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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第12期
自 1990 年 Wolf 等［1］首次报道裸 DNA 免疫可
诱导特异免疫应答以来，基因免疫已被广泛用于实
验研究中，并显示出潜在的应用前景。P2X 家族被
认为是继烟碱受体大家族和谷氨酸受体大家族后的
第 3 类配体门控离子通道，并已知 P2X 受体包括 7
种亚型，即 P2X1-7［2-4］。 P2X7 受体基因位于染色
收稿日期 : 2012-07-06
基金项目 : 湖北省自然科学基金资助项目（2009CDZ024）, 三峡大学研究生科研创新基金项目（2011CX059）
作者简介 : 谭超 , 男 , 硕士研究生 , 主管技师 , 研究方向 : 分子免疫学 ; E-mai: yczxyytanchao@sina.com
通讯作者 : 韩莉 , 女 , 研究方向 : 感染、肿瘤与免疫 ; E-mail: hlyyh@ctgu.edu.cn
P2X7 受体短肽单克隆抗体的制备及鉴定
谭超1，2  韩莉1  神谢静1
（1 三峡大学医学院，宜昌 443002 ；2 三峡大学第一临床医学院 宜昌市中心人民医院检验科，宜昌 443002）
摘 要 ： 旨在制备与鉴定鼠抗 P2X7 受体的蛋白单克隆抗体。以人 P2X7 受体的胞外段制备短肽作为抗原，皮下注射免疫
Balb/c 小鼠。分离小鼠脾脏 B 淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合并培养，挑选阳性杂交瘤细胞，扩大培养，制备和鉴定 P2X7 其生物学效
应。结果显示，获得 1 株稳定分泌抗人 P2X7 受体的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所分泌的单抗类型重链为 IgG1，轻链为 κ ；该株
杂交瘤细胞腹水效价为 1∶6.4×104 ；传 30 代及液氮中保存 6 个月，抗体效价稳定 ；Western blotting 检测证明该单抗与人细胞表面
的 P2X7 受体蛋白特异地结合。所制备的抗人 P2X7 受体的单克隆抗体具有高度的特异性及稳定性，为针对 P2X7 受体为靶点的抗
体药物的开发应用、疾病的辅助诊断奠定了基础。
关键词 ： P2X7 受体 短肽 单克隆抗体
The Preparation and Identification of P2X7 Short Peptide Receptor
Monoclonal Antibody
Tan Chao1，2 Han Li1 Shen Xiejing1
（1 Medical Science College of China Three Gorges University，Yichang 443002 ；2Department of Internal Medicine Yichang Central People’s
Hospital Laboratory Medicine，the First Clinical Medical College of China Three Gorges University，Yichang 443002）
Abstract:  The aim was to prepare and identify the monoclonal antibodies of the P2X7 receptor. Our method was to use the extracellular
fragment of human beings’ P2X7 receptor to produce the short peptide as an antigen to immunize mouse for three times. Then B lymphocytes
were isolated from the mouse spleen, and then mixed with myeloma cells and cultured. The positive hybridoma clones were selected and widely
cultured to prepare and identify the biological effects of P2X7. The supernatant was collected and purified by HiTrap protein G affinity column.
The results were as follows. Firstly, a stable hybridoma cell line secreting mAb against human P2X7 receptor was obtained, and the heavy and
light chains of the secreted mAb were IgG1 and κ respectively. The titers of the ascites was 1∶6.4×104, which was remained stable after
subculture of hybridoma cells for 30 passages or storage at liquid nitrogen for 6 months. Secondly, the western blotting test showed that the mAb
could specifically bind to P2X7 receptor. The conclusion was that the prepared mAb against P2X7 receptor showed high specificity and stability,
which laid a foundation for the development of the antibody drug aimed at P2X7 receptor as a target antigen.
Key words:  P2X7 receptor Short peptide Monoclonal antibody
体 12q24 上，由 595 个氨基酸组成，相对分子质量
为 70-75，由胞外 ATP 和一些 ATP 药理类似物直
接门控，最初发现于淋巴细胞和巨噬细胞上。P2X7
受体具有一个庞大的胞外结构域以及两个跨膜结构
域，其 N 端和 C 端均在胞内，其中在细胞外的环状
结构中有 3 个 N-糖基化位点，18-21 个赖氨酸残基
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第12期168
及 1 个含 10 个半胱氨酸的区域，该区域被认为是
ATP 的结合位点［5］。P2X7 受体 N 端的序列结构高
度保守，有 395 个氨基酸，与 P2X 受体家族的其他
成员有 35%-40% 的同源性 ；其 C 端在 P2X 受体家
族成员中最长，大约由 244 个氨基酸组成［6］，并且
包含多种蛋白质和脂质的结合模序，与其他已知蛋
白也无同源性，这是 P2X7 受体独特功能的分子基
础。P2X7 蛋白易形成多聚体结构，一般为三聚体，
也会以寡聚体的方式分布在细胞膜表面［7］。P2X7 受
体不同于 P2X 家族的其他亚型，是最特殊的受体 / 通
道。当细胞外低浓度 ATP 刺激 P2X7 受体时，可引
起选择性离子通道打开，允许钾、钠、钙等阳离子
跨膜流动，并对二价阳离子（Mg2+、Ca2+ 等）表现
出相对较强的选择性 ；但在低二价阳离子环境及持
续 ATP 刺激下，激活的 P2X7 受体能形成大的非选
择性的水孔，可以通透相对分子质量低于 900 的亲
水性溶质分子［8］。P2X7 受体的这种“膜孔”作用属
于 ATP 的细胞毒作用，可造成多种离子的通透性增
加和细胞内小分子代谢物丢失，可能与细胞的水肿、
空泡形成、坏死和凋亡有关［9］。故本试验通过 P2X7
受体胞外段的短肽制备单克隆抗体，来进一步研究
其在生理机制的作用及在医学辅助诊断中的应用。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物与细胞 雌性 Balb/C 小鼠，体重 18-22 g，
6-8 周龄（湖北省疾病控制防治中心提供）；SP2/0
细胞由本实验室提供。
1.1.2 主 要 试 剂 DMEM 培 养 基， 新 生 胎 牛 血 清
（FBS）购自北京钮因华信科技发展有限公司 ；青霉
素、链霉素、L-谷氨酰胺、二甲基亚砜（DMSO）；
辣根过氧化物酶（HRP）标记羊抗鼠免疫球蛋白
G（IgG）；福氏完全佐剂（FCA），福氏不完全佐剂
（FIA）， 次黄嘌呤、氨基碟呤和胸腺嘧啶核苷（HAT），
50%PEG1000，次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷（HT）购
自 Sigma 公司 ；抗体亚类鉴定试剂盒购自 Southern
Biotech 公司。
1.1.3 主要器材 CO2 培养箱（型号 Feb-23）美国
SHELDON MANUFACTORIN 公 司， 恒 温 箱（ 型 号
LSIK-B2V/ICV55） 德 国 MMM Group 公 司， 超 细 匀
浆器（型号 F6/10）上海弗鲁克液体器械有限公司，
微量核酸蛋白检测仪（型号 ND2000）美国 Thermo
公司，酶联免疫分析仪（型号 MOLD1354）为芬兰
Labsystems 公司产品。
1.2 方法
1.2.1 P2X7 受体短肽的制备 将 P2X7 受体的胞外
段寄到北京伊康纳斯生物有限公司合成短肽，即免
疫原与包被原，序列为 CTRRTLCSS，其浓度为 2.16
mg/mL
1.2.2 小鼠免疫 将 P2X7 受体短肽（25 μg/ 只）与
等量弗氏完全佐剂混合后皮下注射 Balb/c 小鼠，在
2 周后使用同样的等量抗原与弗氏不完全佐剂混合
进行第 2 次免疫。第 2 次免疫 2 周后，取尾血分离
血清，以 P2X7 为检测抗原，检测效价。融合前 3 d，
不加佐剂，等量抗原皮下加强免疫 1 次，3 d 后取脾
制备脾细胞悬浮液进行融合。
1.2.3 细胞融合 脱颈椎处死小鼠，取出脾脏，分
离脾细胞。融合当日收集处于对数生长期的 Sp2/0
骨髓瘤细胞，按 2 1 比例将骨髓瘤细胞与脾细胞混
合，1 000 r/min 离心 10 min，弃上清，混匀 2 种细胞。
缓慢加入 PEG，边加边轻轻搅拌进行细胞融合，用
DMEM 培养基终止 PEG 的作用。离心，将细胞悬浮
于预热的 HAT 培养基。按 150 μL/ 孔接种于 96 孔细
胞培养板中，置于 37℃，5%CO2 培养箱中培养。
1.2.4 筛选分泌抗体的杂交瘤细胞 间接 ELISA ：
①包被 ：酶标板每孔加一定浓度的用包被缓冲液稀
释的包被抗原 100 μL/ 孔，37℃温育 2 h 后用 PBS 洗
涤 1 次 ；②封闭 ：每孔加入 3% 的脱脂奶粉封闭液
300 μL，37℃温育 1 h 后 PBST 洗涤 3 次（下同）；
③加一抗 ：每孔加入 100 μL 抗体稀释液或细胞培养
上清，37℃温育 1 h ；④加二抗 ：洗涤后每孔加入 1
10 000 稀释的酶标二抗 100 μL，37℃温育 1 h ；⑤
显色 ：洗涤后加入底物液 100 μL/ 孔，37℃显色 15
min，最后每孔加入 2 mol/L 的 H2SO4 50 μL 终止反应，
于酶标仪上读取 A450nm 值。根据 ELISA 结果挑出阳
性克隆 4 株 1D5、2E11、2G7、3H6，转种于 24 孔
细胞培养板中，用含有 HT 的 20%FBS OPTI-MEM 培
养基继续培养。采用有限稀释法进行亚克隆，并进
一步扩大培养，收取上清进行中和试验。根据中和
2012年第12期 169谭超等 ：P2X7 受体短肽单克隆抗体的制备及鉴定
试验结果确定最终保留的细胞株为 2G7，再次进行
亚克隆。
1.2.5 单克隆抗体的制备及纯化 采用体内诱生法
大量制备单克隆抗体。取 8 周龄的健康 Balb/c 雌性
小鼠，腹腔注射弗氏不完全佐剂（0.5 mL/ 只）。1 周
后，杂交瘤细胞离心洗涤，用 PBS 调整细胞数至
105-106 mL/L，每只小鼠注射 1 mL。5-7 d 后，待小
鼠腹部增大，采集腹水。离心后收集上清，采用辛酸 -
硫酸铵沉淀法纯化腹水，用紫外分光光度计法测纯
化后腹水蛋白含量，依据公式计算抗体浓度（mg/mL）
=（1.45 A280nm -0.74 A260nm）× 稀释倍数 ；并用 SDS-
PAGE 鉴定纯化后抗体的纯度。分装后于 -70 ℃保存。
1.2.6 单抗效价及亚类鉴定 采用棋盘滴定法确定
包被抗原最佳工作浓度和抗体的稀释度。包被抗原
按 1、2、5、10、15、20 μg/mL 共 6 个浓度竖向包
被于酶标板上，每个浓度两列 ；抗体从 1 ∶ 400 倍
比稀释到 1 25 600 共 7 个浓度，横向加入酶标板
中，最后 1 行为阴性血清对照 ；按照 ELISA 步骤进
行试验，以包被抗原浓度为横坐标，A 值为纵坐标
绘制不同抗体稀释度的曲线图，选定 A 值变化趋于
平缓的包被抗原浓度为最佳工作浓度，该浓度对应
的 A 值在 1 左右的抗体稀释度为抗体的效价。使用
IsoQuick Kit for Mouse Monoclonal Isotyping 试剂盒对
纯化后的腹水单抗亚型进行鉴定，操作步骤按照说
明书。
2 结果
2.1 P2X7受体短肽免疫小鼠血清中抗P2X7的抗体
效价
采用间接 ELISA 法对 3 次免疫后小鼠血清中抗
P2X7 受体抗体的效价进行了测定，并以 P/N ≥ 2.1
的血清稀释度作为血清效价。结果（图 1）表明，
应 用 P2X7 受 体 3 次 免 疫 小 鼠 后， 小 鼠 血 清 中 抗
P2X7 受体抗体具有较高水平的表达。当小鼠血清稀
释度达 1 64 000（P=0.167，N=0.067）以上时，血
清仍可有效地检测到 P2X7 受体。
2.2 分泌抗体的杂交瘤细胞株的观察
融合后第 3 天可见 SP2/0 细胞数锐减，有大量
的破碎细胞，残留的杂交瘤细胞折光性差，或呈暗
黑、皱缩（图 2-A）；可见少数形态良好，透亮的细
1.2
0.8
1.0
0.6
0.4
0.2
0
1:2000 1:4000 1:8000 1:16000 1:32000 1:64000 1:128000
A
45
0n
m
㹰␵〰䟺ᓖ
图 1 不同稀释度小鼠血清抗 P2X7 受体的
抗体的效价的测定
图 2 融合后的杂交瘤细胞株的观察
胞（图 2-B）。融合后第 5 天见瘤细胞几乎全部消失（图
2-C），在巨噬细胞周围聚集着许多大小不等的细胞
碎片，可见形似骨髓瘤细胞，浑圆透亮，呈葡萄状
分布的融合细胞小集落克隆，细胞数多少不等，而
且细胞数增加很快。融合后第 8 天见细胞克隆继续
长大，多达 1/3-1/2 培养孔的面积（图 2-D）。此时
采用间接 ELISA 法检测 96 孔细胞板中的融合细胞
的培养液。其中发现 6 个强阳性孔，选择强阳性克
隆株进一步克隆化，经 3 次克隆，筛选出 4 株强阳
性单克隆细胞，分别为 1D5、2E11、2G7、3H6。
A. 㶽ਸਾㅜ3ཙ僘儃ⱔ㓶㜎ሩ➗ᆄ B. 㶽ਸਾㅜ3ཙ㓶㜎㶽ਸᆄ
C. 㶽ਸਾㅜ5ཙ㓶㜎㶽ਸᆄ D. 㶽ਸਾㅜ8ཙ㓶㜎㶽ਸᆄ
2.3 腹水抗体纯化与浓度分析
取 1D5 腹水经辛酸硫酸铵沉淀法纯化后，用
SDS-PAGE 鉴定纯化后只有两 条带，一条为重链，
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第12期170
约 55 000， 另 一 条 为 轻 链， 约 28 000（ 图 3）。 经
紫外分光光度法测定计算出该腹水抗体蛋白含量为
4.127 mg/mL。
等阳离子及小分子跨膜流动，其中巨噬细胞上形成
的孔道容许通过的最大分子量可达 0.9 kD［11］；二
是 P2X7 受体对 ATP 的亲和力低，需要较高浓度的
ATP（>100 μmmol）才能被激活，如果减少细胞外
二价阳离子（Ca2+ 或 Mg2+）的浓度，可以强化 ATP
激活 P2X7 受体的作用，可能原因是二价阳离子结
合到受体上产生了变构抑制效应。但激动剂 BzATP
在较低的浓度即可以激活 P2X7，oATP、KN-62 及
BBG 等对 P2X7 受体具有相对特异的拮抗作用［12， 13］。
P2X7 受体在细胞的炎症反应中扮演着危险信
号“感受器”的角色 ：即监视炎症部位危险信号
（ATP）的释放情况，促使炎症细胞活化并释放炎症
因子。研究表明人单核吞噬细胞表达功能性 P2X7
受 体， 并 偶 联 IL-1β 和 IL-18 释 放， 其 主 要 机 理
为 ：（1）P2X7 受体在 ATP 作用下被激活并引起胞
内 K+ 浓度下降，K+ 水平的变化会激活 IL-1β 转换酶
（ICE），促进 IL-1β 和 IL-18 由前体蛋白转化为成熟
蛋白［14，15］；（2）P2X7R 通过结合 ATP 活化 NLRP3
炎性复合体（属于 NOD 样家族成员），进而激活
caspase-1，将前体 IL-1β（或 IL-18）剪切为有活性
的 IL-1β（或 IL-18），并促进 IL-1β（或 IL-18）的分
泌。另外，经过 LPS 预处理的单核 / 巨噬细胞，其
细胞表面的 P2X7 受体被激活，再用 ATP 刺激可激
活细胞内的核因子 NF-kb 及 MAPK 信号系统，诱导
下游 caspase-1 的活化，使已合成的 33 kD IL-1β 前
体蛋白和 24 kD 的 IL-18 前体蛋白（无生物学活性），
加工成 17 kD 成熟的 IL-1β 和 18 kD 的 IL-18 并释放
到胞外［16］。Friedle 等［17］研究表明，P2X7 受体激
动剂 BzATP 刺激人单核细胞还能引起 MAPK、NF-
kb、COX2 和组织因子的激活，与膜孔形成、信号传
导和介导子形成有关，由此显示 P2X7 受体在免疫
250
kD
MrM/103 1 2
130
95
72
55
36
28
17
10
M. 蛋白质分子量标准 ；1. 纯化后腹水 ；2. 纯化前腹水
图 3 腹水纯化前后 SDS-PAGE 电泳图
2.4 单抗效价
方阵滴定法结果如图 4 所示，包被抗原浓度达
到 5 μg/mL 后，曲线趋于平缓，所以选定 5 μg/mL 作
为包被抗原工作浓度，对应曲线选择该浓度下 A 值
为 1 对应的抗体稀释度，最终确定 1 6 400 为纯化
后腹水抗体的效价。测定 5 μg/mL 包被抗原浓度下
纯化前腹水抗体效价为 1 3 200，纯化后腹水效价较
纯化前显著提高。经抗体亚型试剂盒鉴定，建立的
4 株细胞株分泌的单抗亚型均为 IgG1 型，轻链为 κ
链。
3 讨论
P2X7 受体是结构和功能独特的 P2X 家族成员，
其生物学功能包括参与细胞信号转导、细胞因子的
分泌、介导细胞的存活与生长等，P2X7 受体表达于
众多的细胞如小胶质细胞、大多数骨髓细胞、粒细
胞、单核 / 巨噬细胞、B 淋巴细胞以及肺、脊髓、脾、
唾液腺和肠道等组织细胞，其中 Jursik 等［10］认为
P2X7 受体在单核细胞、巨噬细胞和淋巴细胞等免疫
细胞中表达较高，影响免疫细胞功能，具有双功能
性 ：一是对二价阳离子表现出较强的选择性，在低
二价阳离子环境及持续 ATP 刺激下，激活的 P2X7
受体能形成大的非选择性的孔道，允许钾、钠、钙
1:400
1:12800
1:25600䱤ᙗሩ➗
1:6400
1:3200
1:1600
1:800
3.0
2.0
1.0
0
0.5
1 2 5 10 15 20
1.5
2.5
A
45
0n
m
包被抗原浓度（μg/mL）
图 4 腹水单抗棋盘滴定曲线
2012年第12期 171谭超等 ：P2X7 受体短肽单克隆抗体的制备及鉴定
反应中具有重要作用。
P2X7 受体在神经信号传导通路方面比较深入。
有学者制备出动物 P2X7 受体单克隆抗体，主要用于
信号转导的研究。少数文献报道，应用小鼠的 P2X7
受体抗体可减轻 ATP 诱导的炎症反应，国内尚未见
报道。本研究在国内首次应用人 P2X7 受体短肽为
抗原，分 3 次免疫小鼠以制备鼠抗人 P2X7 受体抗体，
结果表明，经 3 次免疫后的小鼠血清中抗 P2X7 受
体抗体的效价具有较高水平的表达，当小鼠血清稀
释度达 1 128 000 以上时，血清仍可有效地检测到
P2X7 受体。P2X7 受体单克隆抗体诱导阻断试验结
果表明，1 500 的小鼠免疫抗血清几乎完全抑制体
外培养的人巨噬细胞对 ATP 的作用，并随着血清浓
度的稀释，其抑制作用逐渐下降。当血清稀释到 1
4 000 时，抑制作用才消失。分离小鼠脾细胞与骨髓
瘤细胞进行融合，采用常规的间接 ELISA 法检测 10
块培养板中的阳性克隆，获得 4 株阳性单克隆杂交
瘤细胞。其中两株细胞经过扩大增殖培养，并经纯
化浓缩制备出较高产量的鼠抗人 P2X7 受体单克隆
抗体。生物学活性测定表明，两株杂交瘤细胞产生
的抗 P2X7 受体单克隆抗体，能够明显地阻断 ATP
诱导的人巨噬细胞表面 P2X7 受体的表达。
P2X7 受体能够成为区分癌、癌症前期和正常组
织成为检测细胞癌变潜力的生物标记，大量的研究
发现，P2X7 受体广泛表达在上皮性肿瘤组织或细胞
中。因其独特的功能性及受多方面因素的调控，使
得该受体在上皮肿瘤（组织或细胞）中的表达呈多
样性。如 ：（1）在子宫内膜癌及宫颈癌细胞和组织
的研究中发现 P2X7 受体的表达是下调的，发挥促
凋亡效应 ；（2）在甲状腺癌、神经母细胞瘤中 P2X7
受体高表达上调，通过诱导某些生长因子的释放来
促进癌细胞的生长， 促进 IL-6 或 P 物质的释放 ；
（3）在上皮性肿瘤组织或细胞中，因其独特的功能
性及受多方面因素的调控，P2X7 受体广泛表达，使
得该受体在上皮肿瘤（组织或细胞）中的表达呈多
样性 ；（4）在前列腺癌等肿瘤组织或细胞中的表达
明显高于对应正常组织或细胞 ；（5）外胚层来源的
皮肤、泌尿生殖窦的膀胱及宫颈阴道部以及苗勒管
来源的内宫颈和子宫内膜部等肿瘤组织或细胞中
的表达明显低于对应正常组织或细胞 . 这些组织中
P2X7 受体的表达下调都是处于肿瘤的早期［18］。
本研究抗人 P2X7 受体单克隆抗体的成功制备，
为进一步研制人源化抗 P2X7 受体抗体或其有效部
分如 Fab 段等，研制新的抗肿瘤靶向药物提供了可
能。所制备的抗人 P2X7 受体的单克隆抗体具有高
度的特异性及稳定性，为针对 P2X7 受体为靶点的
抗体药物的开发、医学辅助诊断上的应用奠定了基
础。同时检测该受体的表达有 Western blotting、免
疫荧光、反转录 PCR　流式细胞术（FCM）、免疫组
化等技术，这些技术都较复杂且价格昂贵，不能很
好的运用于临床检验分析，因此，如若根据抗原 -抗
体结合的免疫学等原理，大规模的生产 P2X7 抗体，
然后通过现代高科技技术、精确的检验分析仪器，
探讨 P2X7 受体的定量检测方案，具有很高的临床
意义和价值。
4 结论
本研究制备的鼠抗人 P2X7 受体单克隆抗体具
有较高的阻断细胞表面 P2X7 受体信号传导的效应。
参 考 文 献
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（责任编辑 李楠）