapitan 等［49］将包含大
麦醇溶蛋白基因序列的两个 BAC 克隆定位到大麦一
对染色体的近末端区域。Budiman 等［50］利用 BAC-
FISH 技术，整合遗传和物理作图，将番茄脱落突变
子基因 jointless-2 定位到 12 号染色体着丝粒区域。
Cevik 和 King［51］通过 BAC-FISH 技术将蚜虫抗性基
因位点 Sd-1 定位到苹果 7 号连锁群的亚端粒区域。
Capdeville 等［52］通过 BAC-FISH 确定了包含已知抗
病基因的克隆在两个不同芭蕉种的相对位置。Dong
等［4］利用多色原位杂交技术，将这一套 BAC 克隆
作为探针同时与 45S 和 5S rRNA 基因及包含一个与
马铃薯晚疫病紧密连锁的 RAPD 标记位点的 BAC 克
隆探针进行杂交定位，将 45S 和 5S rDNA 基因分别
定位在染色体 1 和 2 上，而该 RAPD 标记克隆定位
在染色体 8 的长臂上，进一步分析信号位点与端粒
间距离结果显示，信号位于长臂外侧占其总长的 1/4
处。此外，对于某些已克隆的基因或小的目的片段
来说，将其作为探针标记直接杂交定位，往往是不
可行或较困难的。但利用已知序列目的基因或片段
序列设计特异引物，然后用这些特异引物筛选文库
获得阳性 BAC 克隆，从而将包含目的片段而且将
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第10期62
小的片段转换成大的 BAC 克隆，就能够通过 BAC-
FISH 对序列较短的已知序列进行定位了。
2.5 研究染色体作图的分辨率
困扰着细胞遗传学研究者的一个普遍的问题是
FISH 作图的分辨率和灵敏度。其分辨率主要取决于
FISH 的靶 DNA，主要包括间期核、有丝分裂前中期
和中期染色体、超拉伸的有丝分裂中期染色体、减
数分裂粗线期和伸展的 DNA 纤维［53］。有丝分裂中
期染色体虽然比较好制备，但其分辨率较低，其只
有 5-10 Mb ［54］，而 BAC-FISH 荧光信号显示在浓缩
度稍微低一点的有丝分裂前中期分辨率可提高到 2
Mb［55］。通过 BAC-FISH 发现，间期核、超拉伸的有
丝分裂中期染色体、减数分裂粗线期染色体和伸展
的 DNA 纤维的分辨率可达 100 kb 以下［55，56］。相邻
BAC 克隆可在粗线期后期染色体上分辨出，甚至部
分重叠 BAC 克隆在粗线期前期染色体上分辨出［55］。
Fiber-FISH 的作图分辨率最高，BAC-FISH 结果发现
可达几 kb［53］。经用 15 个玉米 9 号染色体特异 BAC
克隆作探针进行杂交发现，玉米有丝分裂中期 9 号
染色体的分辨率为 3.3-8.2 Mb，比 9 号减数分裂粗
线期染色体的分辨率低了 12-30 倍［56］。
作图灵敏度主要取决于探针的大小。探针过小，
与靶 DNA 的结合性就低，造成检出率低，且在不同
研究者间的可重复性很低，而引入大片段基因组克
隆，主要是 BAC 克隆，可大大提高检出率［57-59］。
3 BAC-FISH 的应用前景
近年来，植物基因组测序发展迅速，BAC-FISH
将继续在序列信息和染色体生物学间起着重要的桥
梁作用，且也是将 DNA 序列定位到染色体特定常染
色质区或异染色质区的唯一方法。目前所有的测序
方法都不可避免地形成物理间隙，而 BAC-FISH 将
是判断间隙大小的最有效的方法。此外，遗传重组
受到明显抑制的基因组区域会限制遗传作图的分辨
率，而 BAC-FISH 则揭示及鉴定非重组区域最有效
的方法［60］。目前，植物基因组测序很难在含有高度
重复序列的基因组区域进行，如着丝粒在许多模式
植物基因组测序中都有物理间隙，而端粒也是很难
将其克隆出来。而 BAC-FISH 技术则是描绘这些基
因组区域结构和 DNA 成分的最有力的工具［61，62］。
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（责任编辑 狄艳红）
《生物医学工程与临床》是一本连接临床与生物医学工程的综合性刊物。是中国科技论文统
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