全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第4期
草甘膦（glyphosate）又称镇草宁、农达（Rou-
ndup）、草干膦、膦甘酸，是一种低毒除草剂，1971
年由美国 D.D. 贝尔德等发现，并由孟山都公司开发
生产，目前已成为全球最大吨位的除草剂品种［1］。
收稿日期 ：2012-11-04
基金项目 ： 农业部转基因重大专项（2011ZX08004-004），中青年科技领军人才及优秀创新团队项目（20121812），吉林省农业微生物重点实
验室平台建设项目（20122105）
作者简介 ： 李忠鹏，男，硕士，研究方向 ：食品生物化学 ；E-mail ：lizhongpeng1985@qq.com ；于寒松为并列第一作者
通讯作者 ： 李启云，男，博士，研究员，研究方向 ：植物保护，E-mail ：qyli1225@126.com ；王永志，男，博士，副研究员，研究方向 ：转
基因植物检测，E-mail ：yzwang@cjaas.com ；胡耀辉，男，教授，学士，研究方向 ：功能性食品与生物反应器，E-mail ：huyaohui@
vip.163.com
CP4-EPSPS 夹心 ELISA 配对单克隆抗体的研制和
生物学特性分析
李忠鹏1，2  于寒松1  胡耀辉1  时圣凤2，3  刘蕴慧2，4  段永杰1，2  
李小宇2  王永志2  李启云2
（1. 吉林农业大学，长春 130118 ；2. 吉林省农业科学院，长春 130033 ；3. 东北农业大学，哈尔滨 150030 ；
4. 哈尔滨师范大学，哈尔滨 150025）
摘 要 ： 为获得能够用于夹心 ELISA 检测的配对抗 CP4-EPSPS 蛋白单克隆抗体，构建 CP4-EPSPS 原核表达载体并转化大肠
杆菌 Rossetta，获得高效表达。通过对可溶性蛋白纯化，获得了高纯度目的蛋白。以纯化后的 CP4-EPSPS 蛋白作为抗原免疫 BALB/
c 小鼠，经过细胞融合和筛选获得 2 株抗 CP4-EPSPS 蛋白单克隆抗体（1A5 和 8A3）。经鉴定，这 2 株抗体可以有效地识别高温
变性和天然 CP4-EPSPS 蛋白 ；叠加 ELISA 分析表明两株抗体识别的抗原表位不同，说明两株抗体能够用于夹心 ELISA 检测 CP4-
EPSPS 蛋白。
关键词 ： CP4-EPSPS 蛋白表达 单克隆抗体 夹心 ELISA
Preparation and Analysis on Biological Characteristics of Monoclonal
Antibodies Against CP4-EPSPS for Sandwich ELISA
Li Zhongpeng1，2 Yu Hansong1 Hu Yaohui1 Shi Shengfeng2，3 Liu Yunhui2，4 Duan Yongjie1，2
Li Xiaoyu2 Wang Yongzhi2 Li Qiyun2
（1. Jilin Agricultural University，Changchun 130118 ；2. Jilin Academy of Agricultural Sciences，Changchun 130033 ；3. Northeast
Agricultural University，Harbin 150030 ；4. Harbin Normal University，Harbin 150025）
Abstract:  In order to obtain specific monoclonal antibody against CP4-EPSPS protein for sandwich ELISA, the CP4-EPSPS gene
was cloned into a bacterial expression vector and transformed into E.coli strain Rossetta. The target protein was expressed efficiently. After
purification, the target protein was obtained. Purified CP4-EPSPS was used to immunize BALB/c mice and two monoclonal antibodies（1A5 and
8A3）were generated. These antibodies can recognize nature and denatured CP4-EPSPS. Overlay ELISA showed that they recognize different
epitopes on CP4-EPSPS, so they can be used in sandwich ELISA to detect CP4-EPSPS.
Key words:  CP4-EPSPS Protein expression Monoclonal antibody Sandwich ELISA
随着草甘膦用量与日俱增，抗草甘膦作物迅速发展
起来，从 1996 年第一个抗草甘膦大豆在美国开始种
植后［2］，抗草甘膦作物在美国、阿根廷、巴西等已
逐渐成为主要种植作物［3-5］。
2013年第4期 207李忠鹏等 ：CP4-EPSPS 夹心 ELISA 配对单克隆抗体的研制和生物学特性分析
5-烯醇式丙酮莽草酸 -3-磷酸合成酶（5-enolpyr-
uvyl-shikimate-3-phosphate synthase，EPSPS）是草甘
膦的靶标酶［6］，来自根癌农杆菌（Agrobacterium sp.）
CP4 菌 株 的 CP4-EPSPS 由 于 其 对 草 甘 膦 的 高 抗
性［7，8］而被广泛的用于商业化。目前，我国对于转
CP4-EPSPS 食品检测普遍采用 PCR 和 Southern 杂交
等方法［9-11］，虽然灵敏性高，但耗时长、成本高、
重复性差及假阴性和假阳性率高等缺点，注定难于
在基层推广。对于转基因食品的检测，基于免疫学
的 ELISA 检测技术和试纸条技术［12］，相比于 PCR 法，
具有耗时短，重复性好的特点，而且操作简单，适
合于实际应用。
本研究以大肠杆菌为宿主，通过原核表达、提
取和纯化，获得高纯度的 CP4-EPSPS 蛋白，以纯
化后的 CP4-EPSPS 蛋白为抗原制备了 2 株特异性
高、识别不同抗原表位的单克隆抗体（monoclonal
antibody，mAb），并对其生物特性进行分析，旨在
为后续双抗体夹心 ELISA 检测方法和胶体金检测方
法的建立提供理想材料。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验动物 雌性 BALB/c 小鼠，6-8 周龄，购
自长春生物制品所。
1.1.2 菌株与质粒 大肠杆菌 Top10、Rossetta 以及
质粒 pET28a（+）为本实验室保存，pMD18-T 购自
大连宝生物工程（TaKaRa）公司。
1.1.3 主要试剂 限制性内切酶 Nde Ⅰ、Xho Ⅰ和
胶回收试剂盒及质粒提取试剂盒、T4 DNA 连接酶
均购自大连宝生物工程公司 ；异丙基 -β-D-硫代半乳
糖苷（IPTG）购自上海生工生物工程有限公司 ；Ni-
NTA-琼脂糖亲和层析柱购自上海意弘生物科技有限
公司 ；PEG1450 购自 Sigma 公司。
1.2 方法
1.2.1 CP4-EPSPS 基因的克隆 参照陈彦等［13］的方
法，利用改良的 CTAB 法从含 CP4-EPSPS 转基因大
豆中提取基因组 DNA。根据 CP4-EPSPS 基因阅读框
架设计上下游特异引物，F ：5ATTACATATGCTTC-
ACGGTGCAAGC 3（下划线处为 Nde Ⅰ酶切位点）R：
5 ATTACTCGAGTCAGGCAGCCTTCGTATCG 3（ 下
划线处为 Xho Ⅰ酶切位点），进行 PCR 扩增。
1.2.2 CP4-EPSPS 表达载体的构建及 CP4-EPSPS 蛋
白的表达 将目的基因连入 pMD18-T 载体验证后
与 pET-28a（+）载体连接，构建表达载体 pET28a-
CP4。将重组载体 pET28a-CP4 导入 Rossetta 表达菌，
IPTG（ 终 浓 度 1 mmol/L） 诱 导， 破 碎 菌 体，SDS-
PAGE 电泳分析。
1.2.3 CP4-EPSPS 蛋白的纯化 将诱导后的菌液离
心弃去上清液，加入 5 mL PBS 缓冲液（pH7.4）反
复冻融，收集上清液，利用 Ni-NTA-琼脂糖亲和层
析柱纯化，SDS-PAGE 电泳进行分析。
1.2.4 CP4-EPSPS 单克隆抗体的制备
1.2.4.1 免疫小鼠 以重组 CP4-EPSPS 蛋白作为抗
原，加入等体积完全弗氏佐剂对 BALB/c 小鼠腹腔
注射进行基础免疫，剂量为 100 μg/ 只。每隔一周
以 100 μg CP4-EPSPS 蛋白加入等体积不完全弗氏佐
剂加强免疫 3 次，末次免疫一周后，取尾静脉血检
测抗体滴度，当达到 1∶1×105，注射 200 μg CP4-
EPSPS 蛋白追加免疫，3 d 后，取脾细胞进行细胞
融合。
1.2.4.2 杂交瘤细胞的建立及 mAb 腹水的制备 无
菌条件下取小鼠脾脏，分离脾细胞，与 SP2/0 细胞
以 10∶1 比例进行融合。以重组 CP4-EPSPS 蛋白为
抗原，邻苯二胺（OPD）为底物利用间接 ELISA 方
法筛选阳性杂交瘤细胞。通过有限稀释法使杂交瘤
细胞为 100% 阳性，按照常规方法制备腹水，利用
Protein G 亲和层析柱纯化 mAb。
1.2.4.3 mAb 特异性鉴定 （1）间接 ELISA 法 ：用
转 CP4-EPSPS 大豆总蛋白提取物和非转基因大豆总
蛋白提取物，包被 96 孔酶标板。一抗为阳性杂交瘤
细胞培养上清，二抗为辣根过氧化物酶（HRP）标
记的兔抗鼠 IgG，OPD 进行显色，测定 A490 值。（2）
Western blot 法：将转 CP4-EPSPS 大豆总蛋白提取物、
121℃高压处理过的转 CP4-EPSPS 大豆总蛋白提取
物、100 ℃ 煮 沸 过 转 CP4-EPSPS 大 豆 总 蛋 白 提 取
物、重组膦丝菌素乙酰转移酶蛋白（Phosphinothricin
acetyltransferase，PAT）及非转基因大豆总蛋白提取
物进行 SDS-PAGE 电泳并转移到 PVDF 膜上。一抗
阳性杂交瘤细胞培养上清，二抗为 HRP 标记的兔抗
鼠 IgG，二氨基联苯胺（Diaminobenzidine，DAB）显色。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第4期208
1.2.4.4 腹水 mAb 效价测定及 Ig 亚型鉴定 （1）腹
水 mAb 的效价测定 ：将纯化后的腹水 mAb 等梯度
稀释，以重组 CP4-EPSPS 蛋白为抗原，采用间接
ELISA 法进行测定。（2）Ig 亚型的鉴定 ：按照说明
书进行测定。
1.2.4.5 mAb 相对亲和力的测定 利用间接 ELISA
法 进 行 测 定［14，15］。 以 10 mg/L 重 组 CP4-EPSPS 蛋
白为抗原包被 96 孔酶标板，一抗为倍比稀释的腹水
mAb，二抗为 HRP 标记的兔抗鼠 IgG，OPD 显色，
读取 A490 值。
1.2.4.6 mAb 表位分析 参照李月红等［16］介绍的
ELISA 叠加试验进行检测。
2 结果
2.1 CP4-EPSPS蛋白的表达
转化后菌株经 IPTG 诱导，SDS-PAGE 电泳显示
（图 1），在相对分子质量 49 kD 处，可溶性上清和
菌体沉淀中均有特异性条带，而未诱导的菌株没有
相应条带。
kD
M 1 2 3 4
66.2
45.0
33.0
26.0
94.0
M ：蛋白质 Marker ；1 ：诱导菌体裂解后产生的可溶性上清 ；2 ：未诱导菌体
裂解后产生的可溶性上清 ；3 ：诱导菌体裂解后产生的沉淀 ；4 ：未诱导菌
体裂解后产生的沉淀
图 1 CP4-EPSPS 蛋白表达 SDS-PAGE 电泳分析
M 1 2 3 4
kD
94.0
66.2
45.0
33.0
26.0
M ：蛋白质 Marker ；1，2 ：纯化后的重组 CP4-EPSPS 蛋白 ；3 ：诱导后菌体
裂解产生的可溶性上清 ；4 ：未诱导菌体裂解后产生的可溶性上清
图 2 纯化后重组 CP4-EPSPS 蛋白的 SDS-PAGE 电泳分析
ELISA 法 测 定 小 鼠 腹 水 效 价，1A5 为 106，8A3 为
5×105，抗体 Ig 亚型均为 IgG1 亚型。
2.5 mAb相对亲和力的测定
经间接 ELISA 方法测定，2 株抗体的相对亲和
力均大于 105。
2.6 mAb表位分析
通过 ELISA 叠加实验对 2 株抗体进行初步的表
位分析，测得 AI 等于 87.7%，大于 30%，表明这 2
株抗体识别 CP4-EPSPS 蛋白上不同的抗原表位。
3 讨论
豆制品在加工过程中，高温、高压及机械搅拌
等会破坏蛋白质特定的空间结构，使蛋白质变性失
活。蛋白质空间结构的变化，可能会使相应的抗体
对其不进行识别，从而增加了检测的难度。本研究
制备的 2 株单克隆抗体不仅可以与天然 CP4-EPSPS
蛋白［17］发生反应，对于 100℃煮沸和 121℃高压过
表 1 CP4-EPSPS 单克隆抗体特异性间接 ELISA 法检测
检测抗体
待测样品
转基因大豆总蛋白提取物 CP4-EPSPS 蛋白 阴性对照
8A3 1.576 3.114 0.056
1A5 1.328 2.654 0.058
1 2 3 4 5 6
1A5
8A3
1 ：转 CP4-EPSPS 基因大豆总蛋白提取物 ；2 ：经 100℃煮沸 20 min 的转
CP4-EPSPS 基因总大豆蛋白提取物 ；3 ：经 121℃高压处理 20 min 的转 CP4-
EPSPS 基因大豆总蛋白提取物 ；4 ：非转基因大豆的总蛋白提取物 ；5 ：重组
PAT 蛋白 ；6 ：空白对照
图 3 CP4-EPSPS 单克隆抗体的 Western blot 分析
2.2 CP4-EPSPS蛋白的纯化及鉴定
对可溶性 CP4-EPSPS 蛋白进行纯化，获得高纯
度 CP4-EPSPS 蛋白（图 2）。
2.3 CP4-EPSPS 单克隆抗体特异性鉴定
经间接 ELISA 法和 Western blot 法鉴定（表 1，
图 3），所制备的 2 株抗体均能识别变性和非变性的
天然 CP4-EPSPS 蛋白，而与重组 PAT 蛋白和大豆其
它蛋白无交叉反应，具有良好的特异性。
2.4 腹水mAb效价测定及Ig亚型鉴定
以重组 CP4-EPSPS 蛋白作为抗原，采用间接
2013年第4期 209李忠鹏等 ：CP4-EPSPS 夹心 ELISA 配对单克隆抗体的研制和生物学特性分析
的 CP4-EPSPS 蛋白也能够特异性的识别，为后续试
验奠定了基础。
目前，对于转基因产品检测主要从 DNA 和蛋白
质两方面进行。相比于 DNA 检测，基于 ELISA 检测
技术和试纸条技术的蛋白质检测更加快速简单。本
研究制备了 2 株 CP4-EPSPS 单克隆抗体，经 ELISA
叠加实验测定，AI 值为 87.7%，表明这 2 株抗体所
识别的抗原表位不同。AI<30% 为识别同一抗原表位，
AI≧30% 为识别不同的抗原表位，AI 值越大，抗原
表位重叠的可能性越小。因此，1A5 和 8A3 可作为
夹心 ELISA 配对抗体用于后续的检测试验。
4 结论
本研究成功构建的原核表达载体 pET28a-CP4 能
够高效表达，纯化后获得高纯度重组 CP4-EPSPS 蛋
白。以重组 CP4-EPSPS 蛋白为抗原免疫 BALB/c 雌鼠，
获得了 2 株单克隆抗体，8A3 和 1A5。8A3 和 1A5
均具有良好的特异性，且所识别的抗原表位不同，
可作为夹心 ELISA 配对抗体用于后续的检测试验。
参 考 文 献
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（责任编辑 李楠）