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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第2期
百合（Lilium spp.）是世界著名鲜切花，消费
量逐年攀升［1］，并且百合在花卉市场上占有重要位
置［2］。由于东北地区多以亚洲百合栽培为主，为了
进一步提高亚洲百合的抗寒、抗旱性，因此开展将
抗性基因导入百合的研究对百合抗性品种筛选具有
重要的指导意义。而百合遗传转化体系多以直接再
生方式为主［3］，遗传转化中多采用农杆菌介导法。
如刘菊华等［4］以鳞片为受体，通过农杆菌介导法将
携带有几丁质酶基因和 β-1，3 葡聚糖酶基因导入百
合，得到了转基因植株。陈莉等［5］以麝香百合‘White
Elegance’叶片为受体，将 Mn-SOD 基因导入百合中，
以直接再生为主产生抗性植株。因此，通过农杆菌
收稿日期 ： 2013-08-23
作者简介 ：张焕，女，硕士研究生，研究方向 ：园林植物遗传育种 ；E-mail ：ZHLQ8584@163.com
通讯作者 ：樊金萍，女，教授，研究方向 ：园林植物遗传育种 ；E-mail ：fan_xuer2000@aliyun.com
农杆菌介导亚洲百合转化体系的建立及转 GsZFP1
基因研究
张焕1  郑佳2  阚丹丹3  樊金萍1
（1. 东北农业大学园艺学院，哈尔滨 150030 ；2. 伊春市南岔区人事局，153000 伊春 ；3. 黑河市爱辉区纪检委，黑河 164300）
摘 要： 以亚洲百合‘耀眼’（Cedeazzle）无菌苗小鳞片为遗传转化受体，并利用农杆菌介导法将锌指转录因子基因 GsZFP1
转化‘耀眼’无菌苗小鳞片，初步建立亚洲百合‘耀眼’的遗传转化体系，通过筛选获得了 50 株疑似转化植株，通过用 PCR 方
法对获得的 50 株疑似抗性植株进行检测，结果显示 20 株呈阳性，PCR 阳性转化率为 40% ；将得到的阳性植株进行 RT-PCR 检测，
获得 12 株 RT-PCR 阳性植株。结果表明，锌指转录因子基因 GsZFP1 在亚洲百合‘耀眼’中得到表达。
关键词 ： 亚洲百合 鳞片 转化体系 农杆菌介导 GsZFP1 基因
Establishment of Agrobacterium-mediated Asiatic Lily‘Cedeazzle’
Transformation System and Transfer of GsZFP1 Genes
Zhang Huan1 Zheng Jia2 Kan Dandan3 Fan Jinping1
（1. College of Horticulture，Northeast Agricultural University，Harbin 150030 ；2. Personnel，Nancha area，Yichun 153000 ；
3. JiJianWei，Aihui District，Heihe 164300）
Abstract:  With small scales of aseptic seedling as genetic transformation, zinc finger transcription factor gene GsZFP1 was transformed
into‘Cedeazzle’aseptic small scales by Agrobacterium-mediated, and the genetic transformation system of Asiatic Lily‘Cedeazzle’was
established. Fifty putative transgenic plants were obtained, and 20 were identified as positive transgenic plants by PCR assay, PCR transform rate
was 40% ；and 12 positive plants were obtained by RT-PCR test. The results showed that GsZFP1 was expressed in Asiatic Lily‘Cedeazzle’.
Key words:  Asiatic lily Small scales Transformation system Agrobacterium-mediated GsZFP1 gene
介导法将抗性基因导入百合的研究是必要的。
锌指蛋白是目前发现种类最多、在真核细胞中
具有重要调控作用的一类核酸结合蛋白［6］。它是一
类具有指状结构域的转录因子，普遍存在于植物中，
主要功能涉及植物的生长发育和对环境胁迫的应答
反应［7-9］。它对生物的发育及逆境胁迫的耐受能力
都有着重要关系［10］。目前植物研究较多、较为明确
的锌指蛋白是 C2H2 型锌指蛋白，该蛋白大部分锌
指结构具有一段高度保守的氨基酸序列 QALGGH，
这是植物中独有的特征［11］。研究表明，超量表达
C2H2 类型的 ZFPs 不但提高了植物对盐、干旱及低
温等非生物胁迫的耐性，还同时改变了下游基因表
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第2期92
达及胁迫响应信号通路的传递［12-15］。GsZFP1 基因
的表达产物属于 C2H2 锌指蛋白。GsZFP1 基因是罗
晓等［16，17］首次从野生大豆中克隆出来的，并且经
研究表明，该基因能提高拟南芥植株的耐干旱、耐
冷性。
本试验用的植物表达载体 pCEOM-GsZFP1 带有
CaMV35S 启动子、E12 增强子和 bar 筛选标记基因，
CaMV35S 启动子是广泛运用的组成型启动子，在植
物中表达效率高［18］，bar 基因不仅可以作为筛选标
记基因使用，还具有农艺价值且是国家公认的安全
性基因［19］。本研究通过农杆菌介导法将 GsZFP1 基
因导入亚洲百合‘耀眼’（Cedeazzle），期待提高其
对干旱及冷的抗性，为今后培育亚洲百合抗性品种
奠定一定的理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料 亚洲百合‘耀眼’（Cedeazzle）鳞
茎，由东北农业大学园艺试验站温室提供。
1.1.2 菌株和质粒 大肠杆菌菌株 DH5α、农杆菌
GV3101 均由东北农业大学园艺学院园林育种实验室
提供 ；重组质粒 pCEOM-GsZFP1 由东北农业大学植
物生物工程研究室提供。
1.1.3 常用试剂及酶类 DNA Marker DL2000、dN-
TPs、Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System 均购自
大连宝生物工程公司，PCR 引物由哈尔滨博仕生物
工程公司合成。
1.1.4 培养基和培养条件 试验各个阶段所用的最
佳培养基组成及其编号，见表 1，各培养基中均含
3.0% 蔗糖和 0.7% 琼脂，pH 为 5.82，121℃灭菌 20
min ；培养条件 ：温度为（25±1）℃、光照强度为
25 μmol（m2· s）、光照周期为 16 h。
1.2 方法
1.2.1 质粒 DNA 的提取及检测 采用中科瑞泰质粒
小剂量提取试剂盒提取，提取重组质粒 DNA 后，进
行 PCR 及凝胶电泳检测。
1.2.2 冻融法转化根癌农杆菌及检测 采用冻融法
将 质 粒 pCEOM-GsZFP1 转 入 根 癌 农 杆 菌 GV3101，
先制备农杆菌 GV3101 感受态细胞，再将重组质粒
转入农杆菌感受态细胞中，最后进行检测。
1.2.3 农杆菌介导亚洲百合‘耀眼’的遗传转化
1.2.3.1 转化受体材料的获得 剥取较厚大的亚洲
百合‘耀眼’鳞片，先用流水冲洗 40 min 左右，再
在超净工作台中经过一系列灭菌之后接种至 M1 培
养基中，进行不定芽分化培养（图 1-A）；当不定芽
长至 3-5 cm 时从基部切下，接种至 M2 培养基上，
先暗培养 15 d，再取出置于组培室，进行试管鳞茎
诱导培养（图 1-B），培养 45 d 左右时，取试管鳞茎
上较厚大的小鳞片接种至 M3 培养基上，进行预培养，
5 d 左右时即可进行侵染（图 1-C）。
表 1 试验所用培养基组成和编号
培养基编号 培养基用途 培养基组成成分
M1 鳞片不定芽分化培养基 MS+6-BA 3.0 mg/L+ NAA0.2 mg/L
M2 试管鳞茎诱导培养基（暗培养） MS+NAA0.5 mg/L+ 40 g/L 蔗糖
M3 小鳞片不定芽分化培养基（用于预培养和共培养） MS+6-BA 2.5 mg/L+ NAA 0.3 mg/L
M4 筛选培养基（含筛选剂、除菌剂） MS+ 6-BA 2.5 mg/L+ NAA 0.3 mg/L+ PPT1.75 mg/L+ Cef 300 mg/L
M5 生根筛选培养基 MS+ NAA 0.5 mg/L+ PPT 1.25 mg/L
A B C
A ：‘耀眼’鳞片分化不定芽 ；B ：‘耀眼’试管鳞茎的诱导 ；C ：小鳞片预培养
图 1 转化受体材料的获得
1.2.3.2 农杆菌侵染液的准备 先用接菌环挑取单
菌落接种在 10 mL 含相应抗生素的 YEB 液体培养基
中，于 28℃，200 r/min 振荡培养，至菌液 OD600 为
0.5-0.6，约 36 h ；然后用接种环蘸取一次活化的菌
液按 1∶10 的比例接种在 50 mL 添加相应抗生素的
2014年第2期 93张焕等 ：农杆菌介导亚洲百合转化体系的建立及转 GsZFP1 基因研究
YEB 液体培养基中二次活化，于 28℃，200 r/min 振
荡培养，至 OD600 为 0.5-0.6，约 16 h ；最后将菌液
移至无菌离心管中于 10 000 r/min 离心 10 min，弃上
清，用等体积的 MS 液体培养基重悬，再振荡 1-2 h，
至 OD600 为 0.5-0.6，即可作为侵染液备用。
1.2.3.3 筛选剂草丁磷（PPT）浓度的确定 选取试
管鳞茎上生长厚大的小鳞茎，用刀片切成约 0.25 cm2
左右的小块，在侵染液（OD600 为 0.5-0.6）中侵染
20 min，接种在附加不同浓度 PPT（0、0.5、0.75、
1.0、1.25、1.5、1.75、2.0 mg/L）的分化培养基上，
15 d 继代一次，30 d 后观察小鳞片不定芽分化情况 ；
选取分化较好的不定芽从基部切下，接种在附加不
同 浓 度 PPT（0、0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5
mg/L）的生根培养基上，25 d 后观察生根情况。
1.2.3.4 抑菌剂头孢霉素（Cef）浓度的确定 本试
验选用头孢霉素（Cef）作为抑菌剂，用接种环把农
杆菌 GV3101 在附加不同浓度 Cef 的 YEB 固体培养
平板上划线，放置在培养箱内进行 28℃暗培养，2-3
d 后观察抑菌效果，初步确定抑菌剂的大致浓度。
再进一步做外植体敏感性试验。将转化受体材料（小
鳞片）在侵染液（OD600 为 0.5-0.6）中浸泡 15-20
min，取出材料并用无菌滤纸吸干，接种到含有不
同 浓 度（0、150、200、250、300、350、400 mg/L）
Cef 除菌筛选培养基上，15-20 d 继代一次，随时观
察 Cef 的抑菌效果对小鳞片分化的影响，培养 40 d
后统计分化情况。
1.2.3.5 农杆菌最适侵染时间的确定 将外植体侵
染时间设为 5、10、15、20、25、30 min 6 个梯度。
用准备好的农杆菌侵染液侵染预培养 5 d 的‘耀眼’
小鳞片，然后将其接种至 M3 培养基上，共培养 3 d
左右时，取出接种至 M4 培养基上进行不定芽分化，
培养一段时间后，将分化的不定芽从基部切下，接
种至 M5 培养基上进行生根培养，观察记录其生长
状况。
1.2.4 转基因植株的分子检测
1.2.4.1 转基因植株的 PCR 检测 用 CTAB 法提取
转化后获得的抗性植株叶片 DNA，以叶片 DNA 为
模板，以植物表达载体上 Bar-35S 启动子序列特异
引物进行 PCR 检测。
1.2.4.2 PCR 阳 性 植 株 的 RT-PCR 检 测 提 取 经
PCR 检测阳性植株及非转基因植株的总 RNA，首
先将其反转录，然后以反转录产物为模板，对转
GsZFP1 基因阳性植株进行 RT-PCR 检测，以检测目
的基因在转录水平上的表达。
2 结果
2.1 大肠杆菌质粒DNA的提取及检测
提取重组质粒 DNA 后，进行 PCR 及凝胶电泳
检测，电泳结果（图 2）显示，转化质粒的阳性克
隆扩增出目的条带。
2000
bp
M +1 1 21
1000
750
500
200
100
M ：核酸分子量标准 DL2000 ；+1 ：阳性对照 ；-1 ：阴性对照 ；1，2 ：
提取的重组质粒 DNA
图 2 大肠杆菌中质粒 DNA 的提取检测
2.2 质粒DNA转化根癌农杆菌及检测
首先采用冻融法将重组质粒 pCEOM-GsZFP1 转
入农杆菌中，其次在含有相应抗生素的 YEB 培养基
上划线，待有单个的菌落长出后，进行摇菌，最后
对得到的菌液进行 PCR 检测。由电泳结果（图 3）
可以看出，扩增出目的条带，说明重组质粒已转入
到根癌农杆菌中，可以用于下一步的转化。
2000
bp
M +1 1 2 31
1000
750
500
200
100
M ：核酸分子量标准 DL2000 ；+1 ：阳性对照 ；-1 ：阴性对照 ；
1-3 ：转化农杆菌菌液
图 3 质粒转化农杆菌菌液的 PCR 鉴定
2.3 农杆菌介导‘耀眼’的遗传转化
2.3.1 筛选剂草丁磷对外植体分化率的影响 经过
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第2期94
不同浓度的草丁磷筛选试验，30 d 后观察可知，小
鳞片随着草丁磷浓度的上升分化率明显降低（图 4），
统计数据发现草丁磷浓度为 1.0 mg/L 时，‘耀眼’小
鳞片的分化率明显降低，为 38.34% ；草丁磷浓度为
1.5 mg/L 时，‘耀眼’小鳞片的分化率急剧下降，为
8.34% ；当草丁磷浓度为 1.75 mg/L 时，‘耀眼’小鳞
片的分化率为 3.33%，鳞片已经不能分化出健康的
不定芽（表 2）。因此，以鳞片作为转基因受体分化
不定芽时，筛选剂草丁磷浓度以 1.75 mg/L 为宜。
步筛选确定了抑菌剂的大概浓度为 300 mg/L，然后
在除菌筛选阶段，以 300 mg/L 为基准再分别上下设
定不同的浓度进行处理，1 周后观察效果（表 4）。
Cef 在 300-350 mg/L 范围内能有效抑制农杆菌的生
长，当 Cef 浓度为 300 mg/L 时，外植体的分化率为
78.34%，相对较高 ；而当 Cef 浓度为 350 mg/L 时，
外植体的分化率为 41.67%，分化率相对较低。本着
筛选不抑制植物生长的最大浓度的原则，确定‘耀
眼’转化抑菌剂浓度为 300 mg/L。外植体不定芽长
至 3-5 cm 时，从基部切下，在 300 mg/L 浓度的抑
菌剂溶液中冲洗一下，并用滤纸吸干，再接种至无
菌苗生根培养基中。
表 4 抑菌剂浓度梯度试验
Cef 浓度
（mg/L）
接种外植体数
（个）
外植体分化数
（个）
分化率
（%）
0 20 19.667 ± 0.577 98.36
150 20 19.000 ± 0.500 95.00
200 20 18.833 ± 0.289 94.17
250 20 18.167 ± 0.288 90.83
300 20 15.667 ± 1.528 78.34
350 20 8.333 ± 1.527 41.67
400 20 3.500 ± 1.323 17.50
该试验的数据均为 3 次重复的均值
2.3.3 农 杆 菌 侵 染 时 间 对‘ 耀 眼 ’ 转 化 率 的 影
响 由表 5 可知，侵染时间为 5-10 min 时，分化率
较低 ；侵染时间为 25-30 min 时，褐化率较高，除
菌较困难 ；侵染时间为 .15-20 min 时，外植体分化
率较高，长势较好，易除菌。其中侵染时间为 20
min 时，分化率最高且长势好。因此，‘耀眼’无菌
苗小鳞片最适宜的侵染时间为 20 min。
2.3.4 亚洲百合‘耀眼’遗传转化以及抗性植株再
生 农杆菌介导亚洲百合‘耀眼’转化及抗性植株
0 1 2 3
4 5 6 7
0 ：0 mg/L 草丁磷 ；1 ：0.5 mg/L 草丁磷 ；2 ：0.75 mg/L 草丁磷 ；3 ：1.0
mg/L 草丁磷 ；4 ：1.25 mg/L 草丁磷 ；5 ：1.50 mg/L 草丁磷 ；6 ：1.75
mg/L 草丁磷 ；7 ：2.0 mg/L 草丁磷
图 4 筛选剂草丁磷（PPT）对外植体不定芽 分化的影响
表 2 ‘耀眼’无菌苗小鳞片不定芽分化对草丁磷的抗性
PPT 浓度
（mg/L）
接种外植体数
（个）
外植体分化数
（个）
分化率
（%）
0 20 19.667 ± 0.577 98.33
0.5 20 19.333 ± 0.577 96.67
0.75 20 17.667 ± 1.528 88.33
1.0 20 7.667 ± 1.545 38.34
1.25 20 4.667 ± 1.545 23.35
1.5 20 1.667 ± 0.577 8.34
1.75 20 0.667 ± 0.577 3.33
2.0 20 0.167 ± 0.289 0.83
该试验的数据均为 3 次重复的均值
由表 3 可知，不定芽根的分化随着草丁磷浓度
的上升分化率明显降低。统计数据发现草丁磷浓度
为 0.75 mg/L 时，根的分化率明显降低，为 36.67% ；
草丁磷浓度为 1.0 mg/L 时，根的分化率急剧下降，
为 17.50% ；当草丁磷浓度为 1.25 mg/L 时，根的分
化率为 4.27%，不定芽已经不能分化出健康的根。
因此，当转基因不定芽分化根时，筛选剂草丁磷浓
度以 1.25 mg/L 为宜。
2.3.2 抑菌剂头孢霉素（Cef）浓度的确定 经初
表 3 ‘耀眼’无菌苗根分化对草丁磷的抗性
PPT 浓度（mg/L） 接种芽数（个） 生根数（个） 生根率（%）
0 20 19.667 ± 0.557 98.33
0.25 20 13.333 ± 0.557 65.00
0. 5 20 11.667 ± 1.528 58.35
0.75 20 7.333 ± 1.545 36.67
1.0 20 3.500 ± 0.866 17.50
1.25 20 0.833 ± 0.764 4.27
1. 5 20 0.067 ± 0.076 0.33
该试验的数据均为 3 次重复的均值
2014年第2期 95张焕等 ：农杆菌介导亚洲百合转化体系的建立及转 GsZFP1 基因研究
再生的过程如图 5 所示，首先对预培养的小鳞片进
行侵染（5-A）、预培养（5-B）；其次进行抗性芽的
筛选（5-C）及芽伸长培养（5-D）；然后进行抗性苗
的生根筛选（5-E，F）；最后进行移栽，获得转基因
植株（5-G）。
表 5 农杆菌侵染时间对分化的影响
侵染时间（min） 侵染数量 分化外植体数 分化率（%） 外植体生长情况
5 20 4 20.00 分化率低
10 20 7 35.00 褐化率较低
15 20 10 50.00 分化率较高，长势较好
20 20 16 80.00 分化率高，长势好
25 20 13 65.00 分化率较低，褐化率较高，除菌困难
30 20 9 45.00 褐化率高，除菌困难
A：农杆菌菌液侵染；B：侵染后共培养；C：不定芽的诱导及筛选；
D ：抗性芽的伸长 ；E，F ：抗性苗的生根 ；G ：抗性植株的移栽
图 5 亚洲百合‘耀眼’遗传转化及抗性植株再生
A B C D
E F G
2000
bp
M +1 CK1 2 3 4 5 6 7 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2081
1000
750
500
200
100
M ：核酸分子量标准 DL2000 ；+1 ：阳性对照 ；-1 ：阴性对照 ；
CK ：非转基因植株 ；1-20 ：转 GsZFP1 基因抗性植株
图 6 转 GsZFP1 基因抗性植株部分 PCR 检测结果
2.4 ‘耀眼’转基因植株的分子检测
2.4.1 转基因植株的 PCR 检测 对筛选出的 50 株
疑似抗性植株进行 PCR 检测，用 Bar-35S 启动子序
列特异引物，以质粒为阳性对照，水为阴性对照，
非转基因植株为负对照对转基因植株进行初步的筛
选。经初步检测，在试验得到的 50 株疑似转基因植
株中，共得到 20 株 PCR 阳性植株，PCR 阳性转化
率为 40%，初步证明锌指转录因子基因 GsZFP1 已
转入到亚洲百合‘耀眼’中。部分检测结果见图 6。
2.4.2 阳 性 植 株 的 RT-PCR 检 测 为 进 一 步 检 测
GsZFP1 在转基因植株中的表达情况，进行 RT-PCR
检测。经检测，筛选到的 20 株 PCR 阳性植株中，
有 12 株为 RT-PCR 阳性植株，说明基因 GsZFP1 在
这些植株中有成功转录的，但也有不转录的。部分
检测结果见图 7。
2000
bp
1000
750
500
200
100
M +1 1 2 3 4 5 6 7 981
M ：核酸分子量标准 DL2000 ；-1 ：阴性对照 ；+1 ：阳性对照 ；
1-9 ：转 GsZFP1 基因 PCR 阳性植株
图 7 转 GsZFP1 基因部分阳性植株 RT-PCR 检测
3 讨论
由 于 本 试 验 所 使 用 的 植 物 表 达 载 体 pCEOM-
GsZFP1 上带有 bar 筛选标记基因，因此选用草丁磷
为筛选剂。在之前亚洲百合转基因过程中，多数以
卡那霉素及羧苄青霉素作为筛选剂，只有王凯等［20］
在以亚洲百合‘金黄精灵’为受体材料，建立遗传
转化体系的过程中，以草丁磷为筛选剂，并且得出
芽分化阶段 PPT 浓度为 1.6 mg/L，根分化阶段 PPT
浓度为 0.8 mg/L。本研究通过筛选剂浓度梯度试验确
定亚洲百合‘耀眼’芽分化阶段 PPT 最适的浓度为
1.75 mg/L，根分化阶段 PPT 最适的浓度为 1.25 mg/L。
试验结果与前者不同，这说明亚洲百合不同品种在
遗传转化的过程中，使用的筛选剂浓度也不同。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第2期96
本试验对筛选植株进行了 PCR 检测和 RT-PCR
检测，初步证明 GsZFP1 基因已在亚洲百合‘耀眼’
表达，但对于转基因‘耀眼’的抗旱性及耐冷性仍
需进一步试验研究，包括对转基因植株进行基因表
达水平的定量分析、基因表达对植株生理代谢的影
响及遗传稳定性的表达等，以筛选出表达强、抗逆
性提高幅度大且生长正常的转基因植株，为以后百
合的抗性育种和推广应用奠定一定的理论基础。
4 结论
本研究以亚洲百合‘耀眼’无菌苗小鳞片为
转化受体，以根癌农杆菌 GV3103 为转化的菌株，
bar 基因为筛选标记基因，CaMV35S 为启动子，将
GsZFP1 基因导入亚洲百合‘耀眼’，建立亚洲百合‘耀
眼’的遗传转化体系，通过筛选获得了 50 株疑似转
化植株，用 PCR 方法对获得的 50 株疑似抗性植株
进行检测，结果显示 20 株呈阳性，PCR 阳性转化率
为 40% ；将得到的阳性植株进行 RT-PCR 检测，获
得 12 株 RT-PCR 阳性植株。结果表明锌指转录因子
基因 GsZFP1 在亚洲百合‘耀眼’中得到表达。
参 考 文 献
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（责任编辑 李楠）