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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(5):120-127
半 定 量 PCR（Semi-quantitative RT-PCR） 和 实
时 定 量 PCR（quantitative real-time PCR） 即 Q-PCR
是对来自不同组织的 mRNA 进行定量的有效方法，
内参基因可以矫正样品之间的差异，因此对于上
述两种分析方法选择合适的内参基因是非常必要
的［1］。在植物基因的表达分析研究中比较常用的内
参 基 因 是 看 家 基 因（house-keeping gene）， 因 为 看
家基因的表达水平受环境影响较小，主要包括肌动
蛋白基因（ACT）、甘油醛 -3-磷酸脱氢酶（G3PDH/
GAPDH）、18S 和 28S 核糖体 RNA 基因（18S rRNA、
收稿日期 ：2014-10-15
基金项目 ：国家自然科学基金资助项目（31100511），河南省高校青年骨干教师计划资助项目（2010GGJS-161），南阳师范学院博士科研启
动资助项目（nynu200746），2015 年度研究生创新基金项目（2015CX008）
作者简介 ：李勇鹏，男，硕士研究生，研究方向 ：园林植物遗传育种 ；E-mail ：daniel_lee1217@yeah.net
通讯作者 ：杜丽，女，博士，副教授，研究方向 ：园林植物遗传育种 ；E-mail ：dldldlucky@163.com
香樟 Actin 基因的克隆及表达分析
李勇鹏  张力维  姚瑶  黄蕊  杜丽
（南阳师范学院生命科学与技术学院，南阳 473000）
摘 要 ： Actin 作为一个看家基因，经常在实时定量 PCR 中被用作内参对不同样品中的 mRNA 进行定量，因此在基因表达
分析中扮演重要的角色。利用同源克隆的方法，根据 GenBank 中已经公布的其他植物的 Actin 基因的保守序列设计简并引物，采
用 RT-PCR（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction）技术从香樟中获得了 4 个 cDNA 片段。分子生物学分析软件分析结果
显示，4 个片段大小为均为 998 bp，编码 332 个氨基酸 ；同源性分析表明，所获得的片段属于 Actin 亚家族，分别命名为 CcACTa、
CcACTb、CcACTc 和 CcACTd 并提交 GenBank（登录号：KM086736、KM086737、KM086738 和 KM086739）。实时定量 PCR 结果显示，
CcACTc 在根、茎、叶及低温处理的叶片中表达量相对稳定，可以作为候选内参基因。
关键词 ： 香樟 ；Actin ；基因克隆 ；表达分析 ；实时定量 PCR
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.019
Cloning and Expression Analysis of Actin Gene in Cinnamomum
camphora
Li Yongpeng Zhang Liwei Yao Yao Huang Rui Du Li
（School of Life Science and Technology，Nangyang Normal University，Nanyang 473000）
Abstract: As a house-keeping gene, Actin has been always being used as an internal standard to normalize mRNA levels between
different samples by quantitative real-time PCR, thus plays an important role in gene expression analysis. In this research, through a method of
homology cloning, a pair of degenerate primers were designed based on the conserved sequences of Actin genes from other plants submitted to
GenBank, and then 4 cDNA fragments from Cinnamomum camphora were obtained using RT-PCR. Molecular biological analysis showed that,
each of the 4 cDNA fragments was 998 bp and encoded a putative protein of 332 amino acids. Moreover, according to the homology analysis,
the 4 cDNA fragments belonged to Actin subfamily, and they were named CcACTa, CcACTb, CcACTc and CcACTd, and deposited in GenBank
（Accession number ：KM086736 KM086737 KM086738 and KM086739）. Quantitative real-time PCR results revealed that the expression
level of CcACTc in different organs such as root, stem, leaf and leaves under low temperature treaments was relatively stable. It could serve as a
candidate reference gene.
Key words: Cinnamomum camphora ；Actin ；gene cloing ；expression analysis ；quantitative real-time PCR
2015,31(5) 121李勇鹏等：香樟 Actin基因的克隆及表达分析
28S rRNA）及肽链伸因子（EF1a）基因等［2］。其中
Actin 是一个比较常用的内参基因，该基因在真核细
胞中普遍存在，并且编码一类高度保守的蛋白，所
编码蛋白是细胞骨架的基本组成成分之一，参与许
多重要的亚细胞进程，诸如细胞分裂与伸长、胞吞
作用、细胞信号转导、重力感应、极性生长、细胞
器运动和程序性细胞死亡等，因此在植物发育和形
态发生中发挥重要作用［3-6］。在肌动蛋白结合蛋白
（Actin-binding protein）的作用下，肌动蛋白微丝的
长度、极性、稳定性和三维结构不断变化［7，8］。自
从 1963 年，Yan 和 Shi 第一次证明高等植物中存在
肌动蛋白 Actin，研究者们已经相继从多种高等植
物中获得 Actin 基因，如玉兰、枣树、木薯、芍药、
豌豆和荔波连蕊茶等［9-15］。然而，还有许多物种的
Actin 基因有待分离和鉴定，以便作为内参对该物种
其它基因进行定量分析。
香樟（Cinnamomum camphora），又名樟树、乌
樟，樟科（Lauraceae）樟属（Cinnamomum），属常
绿乔木，含有特殊香气和挥发油，是贵重家具、高
级建筑、造船和雕刻等的理想用材。近年来，香樟
在园林绿化中的应用越来越多，正成为城市中重要
的园林绿化树种［16］。香樟主要分布于长江以南及西
南地区，近几年黄河流域也有分布。低温胁迫是限
制香樟的地理分布及其在园林绿化中应用的一个重
要环境因子。因此，培育香樟抗寒新品种有利于其
在冬季寒冷的北方地区推广。研究抗寒相关基因，
从而利用基因工程技术获得香樟抗寒新品种，具有
目的性强、方便快捷等优点，是香樟新品种改良的
有效途径。香樟抗寒相关基因的表达模式研究需要
一个在低温条件下表达量相对恒定的内参，进行实
时荧光定量 PCR 分析。Actin 基因被证明在一些逆境
胁迫条件下表达量相对恒定［17］，也经常作为内参应
用于植物抗寒相关基因 DREB 家族基因的表达分析。
如 Peng 等［18］在研究羊草 DREB 基因转拟南芥的表
达分析时以拟南芥 Actin 作为内参 ；张勇等［19］在
研究草莓 FaCBF1 基因的表达分析时也运用了 Actin
基因作为内参。本实验室已经从香樟中分离到两个
DREB1/CBF 基因（数据未公布），优先选择 Actin 基
因作为内参，然而，迄今为止关于香樟 Actin 基因的
研究还未见报道。本研究首次从香樟中克隆 Actin 基
因片段，并用 Q-PCR 技术对 CcACTc 基因进行表达
分析，研究其在香樟不同器官中以及低温处理条件
下的稳定性，旨在为开展香樟优良内参基因的筛选
提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 材料 试验材料为本实验室保存的香樟无性
系组培苗，继代培养基为 MS+2.0 mg/L BA+0.5 mg/L
2，4-D，生根培养基为 MS 基本培养基，其中蔗糖 30
g/L，琼脂粉 8.0 g/L，培养温度（25±1）℃，光照强
度 2 500 lx，光照时间 16 h/d。待材料在 MS 基本培
养基上生长至有 5-7 片叶片时，开始对材料进行低
温处理，处理温度为 4℃，分别于 0、0.5、1、2、4、
6、12、24、48 和 72 h 随机取叶片 ；同时选取生根
良好且长势一致的健壮组培苗，取其根、茎、叶片。
所有的材料平行取 4 个重复，收获后立即用液氮速
冻，-80℃保存直至 RNA 提取。
1.1.2 主要试剂与仪器 大肠杆菌感受态 Trans5α、
EasyTaq DNA 聚合酶、TransTaq-T DNA 聚合酶购自
北京全式金（Transgen）生物技术有限公司 ；Premix
ExTaq DNA 聚 合 酶、primeSTAR GXL DNA 聚 合
酶、dNTP Mixture、pMD19-T Vector、DL2000 DNA
Marker、PrimeScriptII 1st strand cDNA Synthesis Kit 购
自大连宝生物（TaKaRa）工程有限公司 ；CTAB 植
物基因组 DNA 快速提取试剂盒、EASYspin Plus 植
物 RNA 快速提取试剂盒、琼脂糖凝胶纯化回收试剂
盒购自北京艾德莱（Aidlab）生物科技有限公司；0.2
mL EU 材质薄壁 8 连管购自荷兰 Bioplastics 公司 ；
RT-qPCR 反应试剂为 FastStart Universal SYBR Green
Master（ROX）购自瑞士罗氏（Roche）公司 ；其他
生化试剂采用国产或者进口分析纯。荧光定量 PCR
仪为美国伯乐（Bio-Rad）公司生产的 CFX-96 实时
荧光定量系统。
1.1.3 引物设计 通过比对 GenBank 中已公布的
其 他 植 物 Actin 基 因 cDNA 序 列， 根 据 保 守 区 域
利 用 Primer5.0 软 件 设 计 一 对 简 并 引 物 CcAct-F 和
CcAct-R， 预 测 所 得 片 段 长 度 约 1 000 bp ；根 据
CcACTc 基因核苷酸序列的特异区域设计一对 Q-PCR
引 物 CcAct-RTF 和 CcAct-RTR， 扩 增 片 段 373 bp。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.5122
实验所用引物信息，见表 1。
表 1 使用到的引物信息
引物名称 核苷酸序列（5-3）
CcAct-F AATGGAACTGGRATGGTSAAGG
CcAct-R GAAATCCACATCTGYTGGAA
CcAct-RTF TGTTCTGGACTCGGGTGA
CcAct-RTR ATGGATTCCTGCTGCTTC
M13-F AGCGGATAACAATTTCACACAGG
M13-R CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC
1.2 方法
1.2.1 Actin 基 因 片 段 的 克 隆 利 用 北 京 艾 德 莱
EASYspin Plus 植 物 RNA 快 速 提 取 试 剂 盒 提 取 香
樟 叶 片 总 RNA， 取 2 μg RNA 利 用 TaKaRa 公 司
PrimeScriptII 1st strand cDNA Synthesis Ki 反转录合成
第一链 cDNA，作为 PCR 扩增香樟 Actin 基因片段的
模板。
PCR 反 应 体 系（20 μL）：ddH2O 7 μL，Premix
ExTaq 10 μL，CcAct-F 和 CcAct-R（10 μmol/L）各 1
μL，cDNA 模板 1 μL。PCR 扩增条件 ：94℃预变性
4 min ；94℃变性 30 s，54℃退火 30 s，72℃延伸 1
min，28 个循环 ；72℃总延伸 10 min。用 1.0% 琼脂
糖凝胶电泳检测 PCR 扩增产物。
经电泳检测 PCR 扩增产物与预期目的条带片
段大小符合，另做 5 管 20 μL 体系，利用艾德莱琼
脂糖凝胶回收试剂盒回收目的条带。回收产物连接
于克隆载体 pMD19-T 上，16℃过夜，转化大肠杆
菌 Trans5α 感受态细胞，以通用引物 M13 进行菌落
PCR，挑取阳性菌扩大培养送往上海生工测序。
1.2.2 Actin 基因的生物信息学分析 将测序获得
的香樟 Actin 基因片段的核苷酸序列以及推导的氨
基 酸 序 列， 在 NCBI 网 站 上 使 用 BLAST 在 线 分 析
工具进行序列相似性分析。序列的比对、翻译利用
DNAMAN 分析，系统进化树先用 ClustalX 进行多序
列比对，然后利用 Bioedit 将多序列比对结果剪切对
齐后用 MEGA 进行系统进化树的构建。
1.2.3 CcACTc 基因在香樟不同器官及低温处理下
叶片中的表达分析 采用实时定量 PCR 的方法检测
正常生长条件下的香樟组培苗不同器官及低温处理
0-72 h 条件下叶片中 Actin 基因的表达差异。分别
提取香樟根、茎、叶片及经低温处理不同时间的叶
片的总 RNA，反转录成 cDNA，RNA 起始模板量为
2 μg，将反转录产物稀释 10 倍，作为 Q-PCR 反应
模板，定量分析引物 CcAct-RTF 和 CcAct-RTR 的扩
增产物先进行电泳检测及测序，确保其扩增产物特
异。Q-PCR 反应采用 SYBR Green I 法，利用罗氏公
司的 FastStart Universal SYBR Green Master（Roche），
在伯乐（Bio-Rad）CFX96 实时定量 PCR 仪上进行。
反 应 体 系（10 μL）：ddH2O 3.4 μL，2×Power Taq
PCR MasterMix 5 μL，CcAct-RTF 和 CcAct-RTR（10
μmol/L）各 0.3 μL，cDNA 1 μL。反应条件 ：94℃预
变 性 5 min ；94℃ 变 性 15 s，60℃ 退 火 30 s，72℃
延伸 1 min，共 40 次循环 ；熔解曲线在 65-95℃之
间，每 0.05 s 升高 0.5℃。基因表达分析软件为 Bio-
Rad CFX manager 2.0，每一样品重复 3 次，实验重
复 3 次，根据各个样品的 CT 值，利用 Excell 2007 和
BestKeeper 进行数据分析，BestKeeper 是基于各个样
品的 CT 值计算标准偏差 SD，SD 值越小，基因稳定
性越好，若 SD>1，则认为该基因不稳定［20，21］。
2 结果
2.1 总RNA的提取及检测
提取香樟叶片总 RNA，1.0% 琼脂糖凝胶电泳检
测，结果（图 1-A）显示，28S 和 18S 条带清晰，表
明本实验提取的 RNA 完整性良好，可以用于后续反
转录工作。
2.2 PCR扩增产物的鉴定
以 香 樟 cDNA 为 PCR 反 应 模 板， 以 CcAct-F、
CcAct-R 为引物进行 PCR 扩增。反应产物用 1.0% 的
琼脂糖凝胶电泳检测，在 1 000 bp 附近有一条亮带
（图 1-B），与预期片段大小一致，可能是香樟 Actin
基因片段，进一步测序鉴定。
2.3 阳性克隆的鉴定
将 回 收 纯 化 的 目 的 片 段 连 接 到 克 隆 载 体
pMD19-T 上，转化大肠杆菌 Trans5α 感受态细胞，
随机挑选 15 株抗性菌进行 PCR 检测，琼脂糖凝胶
电泳结果（图 2）显示，阳性菌落 PCR 扩增产物比
目的基因片段 PCR 产物稍大，挑取保存在平板上的
相应阳性菌扩大培养，并测序。
2015,31(5) 123李勇鹏等：香樟 Actin基因的克隆及表达分析
无油樟一种未知蛋白（XP_006854536.1）和樟科植
物鳄梨 Actin（ADA70361.1）的相似度最高，均达
到 100%。CcACTc 的核苷酸序列与樟科植物山鸡椒
ACT7（KF706373.1）相似度最高，达 98%，氨基酸
序列与樟科植物山鸡椒 ACT7（AGZ90151.1）相似
度最高，达 100% ；CcACTd 的核苷酸序列与葡萄科
植物葡萄的 ACT1（XM_002282480.2）的相似度最高，
达 87%，氨基酸序列与无油樟科植物无油樟未知蛋
白（XP_006846523.1）相似度最高，达 99%。由此
推断，本研究所获得的基因片段应该为香樟肌动蛋
白 Actin 基因片段，提交 GenBank，登录号分别为
KM086736、KM086737、KM086738 和 KM086739。
2.5 香樟Actin基因的系统进化树的构建
从 NCBI 下载与香樟肌动蛋白（CcACT）同源
性较高的 21 个物种的 Actin 基因的氨基酸序列，利
用 ClustalX 软件进行多序列比对，比对结果经对齐
后利用 MEGA 软件建立系统进化树，结果（图 5）
表明，CcACTc 与山鸡椒 ACT7、CcACTa 与无油樟
未知蛋白、CcACTb 和 CcACTd 与鳄梨 ACT 分别聚
为一支，表明它们在氨基酸水平上亲缘关系较近。
2.6 CcACTc基因在香樟不同器官及低温处理下叶
片中的表达分析
利 用 CcAct-RTF 和 CcAct-RTR 引 物 进 行 普 通
PCR 扩增，琼脂糖凝胶电泳结果显示扩增产物没有
引物二聚体和非特异条带，经测序表明该对引物能
特异地扩增相应目的片段，可以用于 Q-PCR 分析。
通过 Q-PCR 技术，检测香樟 CcACTc 基因在不同器
官及低温处理下叶片中的表达情况，根据各个样品
的平均 CT 值，利用 Excel 2007 作图。Q-PCR 结果显
示，CcACTc 基因在香樟组培苗的根、茎、叶部位中
（图 6-A）的平均 CT 值差异不大 ；低温处理 0-72 h
各个叶片样品的平均 CT 值（图 6-B）虽然有一定波动，
但也相对稳定。
BestKeeper 根据各个样品的 CT 值计算标准偏差
SD，CcACTc 基因在不同器官中和低温胁迫处理的叶
片中 SD 值分别为 0.38 和 0.29。
3 讨论
Actin 是一种起源较早的基因，植物与哺乳动
物之间有大约 90% 的相似性［22］，由于表达量高且
28S
18S
2000
bp
1000
750
500
250
100
M 1 2 MA B 3 M
M ：DNA marker（DL2000）；1，2 ：总 RNA 提取 ；3 ：CcACT 的 PCR 产物
图 1 香樟叶片总 RNA（A）和香樟 ACT 基因 PCR（B）
扩增结果
2000
M 1 2 3 4 5 6 7
bp
1000
750
500
250
100
M ：DNA marker（DL2000）；1 ：CcACT PCR 扩增产物 ；2，3，5 ：阴性重组
子菌落 PCR 产物 ；4，6，7 ：阳性重组子菌落 PCR 产物
图 2 菌落 PCR 筛选阳性重组子结果
2.4 测序结果及多序列比对
测序结果经分析并去除两端引物序列，获得
了 4 个大小均为 998 bp 的高度相似的 cDNA 序列
片段，均编码 332 个氨基酸（从第 3 个碱基开始翻
译），利用 DNAMAN 将所获得的 4 条核苷酸序列进
行多序列比对，一致性为 92.23%（图 3），图中可
以看出突变位点大多在密码子的第 3 个碱基位点 ；
而推导的相应氨基酸序列一致性高达 99.62%（图
4），结果显示，其氨基酸序列相互之间有 1-4 个氨
基酸的差异。将本研究获得的 4 个片段的核苷酸序
列及推导的氨基酸序列在 NCBI 中进行 BLASTN/P 分
析，结果显示所获得序列属于 Acitin 基因家族，分
别命名为 CcACTa、CcACTb、CcACTc 和 CcACTd。其
中，CcACTa 和 CcACTb 的核苷酸序列都与樟科植物
鳄梨 Actin 基因（GU272027.1）相似度最高，分别
达 91% 和 94% ；而氨基酸序列分别与无油樟科植物
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.5124
CcACTa.SEQ
CcACTb.SEQ
CcACTc.SEQ
CcACTd.SEQ
Cnsensus
CcACTa.SEQ
CcACTb.SEQ
CcACTc.SEQ
CcACTd.SEQ
Cnsensus
CcACTa.SEQ
CcACTb.SEQ
CcACTc.SEQ
CcACTd.SEQ
Cnsensus
CcACTa.SEQ
CcACTb.SEQ
CcACTc.SEQ
CcACTd.SEQ
Cnsensus
CcACTa.SEQ
CcACTb.SEQ
CcACTc.SEQ
CcACTd.SEQ
Cnsensus
CcACTa.SEQ
CcACTb.SEQ
CcACTc.SEQ
CcACTd.SEQ
Cnsensus
CcACTa.SEQ
CcACTb.SEQ
CcACTc.SEQ
CcACTd.SEQ
Cnsensus
CcACTa.SEQ
CcACTb.SEQ
CcACTc.SEQ
CcACTd.SEQ
Cnsensus
CcACTa.SEQ
CcACTb.SEQ
CcACTc.SEQ
CcACTd.SEQ
Cnsensus
CcACTa.SEQ
CcACTb.SEQ
CcACTc.SEQ
CcACTd.SEQ
Cnsensus
CcACTa.SEQ
CcACTb.SEQ
CcACTc.SEQ
CcACTd.SEQ
Cnsensus
CcACTa.SEQ
CcACTb.SEQ
CcACTc.SEQ
CcACTd.SEQ
Cnsensus
CcACTa.SEQ
CcACTb.SEQ
CcACTc.SEQ
CcACTd.SEQ
Cnsensus
997
997
997
997
960
960
960
960
880
880
880
880
800
800
800
800
720
720
720
720
640
640
640
640
560
560
560
560
480
480
480
480
400
400
400
400
320
320
320
320
240
240
240
240
160
160
160
160
80
80
80
80
图 3 新克隆的 4 条 CcACT 核苷酸序列片段的多序列比对
2015,31(5) 125李勇鹏等：香樟 Actin基因的克隆及表达分析
CcACTa.SEQ
CcACTb.SEQ
CcACTc.SEQ
CcACTd.SEQ
Cnsensus
CcACTa.SEQ
CcACTb.SEQ
CcACTc.SEQ
CcACTd.SEQ
Cnsensus
CcACTa.SEQ
CcACTb.SEQ
CcACTc.SEQ
CcACTd.SEQ
Cnsensus
CcACTa.SEQ
CcACTb.SEQ
CcACTc.SEQ
CcACTd.SEQ
Cnsensus
CcACTa.SEQ
CcACTb.SEQ
CcACTc.SEQ
CcACTd.SEQ
Cnsensus
80
80
80
80
160
160
160
160
240
240
240
240
320
320
320
320
331
331
331
331
图 4 所获得的 4 条 cDNA 序列推导氨基酸的多序列比对㮉ޠCymbidium faberi ACTAEN19693.1㶤㶦ޠPhalaenopsisi hybrid cultivar ACT(AAF71265.1)䫱Ⳟ⸣ᯋDendrobium officinale ACT(AGA17037.1)俉⁏Cinnamomum camphora ACTcኡ呑ὂLitsea cubeba ACT7 (AGZ90151.1)ਟਟTheobroma cacao ACT(XP_007041601.1)ᰐ⋩⁏Amborella trichopoda Unkonwn(XP_006854536.1)俉⁏Cinnamomum camphora ACTa∋ਦ⮚㦄᷍Annona cherimola ACT2俉⁏Cinnamomum camphora ACTd俉⁏Cinnamomum camphora ACTb勴ỘPersea americano ACT(ADA70361.1)⾿ሯ㥹Adonis aestivalis ACT(AFR36919.1)ᤏই㣕Arabidopsis thaliana ACT7(NP_196543.1)哴⬌Cucumis sativus ACT(XP_004173826.1)㬆哫Ricinus communis ACT(AAR15174.1)ݹⳞẖBetula luminifera ACT(ACJ38662.1)⋩ẀVernicia fordii ACT(AFJ04513.1)∋ⲭᶘPopulus tomentosa ACT(AFZ78523.1)∋᷌ᶘPopulus trichocarpa ACT(XP 002316289.1)⦹㊣Zea mays ACT(AFW75038.1)≤にOryza sativa Japonica Group ACT(EEE62039.1)ሿ㊣Setaria italica ACT(XP_004971370.1)✏㥹Nicotiana tobacum ACT(BAD27408.1)ᤏই㣕Arabidopsis thaliana ACT2(NP_188508.1)
0.0000.0050.0100.0150.0200.0250.030
图 5 香樟 CcACT 基因推导的氨基酸序列与其他植物 Actin 氨基酸序列的系统进化树
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.5126
相对稳定，一般作为该物种其它基因定量和半定
量 PCR 分析的内参基因，在大多数植物的表达分
析研究中，Actin 基因家族是使用次数最多的看家
基因，并且广泛应用于 DREB 家族基因表达分析研
究［12-23］。高等植物肌动蛋白基因属于多基因家族［24］，
目前为止，研究者们已经从多种物种中克隆到了
Actin 基因。本研究首次从园林植物香樟中分离到
了 Actin 基因片段的 cDNA 序列，在实验中用一对引
物，以香樟叶片 cDNA 为模板进行 PCR 扩增，PCR
产物经测序并分析获得了 4 条高度相似却有一定差
异的 cDNA 序列片段，起初认为可能是由于引物的
非特异性所致或者是 DNA 聚合酶引起错配或测序导
致的错误，我们又重新进行了反转录并利用 3 种不
同的 DNA 聚合酶（EasyTaq、TransTaq-T DNA 聚合
酶和 primeSTAR GXL DNA 聚合酶）以相同的程序
进行香樟 Actin 基因片段的克隆，结果除 primeSTAR
GXL DNA 聚合酶未能扩增出条带，其余两种 DNA
聚合酶均能扩增出正常条带。将这两种酶的 PCR 扩
增产物连接到 T 载体转化大肠杆菌感受态并分别随
机挑选 20 株阳性菌进行测序，结果依旧可以获得
4 条不同的 cDNA 序列片段。本试验表明，香樟叶
片确实存在 4 个不同的 Actin 基因，并且序列高度
相似，它们在香樟中可能行使相似的功能。从 4 条
cDNA 序列片段的核苷酸序列比对结果来看，核苷
酸序列之间存在一定的差异，一致性达 92.23%，但
是 4 条 cDNA 序列片段所推导的氨基酸序列之间一
致性高达 99.62%，相互之间仅有 1-4 个氨基酸的差
异，可能是由于碱基的突变位点主要集中在密码子
的第 3 个碱基位点所致。类似的是，李军等［25］在
桑树中也一次获得了 2 个同源性较高的肌动蛋白基
因 MaACT1、MaACT2。
本研究所获得的 CcACTa、CcACTb、CcACTc 和
CcACTd 基因经 NCBI 在线分析均含有植物肌动蛋白
家族的特征序列 ATP、Gelsolin 和 Profilin 结合位点，
并且 BLASTN/P 分析结果显示，它们与其它植物的
Actin 基因的核苷酸序列以及相应氨基酸都有较高的
同源性，证明本研究所获得的基因片段确实为香樟
肌动蛋白基因（CcACT），也进一步证实了肌动蛋白
的高度保守性［26 27］。此外，从 NCBI 下载与香樟肌
动蛋白（CcACT）同源性较高的 21 个物种的系统进
化树分析显示，香樟肌动蛋白（CcACT）与山鸡椒、
无油樟和鳄梨的肌动蛋白聚为一支，这与 NCBI 的
BLASTP 在线同源性分析结果一致，也支持了传统
分类方法将香樟、山鸡椒和鳄梨分为同一樟科植物。
还可以看出各个物种的 Actin 起源于同一祖先，拟南
芥 ACT2 独立一支，而本研究克隆的香樟 CcACT 与
拟南芥 ACT7 聚为一类，CcACT 可能属于 ACT7。各
个物种之间 Actin 的氨基酸序列高度保守表明 Actin
在不同物种行使相近的功能，其在进化过程中之所
以变化较小可能是为了维持其在植物发育和形态发
生中行使的重要功能［15］。CT 值作为评估内参基因稳
定性的一个重要指标广泛应用于内参基因的筛选中，
CT 值是指反应体系累计足够的扩增产物，至可以产
生可检测的荧光信号时的循环数，主要由扩增反应
体系中模板的初始浓度决定。如果初始模板浓度低，
需要较多的扩增循环才能产生足够的荧光信号 ；反
之，只需要较少的扩增循环就可以累计足够的产物，
从而产生高过背景的荧光信号，即基因表达量与该
样品 CT 值呈反比例关系。基于 Q-PCR 的表达分析
结果显示，CcACTc 基因在不同植物器官组织及低温
处理叶片中的 CT 值差异不大，并且，BestKeeper 根
据各个样品的 CT 值计算标准偏差 SD 值远小于 1，
综上可知，该基因在香樟根、茎、叶和低温处理条
件下的叶片中表达量稳定，为一个非组织特异型表
达，即组成型表达的肌动蛋白基因。期望可以作为
香樟 DREB1/CBF 基因及其它功能基因研究的内参基
因，也可以作为筛选香樟优良内参基因的候选基因。
4 结论
本研究所获得了香樟肌动蛋白基因（CcACT）
25A B
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10
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图 6 香樟 CcACTc 基因在植株不同器官（A）及低温处理
下（B）叶片中的平均 CT 值
2015,31(5) 127李勇鹏等：香樟 Actin基因的克隆及表达分析
且首次在香樟叶片组织中分离到氨基酸序列相似度
较高的 4 个 Actin 基因，它们在香樟中可能行使相似
的功能。CcACTc 基因在香樟根、茎、叶和低温处理
条件下表达量稳定，期望可以作为香樟 DREB1/CBF
基因及其它功能基因研究的内参基因，也可以作为
筛选香樟优良内参基因的候选基因。
参 考 文 献
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（责任编辑 李楠）