全 文 ：　　收稿日期: 1997-01-13
①浙江省自然科学基金资助项目
葡萄属植物基因组 DNA的多态性分析①
董继新 1　林伯年 2　何祖华1
( 1浙江农业大学生物技术研究所 ,杭州 310029; 2浙江农业大学园艺系 ,杭州 310029)
Studies on Polymorphisms of Genomic DNA in Vitis
Dong Jixin
1　 Lin Bonian2　 He Zuhua1
( 1 Institute of Biotechnology , Zhejiang Agricultural University , Hangzhou 310029, China;
2 Department of Horticulture , Zhejiang Agricultural University , Hangzhou 310029, China )
　　葡萄属植物 ,共 70余种 . 其中大多数种仍处于野生状态 . Collins & Symons首次应用
RAPD技术对 16个葡萄材料进行了多态性研究 ,发现葡萄品种间多态性良好 ,而品系间则无
明显差别 ; 1994年 Bakalinsky等对 9个葡萄砧木进行了 DNA指纹研究 ,但他们所用材料非常
有限 . 作者以来自于不同种群的 33个葡萄种、变种、杂种和品种为材料进行 RAPD研究 ,以期
对葡萄属种质资源的保存和利用 ,尤其是野生葡萄种质资源的开发利用和新品种的选育 ,提供
理论依据 .
1　材料和方法
1. 1　材　料　　供试材料采自浙江农业大学园艺系葡萄标本园 . 有香槟尼、康拜儿、沙地、秋
葡萄、瘤枝、北醇、桑叶 (♀、 )、宿晓红、玫瑰香、复叶、甜冬、刺葡萄 (实生、♀、 )、河岸、华东、
毛葡萄、熊岳、圆叶、三出、网脉、燕山、小果野葡萄、小叶葛晶艹、俄罗斯康克、红瑞宝、菱叶、美丽、
婴艹奥艹、葛晶艹、广西毛葡萄和江西毛葡萄共 33个 . 于 1995年 5月 15日至 16日取幼嫩全展叶 10
g左右备用 .
1. 2　幼叶基因组 DNA提取及纯化　　① DNA的提取 (改良 Couch& Fritz法 ): 在研钵中注
入液氮迅速研磨至粉状 ,加入 20 m l提取缓冲液Ⅰ ( 0. 1 mol /L柠檬酸钠 , 50 mmo l /L EDTA,
2 mmol /L 2-巯基乙醇 , 0. 35 mol /L葡萄糖 , 2. 3% N, N-二乙基二硫代氨基甲酸钠 , 2% PV P,
pH7. 5)研磨至糊状 , 10 000 r /min, 4℃离心 10 min,去上清 ,重复 3次 . 在沉淀中加入提取缓
冲液Ⅱ (即提取缓冲液Ⅰ 中以 2% N-十二烷基肌氨酸代替 0. 35 mo l /L葡萄糖 ) 3 m l, 4℃过
夜 ,同样条件离心 ,取上清 ,重复 2次 , 2次上清加等体积苯酚 12 000 r /min, 10℃离心 30 min.
取上层 ,加等体积氯仿 /异戊醇混匀 , 12 000 r /min, 10℃离心 10 min,轻取上层 ,加 10 mmol /L
2-巯基乙醇 , 1 /10体积 3 mo l /L NaAc, 2倍体积冷无水乙醇 , - 20℃过夜 .离心后用 70%乙醇
洗涤 ,干燥 ,溶于 2m l TE中 , - 20℃保存 .② DNA的纯化:提取的 DNA进一步经 Sepharo se-
2B柱层析纯化 ,柱高 25 cm,直径 1. 0 cm. 洗脱液为 10 mmol /L Tris-HCl ( pH8. 0) , 0. 2
mmol /L NaCl, 0. 5 mmo l /L EDT A, 2 mmo l /L 2-巯基乙醇 ,流速为 0. 6 ml /min.适时收集洗
　浙 江 农 业 大 学 学 报 　 24( 2): 219～ 220, 1998　 　　
Journal of Zh ejiang Agricul tural Universi ty　　 　
脱液 ,无水乙醇沉淀 , T E重溶 ,再用苯酚、氯仿各抽提一次 ,无水乙醇沉淀上清 ,沉淀溶于 T E
中即为纯化的 DNA. 将其稀释后测定 OD值 , 0. 8% Aga ro se电泳以观察 DNA是否降解 .
1. 3　 PCR反应体系和扩增程序　　 25μl反应体积中含有 10× PCR buf fer 2. 5μl,每种
dN TP为 200μmo l /L, MgCl2为 2. 0 mmo l /L,引物 0. 2μmol /L,模板 DNA25 ng , Taq DN A
聚合酶 1 U, 16. 5μl dd H2O,最后加石蜡油 40μl. 其中引物购自 Operon公司 ( Ki tV)和 U. B.
C( set # 6,# 7) ,其余试剂均为 Promega公司产品 . PCR反应在 PE480上进行 . 程序如下:预
变性 94℃ 120 s;变性 94℃ 45 s,退火 37℃ 45 s,延伸 72℃ 120 s,共 45个循环 ;最后 72℃
保温 5 min.
1. 4　本试验所用引物及其序列　　所用引物 14个 ,分别为 636: GGGATATCGC ( 5′→ 3′,下
同 ) , 682: CTGCGACGGT, 691: AAACCAGGCG, 721: CCCT TCCCTC, 739: GGAGGGA-
GAG, 741: CCTCCCTCCT, O PV -01: TGACGCATGG, OPV-03: CTCCCTGCAA, OPV-06:
ACGCCCAGGG, O PV-09: TG TACCCGTC, O PV-14: AGATGCCGCC, OPV-15: CAGTGC-
CGGT, O PV-18: TGGTGGCGT T, OPV-19: GGGTGTGCAG.
2　结果与分析
2. 1　 DNA纯度检测　　从 DNA的 OD值来看 ,绝大多数样品 OD260 /OD280的值均在 1. 7～
2. 0.另据电泳结果分析 ,提取的 DNA基本未降解 ,长度在 50 kb左右 . 表明所有 DNA样品均
能用作 RAPD的模板 .
2. 2　 RAPD带型分析　　 14个引物共计扩增出 137个 RAPD片段 . 扩增最多的是引物 682
产生 13条带 ,最少的是引物 O PV-19,仅产生 6条带 . 扩增片段的长度多数集中在 200～ 2 800
bp.
　　所得结果表明:①引物不同将扩增出不同的带型 ,其中 7个引物又具有 1～ 2条单态性带 ,
这些带为所有样品共有 ,暗示葡萄属植物既有遗传背景的复杂性 ,又有本属植物的共同性 . ②
引物 682对所有样品的扩增带型均不完全一致 ,即引物可以将供试 33个材料都区分开 . ③样
品之间亲缘关系越远则它们的扩增带型相差越大 .如样品 5为比较原始的野生类型 ,而 6号是
栽培品种 ,亲缘关系甚远 ,两者的带型变化就很大 ;而样品 18、 32、 33均为毛葡萄类型 ,多数引
物扩增的带型比较相似 . 对扩增带型进行统计 ,并通过聚类分析可将 33个葡萄材料分为 7大
类群 ,各类的组成和传统方法、同功酶法及 RFLP分类结果相当吻合 ,仅有少数几个样品的分
类位置和其他方法有一定的差异 .
致　谢　　本研究得到浙江农业大学生物技术研究所农业部植物病理和生物技术重点开放实
验室的支持 ,特此致谢 .
(责任编辑　杜玲玲 )　　
220 浙 江 农 业 大 学 学 报 　　　　　　　　　　　　　　 24卷