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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第10期
黄酮类化合物是多酚类次生代谢物质，由苯丙
烷代谢途径合成。黄酮类化合物具有很多重要功能，
如紫外防护、抗病原微生物、参与花色形成、植物
的育性及植物与微生物相互识别协作等。查尔酮异
构酶（Chalcone isomerase，CHI）也称查尔酮黄酮异
构 酶（Chalcone flavanone isomerase）［1］， 是 类 黄 酮
物质合成的关键酶之一［2］，可催化分子内环化反应，
使双环的查尔酮转化为有生物学活性的三环（2S）-
黄烷酮。CHI 蛋白以单体的形式普遍存在于大多数
植物中，分子量因植物组织而异，约 24-29 kD［3］。
目前，查尔酮异构酶基因在几种植物中已被克隆 ：
如雪莲［4］、矮牵牛［5］、紫花苜蓿［6］、百合［7］、水稻［8］、
马铃薯［9］等。CHI 基因表达量的高低不仅对花色影
收稿日期 ：2014-04-28
基金项目 ：国家自然科学基金项目（31172002）
作者简介 ：刘丹，女，博士研究生，研究方向 ：植物分子生物学 ；E-mail ：mdjliudan@126.com
通讯作者 ：吴凤芝，女，博士，教授，研究方向 ：设施园艺与蔬菜生理生态 ；E-mail ：fzwu2006@aliyun.com
分蘖洋葱查尔酮异构酶基因的克隆及表达载体的构建
刘丹  吴凤芝
（东北农业大学园艺学院，哈尔滨 150030）
摘 要 ： 旨在得到分蘖洋葱查尔酮异构酶基因，探明该基因的功能。克隆查尔酮异构酶基因并构建了其超表达和干扰载体，
以期得到用于研究查尔酮异构酶基因功能的表达载体。从分蘖洋葱叶片中克隆得到查尔酮异构酶基因 cDNA 全长 743 bp，GenBank
登录号为 KJ489062。结果显示，该基因 633 bp 的开放读码框编码 210 个氨基酸的多肽序列。将 PCR 扩增克隆得到的分蘖洋葱查
尔酮异构酶基因片段连接到干扰载体 pCAMBIA1301 和超表达载体 SOL2095 中，成功构建了 35S 启动子控制的植物表达双元载体
pCAMBIA1301-CHI 和 SOL2095-CHI。
关键词 ： 分蘖洋葱 查尔酮异构酶 基因克隆 载体构建
Cloning of Chalcone Isomerase Gene from Potato Onion and Plant
Expression Vector Construction
Liu Dan Wu Fengzhi
（Horticulture College，Northeast Agricultural University，Harbin 150030）
Abstract: To clone and analyse the function of the potato onion chalcone isomerase gene, we generated CHI over-expression construct
and RNAi construct. Full-length CHI gene is 743 bp, and the GenBank accession number is KJ489062. Results showed that, CHI gene open
reading frame contain 633 bp, translating into 210 amino acids. Full-length CHI gene and the fragment of CHI gene for silencing were amplified
by PCR on complementary DNA（cDNA）, then PCR fragment was transferred to the binary vector under the control of 35S.
Key words: Potato onion Chalcone isomerase Gene cloning Vetor construction
响大，同时也会影响到黄酮类代谢产物的合成。
分蘖洋葱（Allium cepa var. agrogatum Don.）俗
称毛葱，为百合科葱属草本植物。其适应性强，高
产、耐贮、供应期长，是黑龙江省传统的优良农家
品种，在广大农村多有种植。其鳞茎中含有特殊辛
辣味的挥发性硫化物，具有杀菌消毒作用，亦是类
黄酮含量较高的蔬菜种类之一，生产中常被用于间、
混、套作，用来减轻连作障碍问题［10］。近年来的研
究表明，基因表达产物可通过根系分泌物进入土壤
中，进而对土壤生态系统产生影响［11］。本研究利用
基因手段调控查尔酮异构酶的表达，验证其对土壤
微生物群落和多样性的影响，克隆分蘖洋葱查尔酮
异构酶基因，进行序列分析，确定该酶的功能相关
2014年第10期 89刘丹等：分蘖洋葱查尔酮异构酶基因的克隆及表达载体的构建
结构域，并分别构建该基因的过表达载体和 RNAi
表达载体，旨在为进一步探索 CHI 基因在分蘖洋葱
中的功能，以及在转基因植物中的应用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
植物材料分蘖洋葱来源于黑龙江省五常市红
七社村。农杆菌 EHA105、GV3101，植物表达载体
包括超表达载体 pDONR207、SOL2095，干扰载体
pBluescript SK、pCAMBIA1301 由本实验室保存。大
肠杆菌 DH5α、载体 pMD18-T 购自大连宝生物公司。
试验于 2013 年 3月-11 月在东北农业大学园艺学院
完成。
1.2 方法
1.2.1 3RACE 的 扩 增 以 Trizol 法 提 取 分 蘖 洋 葱
叶片总 RNA，根据本实验室建立的分蘖洋葱转录组
的测序结果，在开放阅读框设计 3 引物。FACE1 ：
5-AGTTTGGCCTGCAAGTAGGATC-3 ；FACE 2 ：
5-GGACAGATTAGTCTCCTATGAC-3 分别与通用引
物 5-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3 进行巢式 PCR
的 扩 增 获 得 3 序 列。PCR 程 序 为 ：94℃ 3 min ；
94℃ 30 s，55℃ 40 s，72℃ 40 s，35 个循环 ；72℃
10 min。扩增产物在 1.0% 琼脂糖凝胶中进行电泳，
用凝胶成像分析系统进行拍照及分析。扩增产物按
照 BioTeke 公司的凝胶回收试剂盒的使用说明进行
回收。回收目的片段连接到 TaKaRa 公司 pMD18-T
载体。连接产物转化感受态大肠杆菌 DH5α，进行
阳性克隆筛选。阳性克隆由上海生物工程有限公司
进行序列测定。
1.2.2 生物信息学分析 将克隆基因测序结果提
交 NCBI 进行 BLAST 检索，确认克隆得到了查尔酮
异构酶基因。蛋白功能结构域、电荷、分子量、等
电点等预测分别使用 ExPASy 蛋白质组分析工具
（http：//www.expasy.ch/tools/）中的 ProtParam（http：//
web.expasy.org/protparam/）和 NCBI 软件进行分析。
1.2.3 基因的克隆
1.2.3.1 CHI 基因 cDNA 全长的克隆 根据 Gateway
克隆技术设计 CHI 全长的引物序列，attB1-CHI-F ：
5-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTATGG
AGTCGAAGATGATC-3 ；attB1-CHI-R ：5-GGGGACC
ACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCAGCGTCCGATAAC
ATTAATC-3（下划线为 Gateway 的接头序列）。采用
Platinum Pfu DNA 聚合酶，反应条件 ：94℃ 3 min ；
94℃ 30 s，55℃ 40 s，72℃ 50 s，35 个 循 环 ；72℃
10 min。琼脂糖凝胶电泳检测产物，进行纯化回收。
1.2.3.2 CHI 基因 RNAi 片段的克隆 以 Trizol 法提
取分蘖洋葱叶片总 RNA，使用天根公司的 M-MLV
反转录获得 cDNA 第一链。逆转录试剂盒根据生物
信息学分析结果设计 RNAi 引物序列。
CHI-RNAiZ-AttB1-fw ：5-GCTCTAGACGATGC-
TATTGTGTCTGCTGA-3（下划线为 Xba I 位点）；CHI-
RNAiZ-AttB2-nostop-rev ：5-CGGGATCCTCCACCCA-
TGTACCATTTCTGT-3（下划线为 BamH I 位点）。
CHI-RNAiF-AttB1-fw ：5-CCGGGTACCGATGCT
ATTGTGTCTGCTGA-3（下划线为 Kpn I 位点）；CHI-
RNAiF-AttB2-nostop-rev ：5-ACGCGTCGACTCCACCC
ATGTACCATTTCTGT-3（下划线为 Sal I 位点）。
PCR 反应条件为 ：94℃ 3 min ；94℃ 30 s，58℃
40 s，72℃ 30 s，35 个循环 ；72℃ 10 min。用琼脂
糖凝胶电泳检测反应产物，进行纯化回收。
1.2.4 表达载体的构建
1.2.4.1 利用 Gateway 技术构建超表达载体
（1）入门载体的构建 ：BP 反应创建 Entry 载体
pDONR207 ：用回收纯化后的带有接头的 PCR 产物
与受体载体 pDONR207 进行重组反应。BP 反应体系
中包括 PCR 产物 50-150 ng、pDONR207 载体 1 μL、
5×BP ClonaseTM 反应缓冲液 2 μL、BP ClonaseTM 酶混
合物 1 μL，补充 TE 缓冲液（pH8.0）至 10 μL。反
应体系置 25℃温育 2 h 后加入 2 μL 蛋白酶 K 溶液，
37℃温育 10 min 以终止 BP 反应。将反应产物转化
至 50 μL E.coli DH5α 感受态细胞中。转化后涂布含
50 mg/L 卡那霉素的 LB 筛选培养基，37℃培养过夜。
挑取单菌落至 5 mL 含 50 mg/L 卡那霉素的液体 LB
培养基中，37℃培养过夜。
（2）LR 反 应 ：LR 反 应 的 目 的 在 于 将 已 经
重组入 Entry 载体的目标基因再克隆到表达载体
SOL2095，以产生表达克隆。LR 反应体系中包括
Entry 克隆 100-300 ng、SOL2095 载体 1 μL、5×LR
ClonaseTM 反应缓冲液 2 μL、LR ClonaseTM 酶混合物 1
μL，补充 TE 缓冲液（pH8.0）至 10 μL。反应体系
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第10期90
置 25℃温育 2 h 后加入 2 μL 蛋白酶 K 溶液，37℃温
育 10 min 以终止 LR 反应，载体构建，见图 1。
CHI-FR 是否连到 pCAMBIA1301 重组质粒上，载体
构建如图 2 所示。
2 结果
2.1 分蘖洋葱查尔酮异构酶基因及序列分析
3 RACE 方法扩增后得到 CHI 基因大小约 500
bp 左右的 3 端的目的片段（图 3）。测序后与前期
已获得的片段序列进行拼接，获得了 CHI 基因的全
长 cDNA 序列（图 4）。通过对序列中起始、终止
密码子以及各可能的 ORF 比较，该序列大小为 743
bp（GenBank 登录号 KJ489062），其中包括 ATG 起
始密码子、TAA 终止密码子。开放读码框共 633
个 碱 基， 编 码 210 个 蛋 白。 经 NCBI 查 询， 该 基
因 与 荷 兰 鸢 尾（Iris×hollandica，GenBank 登 录 号
KJ192336.1）、 石 斛 兰（Dendrobium，GenBank 登 录
号 KC345013.1）、花生（Arachis hypogaea，GenBank
登 录 号 JN412735）、 金 银 花（Lonicera japonica，
GenBank 登录号 JX068610.1）具有较高的同源性，
分别为 79%、78%、76% 和 75%，因此可认定获得
的基因为 CHI，将其命名为 AcadCHI。
2.2 AcadCHI 预测蛋白的生物信息学分析
分蘖洋葱 CHI 基因的开放阅读框为 1-633 bp
区 域， 编 码 一 条 含 210 个 氨 基 酸 的 蛋 白 质。 软
件 在 线 分 析 显 示 多 肽 分 子 量 为 23.7582 kD， 等
电 点 pI 值 为 4.86， 原 子 总 数 为 3 358， 分 子 式 为
C1068H1689N267O325S9，不稳定系数为 38.47，为稳定性
蛋白。将分蘖洋葱 CHI 氨基酸序列输入到 NCBI 网
站中分析，结果（图 5）表明，在其第 1-210 位氨
基酸构成一个结构域，高度保守结构域为第 115-
132 位氨基酸。
2.3 分蘖洋葱AcadCHI基因超表达载体的构建
将利用 Gateway 技术构建的超表达载体，测序
结果（图 6）显示，带有 B 序列接头的 AcadCHI 全
长基因的序列进行测序 PCR 反应，对反应产物进行
纯化后，结果（图 6）显示，AcadCHI 全长基因两端
NPTIII
DTR
AadA
common bom seq
hairpin
Nick
L Y EFF
SOL2095-chi
RB
P35S
A
attB1
chi
attB2
EGFP
Pnos
NPTII
LB
B8
B7
B6
B5
B4
A2
B3
B2
B1
TrfA 44
11345 bp
图 1 SOL2095-CHI 载体构建图
（3）LR 反应产物的转化及阳性克隆的鉴定 ：将
LR 反应产物转化大肠杆菌菌株 DH5α，提取质粒。
对重组质粒进行 PCR 和测序鉴定，以确定是否构建
到超表达载体中。
1.2.4.2 RNAi 载体的构建 从分蘖洋葱扩增出 CHI
保 守 区 上 的 337 bp 片 段， 正 向 片 段 连 pMD18-T
并 测 序 正 确 后 用 Xba I 和 BamH I 双 酶 切 后 连 入
pBluescript SK 载体上，进行测序和酶切验证。酶切
验证后与连有反向片段的 pMD18-T 载体分别进行
Sal I 和 Kpn I 双酶切，将反向片段回收后连接到同
样酶切的 pBluescript SK-F 质粒上。
当 CHI-R 反向片段连到上述的 pBluescript SK-F
重组质粒上时，对上述重组质粒用 Xba I 和 Kpn I 进
行 双 酶 切， 切 下 pBluescript SK-FR 目 的 片 段， 连
到经同样双酶切的 1301 质粒上，构建成重组质粒
pCAMBIA1301-FR，并用 Xba I 和 Kpn I 双酶切鉴定
p35S p35S p35S GUS
R-Borde
Kpn I Xho I
BamH I
Xba I
intronHot IIaadA
L-Border
图 2 pCAMBIA1301-CHI 载体构建图
2014年第10期 91刘丹等：分蘖洋葱查尔酮异构酶基因的克隆及表达载体的构建
已经加入了 B 序列接头，并且读码框正确，未发生 移码现象，说明超表达载体构建正确。
500
bp bp
743
图 3 AcadCHI 基因 3 RACE 的扩增 图 4 AcadCHI 基因全长的克隆
Chalcone superfamily
Query seq.
1 25 50 75 100 125 150 175 200 208
Superfamilies
图 5 AcadCHI 蛋白结构功能域的分析
GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTATGGAGTCGAAGATGATCATGGTGGATGAAATCCCTTTTCCTCATGAAAT
CACTACCACCAAGGCTTTGCCACTACTTGGCTGTGGTATAACTGATATAGAAATCCATTTCCTTCAAATCAAGCATAACT
CGATCGGCATATATCTAGACGAATGTGTCCTTGAACATCTGAGCAATTGGCAAGGTAAAAAAGGAAACGAGCTTGCCA
ACGATGATGAATTCTTCGATGCTATTGTGTCTGCTGATGTGGAAAAGTTCATCAGAGTAGTGATAATAAAAGAGATAAAA
GGAAGCCAGTTTGGCCTGCAAGTAGGATCAGCCATTAGGGACAGATTAGTCTCCTATGACAAATTCGAAGACGAAGAA
GATGAAGAACTGGAAAAAATCACAGAGTTCTTCCAAACTCCGTATTTCAAGAAGGGTTCAGTAATCACGTATCATTTTC
CTGCAAAGTCCCAAACTGCAGAATTATCATATTTAGTGGAAGGAAAGGATGAAATGAAAATTGAAGTGAAGAATGCGA
ATGTTGTAGAAATGATACAGAAATGGTACATGGGTGGATCTAGAGCTGTCTCACCGAGCACTGTGCAAAGTTTGGCTGA
AAAACTGGGATTAATGTTATCGGACGCTGACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTGGTCCCC
下划线为含 B 序列接头
图 6 含 B 序列接头的 AcadCHI 的核苷酸序列
2.4 分蘖洋葱AcadCHI基因干扰片段的克隆及载体
构建
2.4.1 正、反义片段的克隆及重组子的鉴定 以反
转录获得的 cDNA 第一链为模板，分别进行正向、
反向插入片段扩增，扩增产物长度均为 337 bp（图 7，
图 8）。重组质粒 pMD-F 和 pMD-R 分别用 Xba I /BamH
I 及 Sal I /Kpn I 双酶切，均可切下 337 bp 的目的片
段（图 9），且测序结果正确，说明载体 pMD-F 和
pMD-R 构建成功。
337
bp
M 1 2
M ：DL2000 DNA Marker ；1，2 ：AcadCHI 基因正向扩增
图 7 AcadCHI-F 的扩增
337
bp
1 2 3 4 M
M ：DL2000 DNA Marker ；1-4 ：AcadCHI 基因反向扩增
图 8 AcadCHI-R 的扩增
2.4.2 pBluescript SK-F 及 pBluescript SK-FR 质 粒 重
组子鉴定 重组质粒 pBluescript SK-F 用 Xba I/BamH
I 双酶切，在 337 bp 处得到目的条带（图 10），表明
pKA-F 载体已构建成功。重组质粒 pBluescript SK-FR
分别用 Sal I /Kpn I 双酶切（图 11），337 bp 处有目
的条带，表明 pBluescript SK-FR 载体构建成功。
2.4.3 pCAMBIA1301-RNAi-CHI 质 粒 重 组 子 的 鉴
定 重组质粒 pBluescript SK-FR 用 Xba I /Kpn I 双酶
切，在 957 bp 左右处得到目的条带（图 12），说明
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第10期92
载体构建成功，将酶切的片段和 pCAMBIA1301 载体
用 Xba I /Kpn I 双酶切得到的片段进行连接，构建得
到载体 pCAMBIA1301-RNAi-CHI。
将 重 组 质 粒 用 Xba I/Kpn I 进 行 双 酶 切 得 到
957 bp 左右的目的条带（图 13），表明 RNAi 载体
pCAMBIA1301-RNAi-CHI 已经构建成功。
3 讨论
查尔酮异构酶是黄酮类化合物代谢途径的一个
关键酶，因此，近年来该酶也成为黄酮代谢调控工
程研究的一个热点酶。Muir 等［12］发现查尔酮异构
酶（Chalcone isomerase，CHI） 是 黄 酮 类 代 谢 途 径
中的早期酶，也是增加黄酮醇产物的关键酶。本研
究首次从分蘖洋葱通过 RT-PCR 法克隆得到 cDNA，
全长约 743 bp。该基因编码 210 个氨基酸，起始密
码子为 ATG，终止密码子为 TAA，是一个完整的
CDS，GenBank 登录号为 KJ489062，多肽分子量为
23.7582 kD，等电点 pI 值为 4.86。这与已登录的大
部分常见物种的 CHI 大小基本一致，该基因与荷兰
鸢尾、石斛兰、花生和金银花具有较高的同源性，
分别为 79%、78%、76% 和 75%，确定为查尔酮异
构酶基因。
Gateway 克隆技术克服了传统的酶切和连接方
法构建载体的种种缺陷，能够将基因高效地克隆
到一个或多个与 Gateway 克隆技术兼容的载体系统
中［13］，利用 Gateway 技术构建的载体具有高拷贝数
的复制起点，可以满足大规模的克隆操作的需求［14］。
RNAi 技术因其具有高效特异和操作简便的特点已经
成为基因功能研究中一项有力的工具，以其高度专
一性和有效的干扰特性使特定基因沉默，获得功能
丧失或降低的突变体，此技术已广泛应用到水稻［15］、
拟南芥［16］等的载体构建中。本研究成功构建了控
制植物表达的干扰载体 pCAMBIA1301-CHI 和超表达
337
bp
1 2 M
M：DL2000 DNA Marker；1：重组载体 pBluescript SK-CHI Xba I /BamH I 双酶切；
2 ：重组载体 pBluescript SK-CHI Sal I /Kpn I 双酶切
图 9 pMD-F 和 pMD-R 酶切鉴定
M 1 2 3
337
bp
M ：DL2000 DNA Marker ；1-3 ：重组载体 pBluescript SK-CHI
Xba I/BamH I 双酶切
图 10 pBluescript SK-F 酶切鉴定
M 1
337
bp
M ：DL2000 DNA Marker ；1 ：重组载体 pBluescript SK-CHI
Xba I/BamH I 双酶切
图 11 pBluescript SK-FR 酶切鉴定
1 2 M
bp
957
M ：DL 2000 DNA Marker ；1.2 ：重组载体 pBluescript SK-CHI
Xba I /Kpn I 双酶切
图 12 pBluescript SK-FR 酶切鉴定
M 1 2
957
bp
M ：DL 2000 DNA Marker ；1，2 ：重组载体 pCAMBIA1301-CHI
Xba I /Kpn I 双酶切
图 13 pCAMBIA1301-CHI-FR 酶切鉴定
2014年第10期 93刘丹等：分蘖洋葱查尔酮异构酶基因的克隆及表达载体的构建
载体 SOL2095-CHI。首次克隆百合科葱属植物分蘖
洋葱的 CHI 基因并构建了其表达载体。通过两种载
体的成功构建，可以直接用于农杆菌介导的植物转
化，并为下一步试验奠定了基础。
目前对 CHI 基因的研究很多，主要运用在外源
CHI 基因的表达来提高黄酮类物质［4，5］、改变花色［17］
等研究上，利用基因手段调控查尔酮异构酶的表达，
改变植物土壤微生物多样性的研究还鲜有报道。本
研究应用 RACE 法克隆了 CHI 基因，构建了 35S 启
动子驱动的 CHI 基因的超表达和干扰两个组成型表
达载体，下一步会将 CHI 基因转化到植物中进行表
达和功能鉴定，期望能为实际生产提供理论依据。
4 结论
从分蘖洋葱叶片中克隆得到查尔酮异构酶基因
cDNA 全 长 743 bp，GenBank 登 录 号 KJ489062。 经
分析发现该基因 633 bp 的开放读码框编码 210 个氨
基酸的多肽序列。将 PCR 扩增得到的分蘖洋葱查尔
酮异构酶基因片段连接到表达载体中，成功构建了
35S 启动子控制的植物表达双元载体 pCAMBIA1301-
CHI 干扰载体和 SOL2095-CHI 超表达载体。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）