全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 11 期 2013 年 6 月

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金荞麦查尔酮异构酶的基因克隆及其花期表达与黄酮量分析
雒晓鹏，白悦辰，高 飞，李成磊，陈 惠，吴 琦*
四川农业大学生命科学与理学院，四川 雅安 625014
摘 要：目的 获取金荞麦总黄酮合成途径的关键酶查尔酮异构酶（chalcone isomerase，CHI）基因的全长序列，并进行序
列分析；对花期金荞麦 CHI 基因在各组织中的表达与总黄酮量进行分析。方法 利用同源克隆技术获得金荞麦查尔酮异构
酶基因（FdCHI）的 cDNA 序列；采用半定量 RT-PCR 对 CHI 表达量进行分析，并采用 AlCl3法测量总黄酮量。结果 金荞
麦 FdCHI 基因 cDNA 包含一个 750 bp 的 ORF，编码 249 个氨基酸，命名为 FdCHI。生物信息学分析表明该编码蛋白与其他
植物 CHI 氨基酸序列同源率较高。FdCHI 在花期金荞麦不同组织中的表达量分析表明，其表达量花＞根＞叶＞茎，总黄
酮量为花＞叶＞茎＞根。结论 在金荞麦中首次获得CHI基因的 cDNA序列，编码蛋白具有CHI同源蛋白的典型特征。FdCHI
基因在金荞麦茎、叶和花中的表达量与总黄酮量具有相关性，但在根中表达量与总黄酮量相关性较小。
关键词：金荞麦；查尔酮异构酶；基因克隆；表达水平；总黄酮
中图分类号：R282.12 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2013)11 - 1481 - 05
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2013.11.023
Gene cloning and expression level of chalcone isomerase during florescence
and content of flavonoids in Fagopyrum dibotrys
LUO Xiao-peng, BAI Yue-chen, GAO Fei, LI Cheng-lei, CHEN Hui, WU Qi
College of Life and Basic Sciences, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China
Abstract: Objective To clone and analyze the full-length cDNA of chalcone isomerase (CHI) gene from Fagopyrum dibotrys
(FdCHI). To analyze the expression of CHI and the total flavonoids content during florescence of F. dibotrys. Methods The cDNA
sequence of CHI was cloned by homology cloning from F. dibotrys. The expression of CHI was analyzed in the different tissues during
florescence by semi-quantitative RT-PCR. The content of total flavonoids was measured by AlCl3 method. Results The open reading
frame (ORF) of FdCHI was 750 bp and encoded a protein with 249 amino acids. Bioinforamtion analysis suggested that the amino acid
sequence of FdCHI had the high homology with those in other plants. Gene expression analysis showed that FdCHI was highly
expressed in the flowers, followed by the roots and leaves, while lower in the stems. The content of total flavonoids was the highest in
the flowers then the leaves and stems, and the lowest was in the roots. Conclusion The cDNA sequence of FdCHI is firstly obtained
from F. dibotrys and its coding protein has the typical characteristic of CHI homologous protein. The gene expression of FdCHI shows
the same to the total flavonoids content in the stems, leaves, and flowers, but different in the roots of F. dibotrys.
Key words: Fagopyrum dibotrys (D. Don) Hara; chalcone isomerase; gene cloning; expression level; total flavonoids

金荞麦 Fagopyrum dibotrys (D. Don) Hara 是蓼科
（Polygonaceae）荞麦属 Fagopyrum Mill. 多年生草本
植物，广泛分布于南亚各国，我国主要分布在西南地
区[1-2]。《本草纲目》中记载金荞麦性寒、味酸苦，具
有清热解毒、祛风利湿的功效。现代医学研究表明，
金荞麦块根提取物具有抑制肿瘤细胞和消炎抗菌等
作用[2]。更重要的是金荞麦含有丰富的黄酮类化合物，
如原矢车菊素、槲皮素等成分，具有调脂降糖和镇咳
祛痰等多种药理作用[3-4]。金荞麦还是一种药用与饲料
用兼备的资源植物，除其块根能入药，子粒具有独特
的营养价值和保健功能外，茎叶也是高产优质的牧草
资源[5]。随着对金荞麦价值的不断认识，需求量也大
大增加，过度的采挖已使野生金荞麦资源急剧减少，
我国已将其列为国家二级保护植物。
植物黄酮由苯丙烷类代谢途径合成，该途径起
始于苯丙氨酸解氨酶催化 L-Phe 脱氨，并在多种酶

收稿日期：2013-02-27
作者简介：雒晓鹏（1991—），男，生物科学专业学生。E-mail: luoxiaopenglxp@163.com
*通信作者 吴 琦 E-mail: wuqiwq@yahoo.cn
网络出版时间：2013-03-28 网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/12.1108.R.20130328.1113.001.html
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参与下逐步经环化、异构、修饰和糖基化等步骤，
形成种类繁多的黄酮类化合物[6]。查尔酮异构酶
（chalcone isomerase，CHI；EC 5.5.1.6）催化黄
酮母环成环之后的第一个异构反应，是将 1 分子
的查尔酮异构为 1 分子的黄烷酮[7]。植物中，CHI
与查尔酮合酶（CHS）一同控制着进入黄酮合成的
代谢流[8]，是黄酮生物合成量的瓶颈和关键节点[9]。
目前，CHI 的 cDNA 序列已在拟南芥 Arabidopsis
thaliana (L.) Heynh.、大豆 Glycine max (L.) Merr.、银
杏 Ginkgo biloba L.、番茄 Lycopersicon esculentum
Mill. (Solanum lycopersicum L.) 和葡萄 Vitis vinifera
L. 等多种植物中得到克隆[10]，各植物中 CHI 酶
学特征和表达调控机制间的差异，正是引起黄酮
类物质种类和质量分数差异的主要原因。降低
CHI 的活性就会导致植物中查尔酮大量积累，总
黄酮量显著降低[11-12]。因此，了解克隆金荞麦查
尔酮异构酶（FdCHI）基因表达与黄酮调控之间的
关系，对进一步提高金荞麦的药用价值和促进其
野生资源保护具有重要意义。
1 材料及主要试剂
2012 年 10 月中旬样品采集于雅安老板山，经
四川农业大学植物学教研室袁明副教授鉴定为金荞
麦 Fagopyrum dibotrys (D. Don) Hara。大肠杆菌
Escherichia coli 菌株 DH5α 由生物化学与分子生物
学实验室保存。RNA 提取试剂植物 RNAout 试剂盒
（天泽基因公司）、RevertAidTM First Strand cDNA
Synthesis Kit（Fermentas 公司）、DNA 聚合酶、PCR
Master Mix（Bio Med 公司）、T4 DNA 连接酶，其
他化学药品均为进口或国产分析纯试剂。
2 方法
2.1 金荞麦总 RNA 的提取及 cDNA 第一链的合成
按照天泽基因公司“植物 RNAout 试剂盒”说明
书，分别提取花期金荞麦根、茎、叶和花的总 RNA。
利用 RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit
（Fermentas 公司）试剂盒以 Oligo-dT 和 Random
Hexamer Primer 为引物，进行 cDNA 的反转录，将
合成的 cDNA 第一链保存于−20 ℃冰箱中，备用。
2.2 FdCHI 基因 cDNA 序列的克隆
参照苦荞 FtCHI 基因 cDNA 全长序列，设计并
合成一对特异性引物 CHIf 和 CHIr，以合成的 cDNA
为模板，进行 PCR 扩增，回收 PCR 片段，T 载体
克隆，选择 3 个菌落 PCR 检测为阳性的克隆子，送
Invitrogen 基因有限公司测序。
2.3 FdCHI 基因核酸与蛋白序列分析
所得测序结果使用 NCBI 在线工具 BLAST
进行序列比对。采用 Expacy 网站 PROSITE 数据
库进行结构域和生物学活性位点识别。采用
Clustalx1.81 软件进行植物 CHI 蛋白氨基酸序列
的多重序列比对，采用 MEGA 4.1 软件经邻接法
构建系统发育进化树，并以 Bootstrap 对进化树
构 建 结 果 进 行 验 证 。 采 用 SOPMA
（http://pbil.ibcp.fr）对 FdCHI 蛋白质二级结构进
行预测；利用 Swiss-Model 在线同源建模软件进
行蛋白质三级结构同源建模。采用 Expacy 网站
在线工具 ProtParam 对 FdCHI 蛋白进行理化性质
分析。
2.4 花期 FdCHI 的半定量 RT-PCR
设计一对特异引物 CHIsmf 和 CHIsmr，以金荞
麦持家基因组蛋白编码基因 H3 为内参（表 1），对
花期 FdCHI 基因进行半定量 RT-PCR，PCR 产物用
琼脂糖凝胶电泳检测，利用软件 Quantity one
（version 4.6.2）分析，计算光密度值。
表 1 引物序列及用途
Table 1 Primer sequences and application
引物名称 引物序列 引物用途
CHIf 5’-CACAGACACTACATTCACTACCGACA-3’
CHIr 5’-AAATGCCAAATCACATTGAATCATTC-3’
FdCHI cDNA
扩增
CHIsmf 5’-TCCATAGCCATTGAGGATTTCGTCT-3’
CHIsmr 5’-CGTTTTCAATCACAGCAACATCAGC-3’
FdCHI 半定量
PCR 引物
H3-semf 5’-GAAATTCGCAAGTACCAGAAGAG-3’
H3-semr 5’-CCAACAAGGTATGCCTCAGC-3’
H3半定量PCR
引物

2.5 花期金荞麦总黄酮的提取及定量测定
采用 Liu 等[13]的方法略作改动提取金荞麦花期
各组织总黄酮。采用 AlCl3 法[14]，建立芦丁标准曲
线，测定总黄酮量。
3 结果与分析
3.1 金荞麦总 RNA 的提取
提取的金荞麦总 RNA 电泳结果显示，28S 及
18S rRNA 两条主带清晰可见，见图 1。二者条带亮
度比大致符合 2∶1，且不含有 DNA 及蛋白质杂带，
可用于 RT-PCR 制备 cDNA 第一链。
3.2 FdCHI 基因 cDNA 序列的克隆
以合成的 cDNA 第一链为模板，PCR 扩增出一
条大小约为 800 bp 的特异条带，见图 2。测序结果
经 Blast 比对显示，FdCHI 与 Genbank 中甜荞 FeCHI
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图 1 金荞麦总 RNA 的提取
Fig. 1 Total RNA extracted from F. dibotrys

图 2 FdCHI 的克隆
Fig. 2 FdCHI cloning
（ADT63063）和苦荞 FtCHI（AEF30419）相似度最
高，分别为 97%和 92%，与其他植物 CHI 的相似度
为 53%～66%。表明获得了编码 FdCHI 基因完整
ORF 的 cDNA 序列。
3.3 FdCHI 编码蛋白的序列分析
3.3.1 FdCHI 编码的氨基酸序列 利用 Dnaman 软
件，对 FdCHI 的 ORF 序列进行翻译，其编码的氨基
酸序列为 MASSITVSSIAIEDFVFPPSVRPPATDKSF
FLGGAGVRGLTINGTFISFTAIGIYFEETAVASLAD
KWKGKSATELTESVEFFRDVVTGQFEKFIQITML
KPLTGAQYSEKVSENCVAIWKAIGIYSEAEEKAIE
KFTEIFKEQNFPPGTSILFKQCAPKSLRIAFGKHD
AIPEADVAVIENGPLSQSVLESIIGKNGVSPAAKES
LAVRLHELLNPAKVANGEAEAETKVANGEAEAV
TKENGVEIKE（每个字母均对应相应氨基酸）。
3.3.2 FdCHI 的进化分析 20 种植物来源的 CHI
蛋白序列经 Clustalx 1.81 软件多序列比对后表明，
用于比对的序列相似性总体较高（ 48.15%～
87.11%），且能够比较容易地鉴定出保守区域。比
对结果经 MEGA 4.0 软件邻接（Neighbour Joining，
NJ）法构建系统发育树，结果见图 3。由图可知，

图 3 FdCHI 与其他植物来源 CHI 蛋白序列的系统进化树
Fig. 3 Phylogenetic tree based on amino acid sequences
of FdCHI and other plants
十字花科的萝卜和拟南芥进化关系较近，单子叶洋
葱和水稻构成一个分支，表明它们进化关系比较近。
金荞麦和苦荞同源关系最近，与甜荞次之。
3.3.3 FdCHI 的生物信息学分析 SOPMA 预测
表明，FdCHI 二级结构以 α-螺旋与无规则卷曲为
主，其中 α-螺旋为 46.59%，β-转角为 8.03%，无
规 则 卷 曲 为 27.31% ， 延 伸 链 为 18.07% 。
Swiss-Model 对 FdCHI 建模表明，该蛋白为一个
单体蛋白，其中保守氨基酸 T48、Y106 和 N113 构
成活性中心[15]，表明 FdCHI 可能与拟南芥 CHI
有相似的催化机制。ProtParam 分析表明，FdCHI
蛋白分子式为 C1209H1907N305O371S4，相对分子质
量为 2.678×104，理论 pI 值为 4.97。不稳定常数
II（instability index II）为 30.58，在酵母和大肠
杆菌体内半衰期分别超过 20 h 和 10 h，为稳定型
蛋白。
3.4 花期 FdCHI 半定量 RT-PCR 与总黄酮的测定
3.4.1 FdCHI 的半定量 RT-PCR 花期金荞麦不同
部位 FdCHI 的半定量 RT-PCR 结果见图 4。经
Quantity one（version 4.6.2）软件分析，并进行高斯
建模（Gauss-Model）计算光密度值，各基因表达量
用相对光密度值 ROD（optical density of gene/optical
density of H3）表示。分析表明，FdCHI 基因在根、
茎、叶和花中均有表达，具有组织特异性。其中花
中表达量最高，相对表达量为 66.16%；根和叶中相

28 S
18 S
根 茎 叶 花
800 bp
500 bp

M 1
牡丹 JN105297.1
金花茶 HQ269805.1
雪莲 AF509335.1
葡萄 XM_002282072.2
苹果 FJ817485.1
沙梨 GU390544.1
龙眼 JF718281.1
萝卜 AF031921.1
拟南芥 M86358.1
甜荞 HM149788.1
金荞麦
苦荞 HQ003251.1
洋葱 AY700850.1
水稻 AF474922.1
大花美人蕉 DQ160232.1
蝴蝶兰 EF570112.1
矮牵牛 AB5430 54.1
玉米 NM_001156113.1
紫花苜蓿 JN099384.1
小麦 AB029934.1
68
12
10
14
46
59
69
100
94
27
99
100
100
51
63
100
92
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图 4 花期 FdCHI 基因的半定量 RT-PCR 分析
Fig. 4 Semi-quantitative RT-PCR of FdCHI
during florescence
对表达量分别为 41.7%和 40.1%；茎中表达量最低，
相对表达量仅为 23.2%。
3.4.2 总黄酮的测定 以芦丁质量浓度为横坐标（X），
吸光度（A）值为纵坐标（Y），建立芦丁标准曲线，
回归方程为 Y＝3.014 8 X＋0.001 5，r＝0.999 6。金
荞麦花期各个组织的黄酮量测定表明，花中总黄酮
量最高，为 8.781%，其次为叶和茎，分别为 6.071%
和 1.851%，根部的总黄酮量最低仅为 0.606%，见
图 5。可见，总黄酮量与 CHI 的表达有一定的相关
性，但也具有差异。


图 5 花期金荞麦总黄酮的测定
Fig. 5 Determination of total flavonoids
in F. dibotrys during florescence
4 讨论
本实验克隆所得FdCHI基因 cDNA序列经测序
及核酸、蛋白序列比对搜寻结果显示，FdCHI 蛋白
序列与苦荞和甜荞相似度达 97%和 92%。这说明金
荞麦与苦荞的同源关系最近，和甜荞次之，与
Sharma 的观点一致[16]。
植物中 CHI 的表达量与黄酮量密切相关：
Nishihara等[17]运用RNAi抑制烟草CHI的表达后发
现花瓣中的黄酮类物质减少；大麦和洋葱 CHI 基因
缺失突变体的黄酮量急剧下降[18]；相反，过量表达
CHI或提高CHI酶的活性可以使植物中的黄酮量显
著提高。在番茄中过表达 CHI 基因，可使番茄果皮
中黄酮量增加 76 倍[19]；在转基因烟草中 CHI 活性
和总黄酮量正相关[20]。本研究中，FdCHI 在金荞麦
花、叶和茎的表达量与总黄酮量变化趋势一致，表
明这些组织中其表达可能与金荞麦总黄酮的合成和
积累密切相关；该基因在根中的表达量与总黄酮量
变化趋势差异较大，其原因可能与黄酮在金荞麦不
同组织的转运相关[6,21-22]。
近年来研究表明，金荞麦籽粒含有丰富的生物
类黄酮，其质量分数接近苦荞，且超过甜荞[16]，可
作为优质黄酮类物质的天然来源，具有很高的经济
价值[23]。因此，如能通过现代生物技术进一步提高黄
酮类功效物质在金荞麦中的量，将能够更深层次地挖
掘金荞麦在保健品和功能食品方面的巨大潜力。
参考文献
[1] 中国植物志 [M]. 北京: 科学出版社, 2004.
[2] 刘光德, 李名扬, 祝钦泷, 等. 资源植物野生金荞麦的
研究进展 [J]. 农业资源与环境科学 , 2006, 22(10):
380-390.
[3] 赵 钢, 唐 宇, 王安虎. 中国的荞麦资源及其药用价
值 [J]. 中国野生植物资源, 2002, 21(5): 39-40.
[4] 吴 清, 梁国鲁. 金荞麦野生资源的开发与利用 [J].
中国野生植物资源, 2001, 20(2): 27-28.
[5] 唐华彬, 尹迪信, 罗红军, 等. 牧草作物金荞麦的引种
比较试验 [J]. 贵州农业科学, 2007, 35(2): 51-53.
[6] Grotewold E. The Science of Flavonoids [M]. Berlin:
Springer, 2007.
[7] 李 莉, 孙 欣, 马君兰, 等. 异黄酮合成代谢调控关
键酶 CHS、CHI 的特性与研究前景 [J]. 大豆科学,
2007, 26(5): 762-765.
[8] Jez J M, Bowman M E, Dixon R A, et al. Structure and
mechanism of the evolutionarily unique plant enzyme
chalcone isomerase [J]. Nat Struct Biol, 2000, 7(9):
786-791.
[9] 李琳玲, 程 华, 许 峰, 等. 植物查尔酮异构酶研究
进展 [J]. 生物技术通讯, 2008, 19(6): 935-937.
[10] Joseph M J, Joseph P N. Reaction mechanism of chalcone
isomerase [J]. J Biol Chem, 2002, 277(2): 1361-1369.
[11] Forkmann G, Dangelmayr B. Generic control of chaleone
isomerase activity in flowers of Dianthus caryophyllus
[J]. Biochem Genet, 1980, 18(5/6): 519-527.

0.8
0.6
0.4
0.2
0
相
对
表
达
量

根 茎 叶 花
FdCHI
β-actin

10
8
6
4
2
0
总
黄
酮
/
%

根 茎 叶 花
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[12] Nishihara M, Nakatsuka T, Yamamura S. Flavonoid
components and flower color change in transgenic tobacco
plants by suppression of chalcone isomerase gene [J]. Fed
Eur Biochem Societ Lett, 2005, 579(27): 6074-6078.
[13] Liu B, Zhu Y. Extraction of flavonoids from flavonoid-
rich parts in tartary buckwheat and identification of the
main flavonoids [J]. Food Eng, 2007, 78(2): 584-587.
[14] Kreft S, Štrukelj B, Gaberščik A, et al. Rutin in
buckwheat herbs grown at different UV-B radiation
levels: Comparison of two UV spectrophotometric and an
HPLC method [J]. Exp Bot, 2002, 53(375): 1801-1804.
[15] Jez J M, Bowman M E, Noel J P. Role of hydrogen bonds
in the reaction mechanism of chalcone isomerase [J].
Biochemistry, 2002, 41(16): 5168-5176.
[16] Sharma T R. Species relationships in Fagopyrum revealed
by PCR-based DNA fingerprintting [J]. Theor Appl
Genet, 2002, 105(2): 306-312.
[17] Nishihara M, Nakatsuka T, Yamamura S. Flavonoid
components and flower color change in transgenic
tobacco plants by suppression of chalcone isomerase gene
[J]. FEBS Lett, 2005, 579(27): 6074-6078.
[18] Kim S, Jones R, YooK S, et al. Gold color in onions
(Allium cepa): A natural mutation of the chalcone
isomerase gene resulting in a premature stop codon [J].
Mol Genet Genomics, 2004, 272(4): 411-419.
[19] Muir S R, Collins G J, Robinson S, et al. Overexpression
of petunia chalcone isomerase in tomato results in fruit
containing increased levels of f1avonols [J]. Nat
Biotechnol, 200l, 19(5): 470-474.
[20] Li F, Jin Z, Qu W, et al. C1oning of a cDNA encoding the
Saussurea medusa chalcone isomerase and its expression
in transgenic tobacco [J]. Plant Physiol Biochem, 2006,
44(7/9): 455-461.
[21] 赵坤霄, 吴红赤. 黄酮类化合物相关的转运蛋白研究
现状 [J]. 中国药学杂志, 2012, 47(7): 486-488.
[22] 鲁鑫焱, 蒋惠娣, 增 塑. 黄酮类化合物在 Caco-2 细
胞模型上的转运和代谢研究进展 [J]. 中国药学杂志,
2006, 41(17): 1289-1292.
[23] Van A J, Koes R E, Spelt C E, et al. Cloning of the two
chalcone flavanone isomerase genes from Petunia hybrida:
coordinate, light-regulated and differential expression of
flavonoid genes [J]. EMBO J, 1988, 7(5): 1257-1263.