全 文 ：武汉植物学研究 2001, 19( 5) : 353～356
Journal of Wuhan Botanical Research
RTSV和 Glh在药用野生稻中的物理定位

黄思罗　覃　瑞　傅彬英　金危危　何光存　宋运淳


(武汉大学教育部植物发育生物学重点实验室, 武汉　430072)
摘　要: 药用野生稻具有多种抗病虫性,是水稻品种改良重要的种质资源之一。本研究采用
与栽培稻遗传图第 4 连锁群中与 R TSV 和 Glh 紧密连锁的 RFLP 标记 RZ262及其筛选出来
的 BAC 克隆作探针,对药用野生稻进行荧光原位杂交, 供试探针均被定位于药用野生稻第 4
染色体短臂的中部, 百分距分别为 74. 86±3. 72 和 73. 98±4. 44, 信号检出率为 7. 6%和
45. 1%。BAC 克隆和 RFLP 标记探针杂交位置几乎一致, 说明在栽培稻和野生稻中 RFLP 标
记 RZ262都存在同一 BAC 克隆的大插入片段中, 药用野生稻与抗性基因 RT SV 和 Glh 的同
源顺序就在第 4 染色体信号出现的相应位置, 从而为作物育种开发和利用野生资源的抗性基
因提供了理论依据。
关键词: 药用野生稻; BAC-FISH; 比较物理定位; RT SV ; Glh
中图分类号: Q943　文献标识码: A　文章编号: 1000-470X ( 2001) 05-0353-04
Physical Map of RTSV, Glh in Oryza off icinalis with BAC-FISH
HUANG Si-Luo, QIN Rui, FU Bin-Ying , JIN Wei-Wei,
HE Guang-Cun, SONG Yun-Chun**
( Th e K ey L abor atory f or Plant Dev elop mental Biology, T he Minist ry of E du cation, Wuhan
Univ ersity , Wuh an　430072, China)
Abstract: Ory z a of f icinalis is an impor tant resistance r esource fo r impr ovement
of cultivated rice. In this study, cult ivated r ice BAC clone 14E16 and RFLP
marker RZ262 which linked to RTS V , Glh were adopted for mapping in O . of-
f icinali s. T he FISH results show ed 14E16 and RZ262 w ere located at 4S in O.
of f i cinalis, the percentag e distance f rom the centromere to the hybr idization
sites w ere 74. 86±3. 72 和 73. 98±4. 44, the detect ion rates w er e 7. 6% and
45. 1% respect ively. The r esults obtained from the BA C and plasmid clones
RZ262 of cult ivated rice and O . of f icinalis were the same, it is suggested that




通讯作者。Corresponding author ( E-mai l: Ycson g@ whu. edu . cn) .
收稿日期: 2001-06-06,修回日期: 2001-07-23。
基金项目:国家自然科学基金(批准号: 39870423)和高等学校博士学科点专项研究基金(批准号: 207980112)资
　助项目。
　作者简介:黄思罗( 1976- ) ,男,硕士在读,从事植物分子细胞遗传学研究。
the marker, RZ262, of cult iv ated rice and O. of f icinal is be in the same BAC
clone, the homo logous sequences of RTS V and Glh in O . of f icinal is were posi-
tions that signals ex ited on the 4S. T hese results w ill prov ide the base for uti-
lizations of r esistance genes in w ild rice.
Key words : Ory z a of f icinal is; BAC-FISH; Comparativ e physical map; RTSV ;
Glh
药用野生稻分布在我国的广东、广西、海南、云南 4省(区) , 38个县(市)中。属于 CC
染色体组型。我国药用野生稻的一些材料抗三化螟、褐飞虱、白背飞虱、稻瘿蚊、稻瘟病、白
叶枯病和东格鲁球状病毒等多种病虫害。因此, 药用野生稻在稻属抗性研究中是一种理想
的材料[ 1]。但是由于药用野生稻染色体组型与栽培稻的染色体组型不同,稻属种间杂交常
常遇到有性生殖的障碍,严重地阻碍了遗传物质的转移交流, 而且这些抗病基因在药用野
生稻基因组中的分布与作用机制也并不清楚。目前, 分子生物学方法已成为野生稻基因转
移利用和研究中的一种必不可少的手段,并成功地应用于野生稻杂种的鉴定[ 2]、后代遗传
组成的分析、外源 DNA片段及其大小的检测 [ 3]、野生稻基因的标记定位和克隆 [ 4]。
因此,在本研究中,我们选用栽培稻遗传图第 4连锁群中与抗东格鲁球状病毒病基因
RT SV 和抗叶蝉基因 Glh连锁的 RFLP 标记 RZ262及其筛选出来的 BAC 克隆 14E16作
为探针,对药用野生稻进行原位杂交来确定 RTS V 和 Glh 在药用野生稻染色体上的具体
位置,从而为分离和应用它们提供依据。在此之前,药用野生稻第 4染色体的核型,我们已
根据 Jena 等[ 5]的栽培稻和药用野生稻的分子比较遗传图,选用与抗瘿蚊基因 Gm-6连锁
的 RFLP 标记 RG214及其筛选出来的 BAC 克隆 24E21通过原位杂交进行了确定[ 6]。
1　材料与方法
1. 1　植物材料和染色体制片
供试材料为药用野生稻( Ory z a of f i cinal s)稻株 1589,由广东农业科学院国家野生稻
圃提供。染色体制片分别参照 Yan 等[ 7]和 Ren等 [ 8]的方法。
1. 2　水稻 BAC克隆及探针标记
RFLP 标记 RZ262与抗东格鲁球状病毒病基因 RTS V 和抗叶蝉基因 Glh 连锁,供试
BAC 克隆 14E16( 61kb)由 RFLP 标记 RZ262( 1. 5kb)筛选得到。武汉大学遗传研究所杨
代常博士提供。RZ262由美国康奈尔大学 Bald博士提供。
用碱裂解法 [ 9]抽提BAC克隆质粒和 RZ262质粒。提纯的质粒 DNA 用缺刻平移法标
记。50
L 反应液中含 dAT P、dCTP、dGT P、biot in-11-dU TP、Dnase I、DNA 聚合酶 I 和
0. 5
g 质粒探针 DNA, 15℃下标记 1. 5～3 h 后加 5
L 0. 2 mol/ L EDT A( pH8. 0)终止
反应, Sephar ose CL-6B( Sigma)纯化,用加链亲和辣根过氧化物酶( BRL, L ife Technolo-
gies)的点印记法检测标记效果。
1. 3　原位杂交及检测
标记的探针的染色体杂交分别参阅Song 等 [ 10]和 Jiang [ 11]等程序稍加修改。所用杂交
液含 50 ng 标记的探针 DNA, 50%去离子甲酰胺, 8%硫酸葡聚糖, 2×SSC, 0. 5
g 鲑鱼
354 武汉 植 物学 研究　　　　　　　　　　　　　　　　　第 19卷　
精子DNA, 2
g 水稻 Co t-1DNA( 100 bp～1 kb) , 37℃杂交过夜。杂交信号的荧光检测:
42℃ 2×SSC漂洗 5 min,依次加入 10
g/ mL FITC-avidin( Sigma ) , 5
g / mL Ant i-avidin
( Sigma) , 10
g/ mL FIT C-av idin 37℃各 30 m in, 50
g/
L PI复染, B×60型显微镜观察
并拍照。水稻 Cot-1 DNA 的制备参见 Zw ick 等的方法 [ 12]。
2　实验结果
利用BAC 克隆 14E16和 RZ262作为探针对药用野生稻的原位杂交结果见表 1和图
版Ⅰ: A～E。从水稻遗传图已知 RTS V 和 G lh位于第 4连锁群 [ 13]。在药用野生稻中, 用
14E16和RZ262作探针的实验结果表明,其信号点所在的染色体形态分析结果与24E21、
RG214的结果几乎一致[ 7] ,从而确定信号在第 4染色体短臂上(图版Ⅰ: A, B, F ) ,信号与
着丝粒百分距离分别为 73. 98±4. 44 和 74. 86±3. 72, 信号检出率分别为 45. 1%和
7. 6%。而在栽培稻中, 14E16的信号则位于第 4染色体短臂末端[ 6]。BAC克隆的检出率
远远高于 RFLP 探针(表 1) , 而且在 BAC 克隆的 FISH 中检测到姊妹染色单体同时出现
信号的双点(图版Ⅰ: A, B)。
表 1　探针 14E16 和 RZ262在药用野生稻染色体上杂交信号的位置
Table 1　The locations of hybr idization signals in Ory za of f icinalis using 14E16 and RZ262 as probes
材料
Material
探 针
Probe
检出信号的染色体臂
T he arms
detected
sign als
臂比
Arm
rat ios
信号距着丝粒平均百分距离
Average d istan ce
f rom th e sign al
spots to the
cent romere
观察细胞总数
Th e total
number of
th e cells
observed
检出信号的细胞数
Th e number
of the cell s
detected
signals
检出率
Detect ion
rate
Oryz a of f icinalis 14E16 S (1) 1. 06±0. 03( 2) 73. 98±4. 44 113 51 45. 1%
Oryz a of f icinalis RZ262 S　 1. 04±0. 04 74. 86±3. 72 132 10 7. 6%
　　( 1) S hort arm; ( 2) S tand ard deviat ion.
3　讨论
在植物中,现有的原位杂交技术主要用于对 DNA 重复序列和多拷贝基因家族作图。
植物单或低拷贝基因常为 1至数 kb的小片段 DNA, 其探针与靶 DNA 序列相遇的机会
较小,因此杂交信号检出率较低。而 BAC 克隆的外源片段一般为 100kb 左右 [ 14] , 因此将
BAC 克隆与具有高灵敏度的 FISH 技术相结合(即 BAC-FISH) , 有利于提高单拷贝的如
抗性等功能基因的物理定位信号检出率,大大促进植物基因组的研究[ 15]。目前运用该技
术已将抗白叶枯病基因 Xa-21、棉花 rRNA 基因[ 15]、抗稻瘟病 P i-5( t )、抗叶蝉基因 Glh
和抗水稻东格鲁球状病毒病基因 RTSV [ 14]成功地定位到栽培稻染色体上。在我们的实验
中, 14E16( 45. 1% )在药用野生稻染色体上的信号检出率就远高于 RZ262 探针的水平
( 7. 6% ) (表 1)。
此外, 每个 BAC 克隆可能包括较多的 DNA 片段, 从而决定了利用它作探针不仅仅
是对单个基因,而且可能是对多个基因或标记的物理作图。因此, 其结果还可以用于检测
不同物种多个标记的同线性和它们分布区域的保守特点 [ 16]。在我们的研究中, BAC克隆
14E16只在第 4染色体短臂上的特定位置检测到信号点,说明这个栽培稻 BAC 克隆所含
355　第 5期　　　　　　　　　　黄思罗等: RTSV 和G lh在药用野生稻中的物理定位
的DNA长片段或多个标记在药用野生稻第4染色体分布同线而且同区, 栽培稻中的与
RT SV和Glh连锁BA C克隆片段14E16在药用野生稻中同样也是作为一个克隆片段存在。
本研究中, RT SV 和G lh被定位于药用野生稻的短臂和栽培稻的短臂中部, 而在栽培
稻中则被定位于染色体短臂的末端[ 17] ,说明可能是在长期进化过程中第 4染色体末端与
RT SV 和 Glh之间的片段发生了臂内的倒位, 而具有重要功能的片段则保留下来的结果。
本研究的结果提示我们,以栽培稻与药用野生稻含相同或类似遗传组成为依据,不仅
可以进一步阐明它们之间的亲缘关系与进化历程, 提高栽培稻这一模式植物的研究成果
在近缘种属中的通用性,加速野生遗传资源的开发利用,而且有利于促进稻属不同种之
间,甚至禾本科不同属之间大遗传体系的建立。
致谢: 感谢日本 Kyushu 大学 Kurata 教授、美国 Cornell大学 McCouch 教授、Wisconsin 大学 Jiang
Jiming 教授、中国水稻研究所郑康乐研究员提供宝贵的资料和材料。
Acknowledgement : Pr ofessor Kura ta, Kyushu Univ ersit y in Japan, P ro fesso r McCouch, Univ ersit y
Cornell in U . S ., P ro fesso r Jiang Jiming , Univ ersity W isconsin in U . S., Pr ofessor Zheng Kangle, Chinese
National R ice Insititute pr ov ided precious ma terials and refer ences.
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