全 文 ：基因组学与应用生物学，2010年，第 29卷，第 5期，第 999-1004页
Genomics and Applied Biology, 2010, Vol.29, No.5, 999-1004
技术改进
Upgraded Tecnology
芸薹属查尔酮异构酶基因家族 RNA干扰载体的构建
曹廷 冯瑜 牛海霞 柴友荣
西南大学农学与生物科技学院,农业部生物技术与作物品质改良重点实验室,重庆市作物品质改良重点实验室,重庆市油菜工程技术研究中
心,重庆, 400716
*通讯作者, chaiyourong1@163.com
摘 要 作为类黄酮途径的第二步关键酶，查尔酮异构酶(chalcone isomerase, CHI)催化四羟基查尔酮成
为柚皮素，用于合成各种类黄酮物质，影响多种性状。芸薹属含有多种重要的油料、蔬菜和观赏植物。本研
究从甘蓝型油菜克隆了芸薹属 CHI基因家族的干扰片段 BCHII (761 bp)，采用 NcoⅠ+AatⅡ和 BamHⅠ+
XbaⅠ双酶切方案分别将其反义片段和正义片段亚克隆到植物 RNA干扰(RNAi)平台载体 pFGC5941M的启动
子与间隔区、间隔区与终止子之间，形成了 11 674 bp的 RNAi载体 pFGC5941M-BCHII (简称 pBCHII)，多种
PCR检测表明 2个片段的插入方向正确，重组载体完整，将其转化根癌农杆菌菌株 LBA4404以后获得了
工程菌株 LBA4404-pBCHII-①。本研究结果将促进研究 CHI与芸薹属异花授粉、植株色彩、黄籽和抗逆
性等性状的关系和开展相关分子育种。
关键词 芸薹属, 类黄酮, 查尔酮异构酶(CHI), RNA干扰,载体构建
Construction of a RNA Interference Vector of Brassica Chalcone Isomerase
Gene Family
Cao Ting Feng Yu Niu Haixia Chai Yourong *
Chongqing Rapeseed Technology Research Center; Chongqing Key Laboratory of Crop Quality Improvement; Key Lab of Biotechnology & Crop Qual-
ity Improvement of Ministry of Agriculture; College of Agronomy and Biotechnology, Southwest University, Chongqing, 400716
* Corresponding author, chaiyourong1@163.com
DOI: 10.3969/gab.029.000999
Abstract As the second-step key enzyme of flavonoid pathway, chalcone isomerase (CHI) catalyzes naringenin
chalcone into (2S)-naringenin, which is used to synthesize various flavonoids, influencing multiple traits. Brassica
contains many important oilseed, vegetable and ornamental crops. In this study, the 761 bp Brassica CHI gene family
RNA interference (RNAi) fragment BCHII from B. napus was cloned, a 11 674 bp RNAi vector pFGC5941M-
BCHII (simplified as pBCHII) was constructed by subcloning its sense and antisense fragments into the promot-
er- spacer and spacer-terminator insert sites of plant RNAi platform vector pFGC5941 through NcoⅠ+AatⅡ and
BamHⅠ+XbaⅠ double digestions respectively. Multiple PCR checking proved the correctness of the insert direc-
tions of the two fragments and the integrity of the recombinant vector. It was transformed into Agrobacterium
tumefaciens strain LBA4404 to form engineering strain LBA4404-pBCHII-①. The result of this paper will pro-
mote the investigating of the relationship between CHI and Brassica flavonoid traits, such as cross pollination,
plant pigmentation, yellow seed and resistances, and the related molecular breeding.
Keywords Brassica, Flavonoids, Chalcone isomerase (CHI), RNA interference, Vector construction
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基金项目：本研究由国家“863”计划(2008AA10Z152; 2006AA10Z110)和重庆市科技攻关项目(CSTC2009AB1030)共同资助
查尔酮异构酶(chalcone isomerase, CHI, EC 5.5.1.6)
是类黄酮代谢途径中的一个关键酶，它催化4,2,4,6-
四羟基查尔酮(naringenin chalcone)形成黄烷酮。CHI
催化类黄酮途径的第二步反应，所有类黄酮物质的
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
合成均需要 CHI的参与，包括花青素苷、原花青素、
黄酮醇、异黄酮、橙酮和黄烷酮等类型，它们对于植
物的生长发育具有重要的生理功能，如异花授粉、种
子保护与传播、抗病和抗逆等，也影响产量和品质
(Bednar and Hadcock, 1998;赵文军等, 2009)。已有大
量的植物完成了 CHI基因的克隆，截止 2010年 8月
15日检索 GenBank登录标题含有 chalcone isomerase
的核苷酸序列有 245条(不包括 STSs, working draft,
TPA和 patents)、蛋白质序列有 95条(不包括 TPA和
patents)。紫花苜蓿(Medicago savita)、矮牵牛(Petunia
hybrida)、普通菜豆(Phaseolus vulgaris)、水母雪莲(Saus-
surea medusa)等植物 CHI基因完成了蛋白表达酶活
性分析，普通烟草(Nicotiana tabacum)、番茄(Lycoper-
sicum esculentum)等植物完成了 CHI基因的转化，分
别引起了花色和果实类黄酮成分的改变，矮牵牛
(Petunia hybrida Vilm)、翠菊(Dianthus caryophyllus)、
康乃馨(Dianthus caryophyllus)、仙客来(Cyclamen per-
sicum)等植物 CHI基因的突变也与花色性状和类黄
酮成分紧密相关(李琳玲等, 2008)。
芸薹属(Brassica)含有丰富的油料、蔬菜和观赏
植物。在相同遗传背景下，黄籽油菜比黑籽油菜的种
皮薄，种子出油量更高，油质清澈透明；饼粕中蛋白
质含量更高，拒食性的纤维素和单宁等多酚类物质
更低，对畜禽的适口性和营养价值更高。甘蓝型油菜
(B. napus)种内缺乏天然的黄籽基因型，因此研究油
菜黄籽机理和创制黄籽新材料是油菜品质改良的重
要内容(J觟nsson et al., 1977;赵文军等, 2009)。芸薹属
植物均为典型的异花授粉，其花瓣和花粉中金黄色
色素主要为黄酮醇。芸薹属蔬菜如白菜(B. rapa)、甘
蓝(B. oleraca)等富含无色或浅黄色的黄酮醇物质，彩
色蔬菜紫菜苔(B. rapa var. purpuraria)、紫甘蓝(B. ol-
eracea var. capitata f. rubra)等含有丰富的花青素苷，
它们均在人体内具有清除自由基等多种保健功效。
芸薹属观赏园艺植物如羽衣甘蓝(B. oleracea var. a-
cephala)的彩色色素也主要是花青素苷。由此可知，
研究和操作 CHI基因，对于阐明芸薹属植物的诸多
类黄酮性状的分子机理和进行分子育种具有重要意
义。但是迄今为止芸薹属还没有全长 CHI基因家族
的系统克隆与功能解析的报道，最近才有简单序列
克隆的报道(许志茹等, 2009)，更没有 CHI基因转化
芸薹属植物的报道。
RNAi (RNA interference, RNA 干扰 )是由双链
RNA引发的转录后基因沉默机制(post-transcription-
al gene silencing, PTGS)，长 dsRNA被核酸酶降解成
21~23 bp大小的片段，与具有序列同源性的 mRNA
结合并使之降解，从而抑制基因的表达。RNAi在自
然界中广泛存在，通过基因工程使靶基因特异性地
发生沉默，可发生类似基因敲除的生物学效应，用
于研究特定基因的功能和创造性状修饰的分子育
种材料(Kawai-Toyooka et al., 2004)。在多基因家族
和多倍体植物中 RNAi技术也能很好的特意地诱发
基因沉默，为研究高等植物中基因的功能和实施分
子育种提供了有力的工具(Miki et al., 2005; Travel-
la et al., 2006)。
pFGC5941是使用较多的植物 RNAi载体，其特
点是 T-DNA区段较小(5 151 bp)，几乎不含重复序
列，以 BAR基因作为标记基因，转化中使用除草剂
Basta的筛选效率较高。但其存在一些瑕疵，本课题组
此前已将其改造成为 pFGC5941M (马丽娟等, 2010)。
基于 RNA技术，本课题组已从甘蓝型油菜、白菜和
甘蓝中分别克隆了 8条、4条和 4 条 CHI 基因的全
长序列(数据未显示)。在此基础上，本研究选择芸薹
属 CHI基因家族的特异保守区段设计引物，克隆了
芸薹属 CHI基因家族的 RNAi片段，构建了其 RNAi
载体，获得了工程菌株，该研究结果将会促进芸薹属
CHI相关的类黄酮性状机理和分子育种的研究。
1结果与分析
1.1芸薹属 CHI基因家族 RNAi片段的克隆
以甘蓝型油菜的混合器官总 cDNA为模板，采
用引物组合 FBCHII+RBCHII进行 PCR扩增，电泳
结果显示获得了一条与预期大小一致的约 1 kb的特
异性条带(图 1)。再对目的条带进行胶回收，TA克隆，
转化大肠杆菌 DH5α感受态细胞后，挑选菌液 PCR
阳性的 2个单克隆进行测序。两者测序的测序结果
显示，所获得的序列一致，含人工酶切位点的 BCHII
为 761 bp (图 2)，与 BnCHI1基因的 mRNA (数据未
显示)的 79~821 bp区段(743 bp)完全一致。
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1.2反义片段的插入——中间载体的构建
电泳结果显示，pMD19-T-BCHII质粒用限制性
内切酶 NcoⅠ+AatⅡ双酶切后，产生了一条 747 bp
的条带，与预期大小相一致，回收该目的条带，获得
反义片段 BCHIIA (图 3A)。pFGC5941M载体骨架用
NcoⅠ+AatⅡ进行双酶切，产生了 10 kb左右的开环
线状质粒(图 3B)，同时回收该条带。将反义片段
BCHIIA 与匹配末端的开环载体骨架 pFGC5941M
进行对应连接，即将干扰片段 BCHIIA反向插入到
pFGC5941M 载体的 CaMV35S 启动子与间隔区之
间，得到中间载体 pFGC5941M-BCHIIA (10.9 kb)，转
化大肠杆菌 DH5α感受态细胞，并对单克隆菌液进
行复合 PCR鉴定。引物组合 F35S3N+FBCHII和 RB
CHII+RBnPAP2I2分别从 pFGC5941M-BCHIIA单克
隆扩增出与预期 859 bp和 922 bp一致的条带，说明
中间载体已经构建成功(图 3C)。
1.3正义片段的插入——RNA干扰载体的获得
用 BamHⅠ+XbaⅠ完全双酶切质粒 pMD19-T-
BCHIIA，1%琼脂糖凝胶电泳得到与预期的 759 bp
一致的目的条带(图 4A)，回收该目的条带，并将其命
名为正义片段 BCHIIS。采用 BamHⅠ+XbaⅠ完全双
酶切中间载体 pFGC5941M-BCHIIA，回收 10.9 kb的
完全的线状片段 pFGC5941M-BCHIIA (图 4B)。将胶
回收产物 BCHIIS 与开环 pFGC5941M-BCHIIA 进
行酶连反应，将正义片段 BCHIIS正向插入到中间
芸薹属查尔酮异构酶基因家族 RNA干扰载体的构建
Construction of a RNA Interference Vector of Brassica Chalcone Isomerase Gene Family 1001
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
载体的间隔区与 OCS终止子之间，得到重组质粒
pFGC5941M-BCHII (11 674 bp)。转化大肠杆菌 DH5α
感受态细胞，获得含有 Kan抗性的单克隆菌落，并用
LB 液体培养基培养。使用引物组合 FBnPAP2I2+
RBCHII、ROCST5N+FBCHII、F35S3N+RBnPAP2I2和
FBnPAP2I2+ROCST5N分别对单克隆菌液进行 PCR
鉴定，它们分别从 pFGC5941M-BCHII的单克隆菌液
扩增得到与预期 942 bp、880 bp、1 032 bp和 1 061 bp
一致的条带(图 4C;图 4D)，既说明正义片段已按正
确方向插入到间隔区与终止子间，还说明反义片段
和正义片段插入的位置和大小均正确，即载体已经
构建成功。
1.4转化农杆菌及菌株的 PCR检测
提取 1.3结果中鉴定正确的阳性克隆子的质粒
pFGC5941M-BCHII，通过液氮冷激法转化农杆菌菌
株 LBA4404，挑取含有 Kanr+Strr+Rifr的单克隆子，
于 LB 液体培养基培养，分别采用引物组合 F35S
3N+RBnPAP2I2和 FBnPAP2I2+ROCST5N进行菌液
PCR 检测，得到与图 4D 一致的结果 (图略 )，说明
pFGC5941M-BCHII成功转化农杆菌菌株 LBA4404。
菌液中加入 50%甘油至终浓度为 25% (v/v)，保存于
-20℃，得到工程菌株 LBA4404-pBCHII-①。
本研究所构建的 RNA 干扰载体 pFGC5941M-
BCHII (简称 pBCHII)大小为 11 674 bp，质粒图谱如
图 5所示。
2讨论
CHI是类黄酮途径催化第二步的关键酶，参与
各种类黄酮物质的合成，影响多种性状。CHI基因的
突变会引起类黄酮性状的改变。同为十字花科的模
式植物拟南芥中，CHI的突变体被称作为透明种皮 5
(tt5)，种皮由深褐色变为无色，种子表现出黄籽性状
(Shirley et al., 1995)。洋葱 CHI编码区的提前终止移
码突变导致其编码蛋白失活，查尔酮衍生物超量积
累，突变体洋葱由原来的红色变为金黄色(Kim et al.,
2004)。操作 CHI基因，也可成功修饰植物的类黄酮
性状。矮牵牛 CHI基因转化番茄后，果实总黄酮醇含
量升高了 78倍，主要来源于皮层组织中槲皮素糖苷
的积累(Muir et al., 2001)。通过 RNAi抑制烟草 CHI
基因表达后，花的颜色变浅，花瓣中积累较多的查
尔酮，使花呈黄色(Nishihara et al., 2005)。水母雪莲
(Saussurea medusa)的 CHI基因转化雪莲后最好的发
根系中的芹菜素和类黄酮总量分别升高了 12倍和
4倍(Li et al., 2006a)，在烟草中超量表达后使类黄酮
总量升高到 5倍，其烟草中反义表达则使类黄酮总
量明显下降(Li et al., 2006b)。乌拉尔甘草(Glycyrrhiza
uralensis Fisch.)的 CHI基因在其自身的转基因发根
中超量表达后类黄酮总量由野生型的 0.842 g/100 g
DW升高到 1.394 g/100 g DW，如果在此基础上进行
PEG8000-YE双重激发处理，则含量进一步升高到
2.838 g/100 g DW (Zhang et al., 2009)。
RNAi在多倍体植物基因功能研究和分子育种
中同样有效(Miki et al., 2005; Travella et al., 2006)。本
课题组的研究表明，甘蓝型油菜有 8 条 CHI 基因
(BnCHI1~BnCHI8)、白菜有 4 条 CHI 基因(BrCHI1~
BrCHI4)、甘蓝有 4条 CHI基因(BoCHI1~BoCHI4) (数
据未显示)。本研究所克隆的 RNA干扰片段 BCHII
与 3个物种的 16条 CHI基因的 mRNA对应区段的
一致性为 72.7%~100.0%，因此理论上推测干扰载体
pFGC5941M-BCHII可用于甘蓝型油菜、白菜、甘蓝
等多个芸薹属物种的转基因，介导整个 CHI基因家
族的表达下调，用于揭示 CHI基因家族表达水平与
芸薹属各种类黄酮性状之间的关系，甚至可创造类
黄酮性状得到遗传修饰的新资源，比如转基因黄籽
油菜。由于在核苷酸水平上 CHI基因与非 CHI基因
之间无显著同源性，因此该载体不会引起对 CHI以
外的其它基因的非靶向沉默。
芸薹属 CHI基因家族的冗余度如何，是否有成
员产生了功能上的退化或异化，有待于设计单个成
员的特异性沉默载体进行研究。
3材料与方法
3.1菌株、质粒和生物材料
大肠杆菌(Escherichia coli)菌株 DH5α、根癌农
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杆菌菌株 LBA4404均由本实验室保存。pMD19-T
载体购自大连宝生物工程有限公司。植物 RNA干
扰基础载体 pFGC5941M 则是由本课题组在载体
pFGC5941 (购自国际拟南芥中心, Tair Accession, vec-
tor: 1004952070)的基础上改进而成。甘蓝型油菜保
持系 5B为自交 10年以上、纯合稳定的典型黑籽品
系，常规试验地正常种植，其茎、叶、花和种子等器官
的总 RNA由本实验室此前提取并保存。
3.2试剂盒和试剂
限制性内切酶为德国 Roche公司产品。TaKaRa
RNA PCR Kit (AMV) Ver. 3.0、DNA Ligation Kit Ver.
2.0、λ-HindⅢ DNAMarker为大连宝生物工程有限公
司产品。Easy-Taq DNA 聚合酶及相关 PCR 试剂、
DL2000 Plus DNAMarker为北京全式金(Transgen)产
品。胶回收(小量)试剂盒和质粒提取(小量)试剂盒为上
海华舜生物工程有限公司产品。氨苄青霉素(Amp)、卡
那霉素(Kan)、利福平(Rif)、链霉素(Str)等试剂购自上海
生工生物工程技术服务有限公司。引物合成 (表 1)和
DNA测序由上海英骏(Invitrogen)公司完成。
3.3芸薹属 CHI基因家族 RNAi片段的克隆
对本课题组已克隆的甘蓝型油菜 CHI (BnCHI)
基因家族、白菜 CHI (BrCHI)基因家族、甘蓝 CHI (BoC
HI)基因家族(数据未显示)和拟南芥 CHI的全长序列
进行多重比对，选择 CHI基因家族特异保守的区段，
设计了正向引物 FBCHII和 RBCHII。
将 5B的茎、叶、花和种子等器官的总 RNA各取
等量混合均匀，取 1 μg混合总 RNA为模板按照说
明书进行反转录，得到总 cDNA第一链。取 2.0 μL总
cDNA第一链为模板，采用引物组合 FBCHII+RBCHII
进行 50 μL标准体系 Taq PCR扩增，反应条件为：
94℃预变性 2 min；94℃变性 1 min，60℃退火 1 min，
72℃延伸 1 min，35个循环；最后 72℃延伸 10 min。
PCR产物经 1%琼脂糖凝胶电泳，GoldView染色和照
相后，在紫外观测仪中切下目的条带，进行胶回收。
将回收片段与 pMD19-T进行 10 μL标准体系
连接，构成重组载体 pMD19-T-BCHII，转化用 CaCl2
二次重悬法制备的 DH5α 感受态细胞，通过 Amp
(100 mg/L)抗性和 IPTG/X-gal蓝白斑筛选，白色菌落
克隆子的液体培养(37℃, 250 r/min, 9 h,下同)菌液采
用 PCR鉴定(程序同上,预变性增加到 5 min,循环数
为 35)，送 2个阳性克隆子测序。
3.4载体骨架的制备和反义片段的插入
将测序返回结果正确的含有 pMD19-T-BCHII
的单克隆细菌液体培养至对数晚期，抽取质粒。50μL
酶切体系，NcoⅠ+AatⅡ双酶切 pMD19-T-BCHII，其
中含质粒DNA20μg、两种酶各 10U、1×Tango Buffer。
同样采用这种方案对 pFGC5941M进行双酶切，体系
同前。37℃酶切过夜，酶切完全后进行电泳，纯化回
收反义片段 BCHIIA和开环的 pFGC5941M骨架。采
用 10 μL标准酶连体系，将回收的反义片段与载体
骨架进行连接，重组载体转化大肠杆菌 DH5α感受
态细胞，挑选 Kan+LB平板单克隆进行液体培养。以
引物组合 F35S3N+FBCHII 和 RBCHII+RBnPAP2I2
进行 PCR 鉴定，PCR 体系及程序同前的菌液 PCR
鉴定，选取全阳性的克隆子提取重组质粒，命名为中
间载体 pFGC5941M-BCHIIA。
表 1本研究所用引物
Table 1 Primers used in this study
引物名
Primer name
FBnPAP2I2
RBnPAP2I2
FBCHII
RBCHII
F35S3N
ROCST5N
序列(5-3)
Sequence (5-3)
ATTTAAATGACGTCAGG
TTTACATTCAAGACACA
GGATCCACCTAAGCATG
CATTTGAAAA
GGATCCGACGTCTTCTTC
CAACTGTCCGT
TCTAGACCATGGCCAGTT
TATCTCCTAGG
GGAAGTTCATTTCATTTG
GAGAG
GCTCAGGTTTTTTACAAC
GTGCAC
Tm值
Tm value
56.71/63.50
59.20/63.15
60.40/70.28
60.40/67.45
59.20
62.86
位置
Position
pFGC5941M
spacer 5
pFGC5941M
spacer 3
BnCHI1 mRNA
67~86 bp
BnCHI1 mRNA
809~790 bp
pFGC5941M
P-CaMV 35S 3
pFGC5941M
T-OCS 5
方向
Direction
正向
Forward
反向
Reverse
正向
Forward
反向
Reverse
正向
Forward
反向
Reverse
酶切位点
RE site
SwaⅠ, AatⅡ
BamHⅠ
BamHⅠ, AatⅡ
XbaⅠ, NcoⅠ
用途
Use
扩增间隔区,载体鉴定
Spacer amplification and
vector identification
扩增芸薹属 CHI RNAi
片段,载体鉴定
Amplification of Brassica
CHI RNAi fragment and
vector identification
载体鉴定
Vector identification
载体鉴定
Vector identification
芸薹属查尔酮异构酶基因家族 RNA干扰载体的构建
Construction of a RNA Interference Vector of Brassica Chalcone Isomerase Gene Family 1003
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
3.5中间载体的酶切和正义片段的插入
用 BamHⅠ+XbaⅠ完全双酶切质粒 pMD19-T-
BCHII，体系同前，电泳后回收正义片段 BCHIIS。同
样，采用 BamHⅠ +XbaⅠ完全双酶切中间载体
pFGC5941M-BCHIIA 的质粒，回收开环的中间载
体。将回收的正义片段与对应的开环中间载体进行
10 μL标准体系连接，重组载体转化 DH5α，以抗 Kan
的单克隆菌落的培养菌液为模板，使用引物组合 FBn-
PAP2I2+RBCHII、ROCST5N+FBCHII、F35S3N+ RBn-
PAP2I2、FBnPAP2I2+ROCST5N 分别对单克隆菌液
进行 PCR 鉴定，PCR 体系及程序同前的菌液 PCR
鉴定，全阳性克隆子含有目标 RNAi载体，命名为
pFGC5941M-BCHII (简称为 pBCHII)。
3.6 RNAi载体转化根癌农杆菌
提取 3.5的阳性克隆子的质粒 pFGC5941M-BC
HII，采用液氮冷激法转化根癌农杆菌 LBA4404感受
态细胞，涂布于含 Kan (100 mg/L)、Rif (40 mg/L)和
Str (20 mg/L)的 LB平板，28℃倒置培养 2 d，至长出
直径 2 mm的菌落，挑取抗性菌落接种于含同种抗生
素的 LB液体培养基中培养(28℃, 250 r/min, 36 h)，单
克隆菌液的 PCR检测方案与 3.5相同，全阳性的克
隆子为工程菌株。
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