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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第8期
自 1983 年 Mullis 建立聚合酶链式反应（polyme-
rase chain reaction，PCR）方法［1］以来，PCR 技术
被迅速地应用到基因克隆、基因改造、基因重组和
遗传分析等分子生物学研究领域，并成为该学科研
究的经典试验方法［2-5］。随着 PCR 技术的不断改
进与完善，其可靠性得到不断提高，并在常规 PCR
原理的基础上衍生出巢氏 PCR、定量 PCR、多重
PCR、荧光 PCR、原位 PCR 和等温 PCR 等多种类
型［6-8］，广泛应用于人类疾病检测、肿瘤诊断、食
源性微生物检测、畜禽疾病检测、转基因检测等多
个领域［9-11］，成为一种常规的分子诊断技术。
PCR 检测主要通过引物介导特异性扩增目的基
因以检测内源性或外源性目的基因的存在与否，进
而对疾病的预防、诊断和治疗提供信息和决策依据。
相比于传统的生化检测、血清学检测和病原学检测，
PCR 检测虽然具有特异、敏感、简便、快速等优点。
但是也存在以下明显缺点 ：第一，PCR 检测易污染，
假阳性和假阴性率高的缺点限制了其在临床诊断上
的应用，虽然定量 PCR 实现了闭管分析，避免扩增
产物的再污染，但仍存在标本间的交叉污染以及加
试剂、加样操作时的污染问题 ；第二，PCR 检测通
量低，虽然多重 PCR 可以实现多基因同时检测，但
由于多对引物之间的干扰，导致检测的敏感性下降。
针对上述问题，本试验在传统 PCR 基础上建立了一
收稿日期 : 2012-02-09
基金项目 : 河南省重点科技攻关项目（092102110073）
作者简介 : 王永芬 , 女 , 硕士 , 副教授 , 研究方向 : 畜禽生物技术及应用 ; E-mail: yongfwang@163.com
通讯作者 : 边传周 , 男 , 硕士 , 教授 , 研究方向 : 预防兽医学 ; E-mail: chuanzhou_bian@126.com
环介导间接 PCR检测方法的建立
王永芬 郑鸣 边传周
（郑州牧业工程高等专科学校，郑州 450011）
摘 要： 建立环介导间接 PCR检测体系，为分子诊断提供一种新的检测工具。以质粒 pUC18的核苷酸序列为模板，设计
两条特异性探针，采用常规 PCR技术将特异性探针标记于大豆 Lectin基因的左右两端充当报告基因，此标记的报告基因与待检的
pUC18质粒经杂交和缺口补平后形成一环状 DNA分子，然后采用反向 PCR技术扩增报告基因，建立针对 pUC18质粒的环介导间
接 PCR检测方法。结果表明，该检测方法的检测底限为 0.32 pg/μL，与常规 PCR相当，并且与其他质粒和动物 DNA检测无交叉反
应，是一种简单、快速、灵敏、特异的 PCR检测方法。
关键词： 探针 报告基因 环介导间接 PCR 建立 分子诊断
Establishment of Loop-mediated Indirect PCR for Detecting
Wang Yongfen Zheng Ming Bian Chuanzhou
（Zhengzhou College of Animal Husbandry Engineering，Zhengzhou 450011）
Abstract: The aim of this study is to establish a detection system of loop-mediated indirect PCR and provide a new testing tool for
molecular diagnostics. According to the nucleotide sequence of pUC18, a pair of specific probes was designed. By conventional PCR, the Lectin
gene fragment of soybean was labeled with specific probes to be used as reporter gene. After hybridizing with the target gene and gap filling, the
probe-labeled reporter gene became a cyclic DNA. Then, the cyclic DNA was amplified by reverse PCR to develop the loop-mediated indirect
PCR assay for detecting pUC18. The results showed that the detection limit of the loop-mediated indirect PCR assay for pUC18 was down to 0.32
pg/μL, which was the same with the result of conventional PCR. There was no amplification was achieved to the other plasmids and animal DNA
samples. It concluded that loop-mediated indirect PCR assay was a simple, rapid, sensitive and specific PCR method.
Key words: Probes Reporter gene Loop-mediated indirect PCR Establishment Molecular diagnostics
2012年第8期 131王永芬等 ：环介导间接 PCR 检测方法的建立
种全新的 PCR 检测技术，即环介导间接 PCR。其基
本原理（图 1）是针对待检目的基因的序列设计两
条相邻的特异性探针，并将探针偶联在一段无关的
报告基因左右两端，带有特异性探针的报告基因可
通过探针与待检目的基因进行互补杂交，从而使其
首尾末端靠近，杂交体单链缺口经 DNA 聚合酶补
平、耐热连接酶修复封闭，使报告基因 DNA 成环 ；
再以报告基因中间的序列为引物，反向扩增含探针
的环状报告基因而实现对目的基因的间接检测。根
据上述设想，本研究以质粒 pUC18 为待检目标，以
此质粒核苷酸序列设计两条特异性探针，标记植物
Lectin 基因作为报告基因，建立环介导间接 PCR 检
测体系，旨在为分子诊断提供一种新的检测工具。
技术实验室保存；RNase H 购自天根生物，蛋白酶 K
购自 Sigma 公司；Ex Taq酶，DL2000 DNA Marker 购
自 TaKaRa ；Taq DNA 连接酶购自 NEB ；其他生化试
剂均为分析纯。
1.2 方法
1.2.1 探针及 PCR 引物的合成 以质粒 pUC18 核
苷酸序列为模板，利用 Primer Premier 5.0 软件设一
对探针，两条探针之间相距 100 bp，用此探针标记
报告基因大豆 Lectin 基因的两端 ；再以大豆 Lectin
基因为模板设计一对反相 PCR 标记引物，用于反相
PCR 扩增，探针及引物均由上海生工合成，引物序
列见表 1。
1.2.2 核酸的提取
1.2.2.1 质粒 DNA 的小量制备 采用碱裂解法制备
质粒 DNA［12］，制备的质粒 DNA 溶解于 50 μL TE 缓
冲液，用核酸蛋白分析仪 DU530（Beckman）检测
浓度，-20℃保存备用。
1.2.2.2 各种动物血液 DNA 的制备 取新鲜动物抗
凝血 500 μL，加入等体积 Tris 缓冲液（20 mmol/L
Tris，10 mmol/L EDTA，100 mmol/L NaCl，pH8.0），
混匀后加入 10% SDS 至终浓度 0.5% 和蛋白酶 K 至
终浓度 50 μg/mL，置水浴锅中 50℃消化过夜 ；冷却
至室温，用等体积的 Tris 饱和平衡酚 氯仿 （25 24）
抽提 1 次，吸取上层水相 ；加入 2 倍体积的无水乙
醇 和 1/10 体 积 3 mol/L NaAc，-20 ℃ 沉 淀 15 min ；
10 000 r/min 离心 5 min，弃上清 ；用 70％乙醇洗涤，
12 000 r/min 离心 2 min，弃上清 ；干燥后溶于 30 μL
双蒸水或 TE 缓冲液，-20℃保存。
1.2.3 报告基因的标记 以质粒 pMD18-T-Lectin 为
模板，以 P1 和 P2 为引物对进行常规 PCR 扩增，用
以标记报告基因，PCR 反应总体积 60 μL，扩增程序：
表 1 试验中用到的探针及引物序列
图 1 环介导间接 PCR基本原理
a, b. 特异性探针 ；c. 报告基因
1 材料与方法
1.1 材料
质粒 pUC18 和 pMD18-T-Lectin 由郑州牧专生物
引物 序列（5-3） 产物长度（bp） 引物用途
P1 GAATCAGGGGATAACGCATCAAGAAGCCTCATCACA
372 标记报告基因P2 TTAGCTCACTCATTAGGCTTTCACCAGGGTTTAGTT
P3 TATCCGGCGTGGTAAACT
582 反向 PCR 扩增
P4 CCTCCAACCATGAAACTT
P5 GTGTAAAGCCTGGGGTG 401 常规 PCR 扩增
P6 TCGGGTTTCGCCACCTCTG
P1 和 P2 序列中下划线部分为特异性探针序列，且这两条引物的 5端磷酸化修饰
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第8期132
95℃变性 30 s，52℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，共
进行 30 轮循环。PCR 产物经胶回收纯化，获得针对
pUC18 质粒的、特异性探针标记的报告基因，-20℃
保存备用，同时进行克隆测序确认。
1.2.4 环介导间接 PCR 检测方法的建立 取制备好
的质粒 pUC18 DNA 溶液和标记有特异性探针的报告
基因，进行报告基因环化及反向 PCR 扩增试验，试
验体系为 20 μL，包含 P3、P4 各 10 pmol，4 种 dNTP
各 0.3 mmol/L，10 ×Taq DNA 连 接 酶 Buffer 2 μL，
10×Ex Taq Buffer 2 μL，Taq DNA连接酶0.2 μL，Ex Taq
0.15 μL，报告基因和 DNA 或 cDNA 溶液各 1.5 μL。
试验分三步进行 ：首先，95℃ 5 min 以使 DNA 彻底
变性 ；之后，按 95℃ 50 s，60℃ 10 min 进行 8 个循
环以使 DNA 环化 ；最后，进行反向 PCR 扩增，程
序为：95℃ 30 s，52℃ 30 s，72℃ 30 s，共 25 轮循环。
PCR 结束后进行胶回收纯化和 T/A 克隆，挑取阳性
克隆子送上海生工生物工程公司进行序列测定。
1.2.5 环介导间接 PCR 检测方法的评估
1.2.5.1 特异性试验 为了观察环介导间接 PCR 检
测的特异性，试验中分别将质粒 pET-30a、质粒
pQE30、猪全血 DNA、兔全血 DNA、羊全血 DNA
和人全血 DNA 与特异性探针标记的报告基因混合，
采用 1.2.4 反应条件进行环介导间接 PCR 扩增，同
时做 1 个阳性对照（质粒 pUC18），琼脂糖凝胶电泳
PCR 结果。
1.2.5.2 敏感性试验 采用核酸蛋白分析仪测定质
粒 pUC18 溶液浓度，然后用灭菌蒸馏水进行 5 倍倍
比稀释，形成 200、40、8、1.6、0.32 和 0.064 pg/μL
共 6 个浓度梯度，然后用方法 1.2.4 的反应条件进行
环介导间接 PCR 检测，琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 扩
增结果，同时对每个稀释度进行常规 PCR 扩增，比
较二者的结果以检验该方法检测的灵敏度。
2 结果
2.1 报告基因标记结果
以带有特异性探针的引物 P1 和 P2，采用常规
PCR 扩增大豆 Lectin 基因片段，以实现将 2 条特异
性探针标记于报告基因左右两端，经琼脂糖凝胶电
泳检测，结果（图 2）在 250 bp 和 500 bp 之间有清
晰扩增条带，经克隆测序后发现该片段中间为大豆
Lectin 基因片段，两端为特异性探针序列，表明标
记试验成功。
M. 分子量标准 DL2000 ；1. Lectin 基因扩增产物
M. 分子量标准 DL2000 ；1. Lectin 基因扩增产物
图 2 特异性探针标记报告基因
图 3 质粒 pUC18环介导间接 PCR扩增结果
2.2 环介导间接PCR检测结果
将质粒 pUC18 溶液和报告基因溶液混合后，依
次进行变性、环化和反向 PCR 扩增，结果获得 600
bp 左右的扩增片段（图 3），与预期 582 bp 的扩增
片段大小一致 ；进一步的克隆测序发现，该片段的
中间序列为质粒 pUC18，而两端为大豆 Lectin 基因
序列，与设想一致。
2.3 特异性试验结果
对质粒 pET-30a、质粒 pQE30、猪全血 DNA、
兔全血 DNA、羊全血 DNA 和人全血 DNA 进行环介
导间接 PCR 检测，琼脂糖凝胶电泳检测结果（图 4）
显示，仅阳性对照样品有特异性扩增片段出现，其
他样品均没有扩增条带。
2.4 敏感性试验结果
分别对 6 个不同稀释度的质粒 pUC18 溶液进行
检测，结果（图 5-A）在质粒浓度低至 0.32 pg/μL 时
依然有清晰的扩增条带，与常规 PCR 扩增结果类似
（图 5-B），由此说明该 PCR 检测方法灵敏度高，符
合 PCR 检测的要求。
2012年第8期 133王永芬等 ：环介导间接 PCR 检测方法的建立
图 4 特异性试验
M. 分子量标准 DL2000 ；1. 质粒 pET-30a; 2. 质粒 pQE30; 3. 猪全血 DNA;
4. 兔全血 DNA; 5. 羊全血 DNA; 6. 人全血 DNA; 7. 质粒 pUC18
图 5 敏感性试验
M. 分子量标准 DL2000 ；1-6. 质粒 pUC18 的浓度分别为 200、40、8、1.6、0.32 和 0.064 pg/μL
3 讨论
PCR 技术以检测范围广、敏感度高、特异性好
等特点被广泛应用到微生物的检测、疾病诊断、转
基因检测等多个领域［10-13］，由于污染而造成的 PCR
检测假阳性、假阴性率偏高的缺点，严重限制了
PCR 检测技术在临床检测上的应用，而本试验中建
立的环介导间接 PCR 检测技术则很好地解决 PCR
检测易污染的问题。
在环介导间接 PCR 检测试验中，利用嗜热 DNA
聚合酶和嗜热 DNA 连接酶通过一步链置换反应，将
待检基因的 PCR 扩增转换为报告基因的扩增从而
达到检测目的。由于试验中用到的报告基因为大豆
Lectin 基因，其与各种不同的质粒和动物源性 DNA
遗传背景差异大，避免了因污染而导致的假阴性
和假阳性，扩增背景单一，与质粒 pET-30a、质粒
pQE30、猪全血 DNA、兔全血 DNA、羊全血 DNA
和人全血 DNA 的检测无交叉反应，特异性好，适合
用于各种动物源性 DNA 样本的检测。若检测植物
源性 DNA 样本，可将报告基因换为某个动物基因，
以保持报告基因和待检基因遗传背景的差异，防止
污染。在保证检测结果特异性的同时，环介导间接
PCR 检测还具有很高的检测灵敏度，试验中将不同
稀释度的 pUC18 质粒模板进行环介导间接 PCR 检
测，结果发现该PCR检测技术检测浓度可以低至0.32
pg/μL，与常规 PCR 检测灵敏度相当。
4 结论
本研究以质粒 pUC18 为待检目标，将以此质
粒核苷酸序列设计的两条特异性探针，标记在植物
Lectin 基因的左右两端作为报告基因，成功建立了
针对 pUC18 质粒的环介导间接 PCR 检测方法。结果
表明，环介导间接 PCR 检测方法可行，不仅具有较
高的特异性，能有效避免污染，而且具有很高的检
测灵敏度，可作为一种常规的 PCR 检测技术，应用
于病原学等分子诊断研究。
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（责任编辑 李楠）