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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第12期
实时荧光定量 PCR 技术已成为检测目的基因在
不同组织器官和不同发育阶段表达模式常用的方法
之一，具有简便、高效和经济的优点。但在分析基
因表达时需要内参基因对目的基因表达量进行校正，
这样才能获得可靠的试验结果［1］。肌动蛋白广泛存
在于真核生物中，对维持高等植物正常的生长发育
起着重要的作用［2-7］，具有高度的保守性和表达一
致性，故常和其他管家基因一样，常作为内参基因
来使用。
建兰（Cymbidium ensifolium）又称四季兰，为
兰科兰属多年生草本植物，属中国地生兰类。一茎
收稿日期 : 2012-05-16
基金项目 : 福建省自然科学基金项目（2009J01066）
作者简介 : 吴菁华 , 女 , 讲师 , 研究方向 : 园艺植物遗传育种 ; E-mail: wjhham@yahoo.com.cn
通讯作者 : 吴少华 , 男 , 硕士 , 教授 , 研究方向 : 园艺植物育种 ; E-mail: wsh6677@yahoo.com.cn
建兰 Actin 基因 cDNA 全长的克隆及其表达分析
吴菁华  吴少华  杨超
（福建农林大学园艺学院，福州 350002）
摘 要 ： 根据单子叶植物的肌动蛋白基因（Actin）的保守区序列设计引物，采用 RT-PCR 和 RACE 技术从建兰（Cymbidium
ensifolium）中分离出 Actin 基因 cDNA 全长。序列分析结果表明，建兰 Actin 基因长度为 1 434 bp，编码区长度为 1 134 bp，编码
377 个氨基酸，将其命名为 CeActin，GenBank 登录号为 JN613147。CeActin 推导的氨基酸序列与其他植物的同源性都较高，具有高
度的保守性。采用半定量 RT-PCR 技术分析 CeActin 在建兰各组织及花不同发育时期的表达情况，结果表明，表达量没有明显差异，
表明 CeActin 基因可作为内参基因。
关键词 ： 建兰 肌动蛋白基因 克隆 表达分析
Cloning and Expression Analysis of CeActin Homologous Gene from
Cymbidium ensifolium
Wu Jinghua Wu Shaohua Yang Chao
（College of Horticulture，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou 350002）
Abstract:  The full-length cDNA sequence of Actin gene from the bud of Cymbidium ensifolium was cloned（GenBank accession
number ：JN613147）by using RT-PCR and RACE with degenerate primer which were synthesized based on the high homologous region among
the sequences of several monocotyledon Actin genes. The full length cDNA of CeActin was 1 434 bp with an ORF of 1 134 bp encoding a protein
with 377 amino acids. Homology search showed that this gene shared high identity with other Actins. Semi-quantitative RT-PCR analysis showed
that the expression of CeActin had no notable difference in different tissues and different floral development stages. The results laid basis for
identification of gene transcription level in Cymbidium ensifolium using CeActin as internal control.
Key words:  Cymbidium ensifolium Actin gene Cloning Expression analysis
多花，以优美清香而著称，有很高的观赏价值和经
济效益。但目前对其研究主要集中在栽培上，对其
分子生物学的研究较少。本研究以建兰为材料，利
用 RACE 技术获得 Actin 基因全长，并用半定量 RT-
PCR 技术研究其在建兰不同组织和花不同发育时期
的表达情况，旨在为研究建兰其他基因的表达情况
提供参考。
1 材料与方法
1.1 试验材料
建兰‘四季大青’，购于福州花鸟市场。
2012年第12期 89吴菁华等 ：建兰 Actin 基因 cDNA 全长的克隆及其表达分析
1.2 方法
1.2.1 总 RNA 提取与 cDNA 合成 以建兰花蕾为材
料，采用百泰克公司多糖多酚 RNA 提取试剂盒试剂
提取总 RNA，cDNA 第一链合成以 AP（5-GGCCAC-
GCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3）为引
物， 使 用 Fermants 公 司 的 反 转 录 试 剂 盒 完 成，5
cDNA 合成采用 Clontech 公司的 SMARTTM RACE 试
剂盒。
1.2.2 建兰 Actin 基因的克隆 保守区的克隆 ：根据
其他植物 Actin 基因设计正向的 CeAct1 和反向的
CeAct2 引物，CeAct1 ：5-CACTGCTGAGCGGGAAA-
TTGT-3 ；CeAct2 ：5-GATCCTCCAATCCAGACAC-
TG-3，由上海博尚生物工程技术服务有限公司合成。
以花蕾的 cDNA 为模板进行 PCR 扩增。PCR 产物利
用 DNA 胶回收试剂盒回收，连接到 pMD18-T 载体，
送上海博尚公司测序。
5 端的克隆 ：根据获得基因序列设计 5RACE
引 物 ：CeAct5R1 ：5-CAGCTCCTGTTCCTGATCCAG-
TGCAAC-3 ；CeAct5R2 ：5-GAGTTATAGGTCGTCTC
ATGAATGCC-3。 分 别 用 这 两 个 特 异 引 物 试 剂 盒
（Invitrogen）中的引物进行半巢式 PCR 获得该基因
5 端。
3 端的克隆 ：根据获得基因序列设计 3RACE
引物 ：CeAct3R1 ：5-GTTCCCTGGAATTGCCGATCG-
TATG-3。用这个特异引物与 AUAP（5-GGCCACGC
GTCGACTAGTAC-3）进行 PCR 获得该基因 3 端。
1.2.3 序列的生物信息学分析 利用 ExPasy 系统中
的 ProtParam 工具对该蛋白进行分析（http ：//www.
expasy.org/tools/protparam.html）， 并 利 用 Blast 搜 索
（http ：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）其同源基因，
再使用 MEGA5 软件对搜索得到的基因进行多重序
列比对，并构建系统发生树。
1.2.4 建兰 Actin 基因的表达分析 采用百泰克公司
多糖多酚 RNA 提取试剂盒分别提取建兰‘四季大青’
的萼片、花瓣、唇瓣、合蕊柱、根、叶及大小分别
为 <0.5 cm、0.5-1 cm、1-2 cm、>2 cm 花 芽 的 总
RNA，并取 1 μg 总 RNA 反转录后得到 cDNA，设计
一对建兰 Actin 引物 5-CTGCTGGCATTCATGAGAC-
GACC-3 和 5-CAATTCCAGGGAACATAGTCGAGC-
C-3 进行 RT-PCR，共 30 个循环。分析建兰各组织
和花不同时期 Actin 基因的表达情况。
2 结果
2.1 RNA提取
将提取的建兰花蕾的 RNA 进行电泳检测，电泳
显示 28S rRNA、18S rRNA 条带清晰（图 1），浓度
比约为 2∶1，说明提取的 RNA 完整性良好，符合
后续 RT-PCR 和 RACE 扩增的要求。
图 2 CeActin 基因的克隆
M. DL2000 DNA Marker ；1. 保守区 ；2. 5RACE ；3. 3RACE
2000
1000
750
500
250
100
bp
M 1
M. DL2000 DNA Marker ；1. 目的片段
图 1 建兰花蕾总 RNA 电泳图
2.2 CeActin基因的克隆
PCR 扩 增 结 果（ 图 2） 显 示，CeActin 保 守 区
PCR 扩增产物大小约为 500 bp，5 RACE 和 3 RACE
扩增的产物大小约为 800 bp 和 400 bp。将 PCR 产物
克隆到载体中进行测序后发现，该基因保守区 PCR
扩增产物长为 429 bp，5-和3-末端全长序列扩增的
产物长分别是 972 bp 和 427 bp。将其 3 端和 5 端
以及保守区序列拼接，获得长 1 434 bp 的 cDNA 序列，
与其他物种的 Actin 基因比较，同源性较高，因此
获得了建兰的 Actin 基因全长，将其命名为 CeActin，
GenBank 登录号为 JN613147。
2000
bp
1000
750
500
250
100
2000
bp
1000
750
500
250
100
M 1 M 2 3
2.3 CeActin基因生物信息学分析
DNAMAN 软件推导 CeActin 基因的氨基酸有 377
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第12期90
个。ProtParam 工具对该蛋白分析结果显示，氨基酸
分子量大约为 41.6 kD，分子式为 C1845H2915N491O560S20，
理论等电点为 5.31，原子总量为 5 831，脂肪族氨基酸
指数为 85.89。该蛋白中氨基酸含量最高的是 Ala
（8.0%），最低为 Cys（1.1%），带负电荷氨基酸残基
（Asp+Glu）50 个，带正电荷氨基酸残基（Arg+Lys）
38 个。
通过 GenBank 数据库分析 CeActin 保守结构域，
具有 Actin 家族典型的结构域（图 3），含有保守的
ATP、Gelsolin 和 Profilin 等结合位点，属于肌动蛋
图 3 CeActin 蛋白氨基酸序列的保守区
Query seq.
501 100 150 200 250 300 350 377
ATP binding site
Specific hits
Superfamilies
Multi-donains
gelsolin binding site
profilin binding site
ACTIN
ACTIN superfamily
Actin
≤に㶤㶦ޠ䱶ൠỹᤏই㣕བྷ䉶✏㥹⋩ἅᔪޠ
≤に㶤㶦ޠ䱶ൠỹᤏই㣕བྷ䉶✏㥹⋩ἅᔪޠ
≤に㶤㶦ޠ䱶ൠỹᤏই㣕བྷ䉶✏㥹⋩ἅᔪޠ
≤に㶤㶦ޠ䱶ൠỹᤏই㣕བྷ䉶✏㥹⋩ἅᔪޠ
≤に㶤㶦ޠ䱶ൠỹᤏই㣕བྷ䉶✏㥹⋩ἅᔪޠ
00
00
00
00
00
00
00
00
160
160
160
160
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240
240
240
240
240
240
240
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320
320
320
320
320
320
320
320
376
376
376
376
376
376
376
376
Consensus
wdd mek iwhh t f y n e l r v a p t t h p 1 1 t e a p l n p k a r e k m t q i m f e t f n p amyva i q a v l s l y a s g r t g i v l d s g d gConsensus
v h t v p i y e g a l p h a i l r l d l a g r d l t d l m k i l t e r g y f t t a e r e i v r d k e k l y a l d qe e k s s eConsensus
y e l p d g q v i t i g e r f r c p e v l qp s gme g i h e t t yn s imkcdvd i r k d l ygn v l s g g t m f p g i a d r m s k eConsensus
Consensus l a p s s mk i k u v a p p e r k y s v w i g gs i l a s l s t f q qmwi k eyd e gp i v h r k c
i q p l v c d n g t gmvka g f a gdd ap r a u f p s i v g r p r h t gvmu gmg qkd a y u g d e a q s k r g i l t l k y p i e h g i v nmad
图 4 八种植物 Actin 基因氨基酸序列同源性比对分析
2012年第12期 91吴菁华等 ：建兰 Actin 基因 cDNA 全长的克隆及其表达分析
白家族。CeActin 基因 cDNA 序列推导的氨基酸序列
与其他植物的比对结果（图 4）发现，他们是高度
保守的。将获得的 CeActin 基因全长 cDNA 序列进
行核苷酸同源性分析，发现其与兰科植物相似性最
高，如与五唇兰属杂交种的同源性高达到 91%，其
次为蝴蝶兰、春兰和萼脊兰。除兰科植物以外，与
油棕、水稻的相似性也较高。利用 BlastP 软件对
CeActin 推导的氨基酸序列进行同源性比较，结果显
示，CeActin 与其他植物的 Actin 蛋白序列的同源性
都较高，最高达 98%。比较时发现 cDNA 的同源性
要小于其推定的氨基酸，表明 Actin 基因的碱基序
列虽然在不同植物中有一定的变异，但氨基酸序列
在不同植物中却具有较高的一致性，这为 Actin 基
因功能的稳定性提供了一定的保证。
用 MEGA5 软件对建兰和其他植物的 Actin 基因
推导的氨基酸序列进行聚类分析，结果（图 5）表明，
CeAcin 与其他兰科植物归为一类。但在这些兰科植
物中，国兰和洋兰没有被区分开，这可能由于在这
些植物中 Actin 基因不止一个，所分离到的基因属
于不同的类型。
它们都表现出高度的保守性。本研究得到的 CeActin
基因推导的蛋白氨基酸序列与其他植物的 Actin 基因
蛋白氨基酸序列进行多序列比较，发现与它们一样，
具有肌动蛋白的 3 种特征信号序列 ；与其他植物的
Actin 基因具有较高的同源性，这些说明本试验克隆
的 CeAcin 基因是肌动蛋白基因。
Actin 基因在高等植物中分为营养型和生殖型两
大类，在进化过程中形成了多基因家族，从而产生
了多种肌动蛋白异型体［8，9］。郭景康等［10］通过生
物信息学的数据分析发现，在拟南芥、水稻和杨树
中 Actin 基因家族成员分别含有 20、18 和 22 个，经
系统进化分析后将 Actin 基因家族分为 12 个亚家族。
这种现象在大豆［11］、桑树［12］和黄瓜［13］等其他植
物中也有发现，这些家族成员的表达模式也不相
同，具有一定的时空特异性，这可能与他们的功能
相异有关。一个理想的内参基因应该是稳定的表达
于不同类型的细胞和组织中且表达量是无显著差别
的［14］。本试验用半定量 RT-PCR 技术分析了 CeActin
基因不同器官和花不同发育时期表达模式的结果表
明，CeActin 表达不存在明显的时间性和空间性，说
明本研究克隆的肌动蛋白基因具有表达稳定性，可
以作为内参基因使用。
建兰是福建省的特色花卉，在形态和香味等方
面极具特色，开发前景广阔，栽培经济效益明显，
尽管野生建兰资源丰富，但对其的基础研究较为薄
弱，本试验得到的 CeActin 基因可以作为今后克隆建
兰花色和花型等相关基因不同表达情况研究中的内
图 5 Actin 蛋白序列的进化树分析
Phalaenopsis hybrid
Phalaenopsis sp. True Lady
Cymbidium faberi
Setaria italica
Zea mays
●Cymbidium ensifolium
Doritaenopsis hybrid cultivar
Sedirea iaponica
Vitis vinifera
Nicotiana tabacum
Oryza sativa
Arabidopsis thaliana
2.4 CeActin基因在不同器官和花不同发育时期的
表达特性分析
利用半定量 RT-PCR 分析从建兰中分离的 Actin
基因的表达情况，CeActin 基因在植株的各器官中都
有表达，各器官的表达量基本上一致（图 6）。以建
兰花的几个发育阶段分别取样检测表达量，其表达
结果也无显著性差异（图 7）。
3 讨论
目前，已从多种植物中分离得到 Actin 基因，
1. 萼片 ；2. 花瓣 ；3. 合蕊柱 ；4. 唇瓣 ；5. 叶 ；6. 根
图 6 CeActin 基因在建兰不同器官中的表达
花芽长度分别为 <0.5 cm、0.5-1 cm、1-2 cm 和 >2 cm
图 7 CeActin 基因在建兰花不同发育时期的表达
28S
1 2 3 4 5 6
18S
28S
<0.5 cm 0.51 cm 12 cm >2 cm
18S
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第12期92
参基因，具有重要的应用价值。
4 结论
本研究利用 RACE 技术从建兰中分离出 CeActin
基因，长度为 1 434 bp，该基因在建兰的各组织和
花发育时期表达量基本一致，可作为内参基因使用。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）