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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(12):105-109
收稿日期 ：2015-05-21
基金项目 ：国家自然科学基金项目（31101197），现代农业产业技术体系建设专项基金（CARS-20-2-5）
作者简介 ：崔学强，男，硕士研究生，研究方向 ：植物细胞与分子生物学 ；E-mail ：yncuixueqiang@126.com
通讯作者 ：冯翠莲，女，博士，助理研究员，研究方向 ：甘蔗生物技术 ；E-mail ：fengcuilian @126.com
Southern 印迹杂交是一种在分子生物学研究中
用来检测基因组 DNA 中特定序列的通用方法，是研
究 DNA 图谱的基本技术。在遗传病诊断、外源基因
检测、转基因植株鉴定与育种等方面均有着重要的
价值［1］。Southern 杂交中根据探针标记的种类不同，
可分为同位素标记和非同位素标记两大类［2］。早期
主要以同位素标记为主，该方法虽然灵敏度较高，
但由于同位素具有放射性和半衰期，对实验人员身
体素质及实验条件都提出了严格要求，因此使得该
方法的运用受到了一定的限制。非同位素标记则克
服了同位素标记法的缺点，使非同位素标记得到了
更广泛的运用［3］。非同位素标记根据标记物的不同，
分为地高辛标记和生物素标记。地高辛标记探针的
方法主要有 PCR 掺入法、随机引物法、切口平移
法等［4］。目前地高辛标记的 Southern 杂交技术已成
功运用到棉花［5］、烟草［6］、水稻［7］、玉米［8］、油
菜［9］、小麦［10］等农作物中并取得了良好的杂交效
果。然而甘蔗是高度杂合的无性繁殖作物，其遗传
转基因甘蔗植株 Southern 杂交体系的优化
崔学强1，2  张树珍2  沈林波2  冯翠莲2
（1. 海南大学农学院，海口 570228 ；2. 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 甘蔗研究中心 农业部热带作物生物技术重点开放实验室，
海口 571101）
摘 要 ： 对甘蔗 Southern 杂交体系的优化，旨为转基因甘蔗 Southern 杂交鉴定分析提供参考。以转基因甘蔗为材料，就探
针不同标记方法的比较、甘蔗基因组 DNA 的提取、基因组 DNA 酶切量、酶切时间及杂交过程等方面，对地高辛标记的 Southern
杂交技术进行了优化研究。结果表明，改良的 CTAB 法提取的甘蔗 DNA 能满足后期实验的要求 ；PCR 法标记探针的效率较随机引
物法标记探针的效率高，更适合用于 Southern 杂交 ；40 μg 的 DNA 在 400 μL 酶切体系中，酶切 10 h 可获得良好的酶切效果 ；杂交
温度 40℃，杂交 18 h，可获得清晰的杂交条带。
关键词 ： 甘蔗 ；Southern 杂交 ；地高辛 ；PCR 法标记探针 ；酶切
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.12.015
The Optimization of Southern Blot for Transgenic Sugarcane Plants
Cui Xueqiang1，2 Zhang Shuzhen2 Shen Linbo2 Feng Cuilian 2
（1. College of Agriculture，Hainan University，Haikou 570228 ；2. Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology，CATAS，Sugarcane
Research Center，Ministry of Agriculture Key Biotechnology Laboratory for Tropical Crops，Haikou 571101）
Abstract: Using sugarcane as materials, the DIG-labeled Southern blot was optimized through several key aspects ：the comparison of
different-labeled probe methods, extraction of sugarcane genome DNA, the amount of enzyme digestion of genome DNA, enzyme digestion time
and a serial of procedures in the process of the hybrid. The results showed that sugarcane DNA extracted by the improved CTAB method met
the requirements of the latter experiments, the efficiency of PCR-labeled probe was higher than that of random primer-labeled probe, so PCR-
labeled probe method was suitable for the Southern blot, 40 μg DNA samples in enzyme digestion system of 400 μL for 10 hours could achieved
desirable digestion result ；while hybrid temperature was 40℃ and hybridizing time was 18 h, a clear hybridization band could be observed. The
optimization of sugarcane Southern blot provides a reference for the analysis of Southern blot of transgenic sugarcane.
Key words: sugarcane ；Southern blot ；digoxigenin ；PCR-labeled probe ；enzyme digestion
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.12106
背景十分复杂，表现为异源多倍体和多倍的非整倍
体，具有染色体数目多，基因组庞大的特点。根据
不同的栽培种，染色体数目从 80-130 条不等，基因
组高达 10 Gb，是水稻基因组的 10 倍以上［11］，这使
得转基因甘蔗外源基因的 Southern 杂交分析较其它
作物困难。
本研究以转基因甘蔗及受体为材料，参考前人
成功经验，从甘蔗基因组 DNA 提取，探针标记、基
因组 DNA 使用量及杂交过程等对甘蔗地高辛标记探
针的 Southern 杂交方法进行优化，旨在为转基因甘
蔗的 Southern 杂交分析提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
转 基 因 甘 蔗 植 株 由 本 课 题 组 利 用 农 杆 菌
介 导 法 获 得， 导 入 转 基 因 植 株 的 骨 架 载 体 为
pCAMBIA3300，筛选基因为 Bar 基因，对照植株为
非转基因 ROC-22 植株。
1.2 方法
1.2.1 地高辛标记探针及标记效率检测 随机引物
法标记探针 ：用 Xho I 酶切质粒载体 pCAMBIA3300，
切出 564 bp 的 Bar 基因片段，回收纯化，取纯化后
的 1 μg 目的基因片段用于标记探针，具体标记的过
程参考地高辛试剂盒 I（Roche Cat. #REF 11 585 614
910）说明书。PCR 法标记探针 ：以 pCAMBIA3300
质粒为 PCR 模板，具体标记过程参照 PCR 法 DIG
探针合成试剂盒（Roche Cat. #REF 11 636 090910）
说明书。PCR 法标记结束后取 2 μL 标记产物进行电
泳检测探针标记效率及产量，最后按照试剂盒说明
书的方法进行标记效率的检测，比较两种探针标记
DNA 稀释样品与对照的显色强度。
1.2.2 甘蔗基因组 DNA 酶切 DNA 的提取采用改
良 CTAB 法［12］进行提取。对甘蔗基因组 DNA 酶切
量、酶切时间进行了比较，旨在对酶切条件进行优
化。酶切量的比较 ：分别取同一样品 30、40、50 和
60 μg DNA 在 400 μL 体系中进行酶切，酶切 12 h，
取 5 μL 检测酶切是否彻底。其余沉淀回收，溶解
于 35 μL 的 ddH2O 中，18 V 跑胶过夜，观察跑胶情
况。酶切时间的比较 ：取 40 μg DNA 样品在 400 μL
体系中进行酶切，酶切时间分别设置为 ：6、8、10
和 12 h，酶切结束后，取 5 μL 检测酶切效果。根据
酶切量及酶切时间的比较结果，选取 5 个转基因株
系和 1 个非转基因株系作为实验样品。每个样品取
40 μg DNA 进行酶切，酶切体系为 400 μL，120 U 的
限制内切酶 Hind Ⅲ，37℃酶切 10 h，酶切结束后用
无水乙醇沉淀 DNA，沉淀溶解于 35 μL 的 ddH2O 中，
65℃水浴 10 min，迅速至冰上 2-5 min，后 18 V 电
泳过夜（13-16 h）。
1.2.3 真空转膜及固定 对凝胶进行变性和中和处
理，处理过程参照地高辛试剂盒说明书进行。转膜
用 785 型真空转膜仪（Bio-Rad）进行，参照周长发等［5］
的方法。转膜结束后采用紫外交联（1200 J）固定膜
上 DNA。
1.2.4 杂交及显影 杂交具体过程参照试剂盒说明
书，杂交液用量 5 mL，42℃预杂交 1-3 h。探针使
用量 10 μL，杂交液用量 5 mL，于 40℃杂交 18 h。
杂交结束后进行洗膜处理，使用洗液 II（0.5×SSC，
0.1% SDS）时，于 64℃洗膜。封闭液孵育时间为 30
min，抗体工作液孵育时间为 1 h，其余过程与试剂
盒说明书相同。最后显影过程于黑暗静置，显影时
间 30 min-12 h，显影结束后，尼龙膜照相留存。
1.2.5 探针洗脱及再次杂交 探针的洗脱和再次杂
交参照试剂盒说明书进行。第二次杂交采用 PCR 法
标记探针 1.5 μL，具体操作同上。
2 结果
2.1 探针标记效率的检测
2.1.1 PCR 法探针标记 采用电泳法对 PCR 标记
的探针进行检测，未标记的 Bar 基因大小为 423 bp，
而地高辛标记探针后，由于地高辛分子的影响，使
得标记的探针比相应未标记的 Bar 基因片段分子量
大，电泳时迁移速率相对较慢，如图 1 所示。
2.1.2 探针标记效率比较 随机引物法与 PCR 法
探针标记效率的比较结果如图 2 所示，阳性对照
DNA 显示 6 个稀释点，随机引物法显示 3 个稀释点，
PCR 法显示 5 个稀释点。经显色亮度比对（图中箭
头所示）PCR 法标记探针稀释浓度为 0.3 pg/μL 时，
其显色强度与随机引物法标记的探针稀释浓度为 3
pg/μL 时的显色亮度一致。由此可见 PCR 法标记探
针的效率高于随机引物法一个数量级。
2015,31(12) 107崔学强等：转基因甘蔗植株 Southern 杂交体系的优化
M ：DL2000 DNA Marker ；1 ：地高辛标记的探针 ；
2 ：非标记的 Bar 基因片段
图 1 PCR 法标记 Bar 基因探针的电泳检测结果
1-6 ：探针浓度分别为 ：10、3、1、0.3、0.1 和 0.03 pg/μL，CK ：地高辛标
记的对照 DNA ；A ：随机引物法标记的探针 ；B ：PCR 法标记的探针 ；箭头
表示显色亮度一致的探针浓度
图 2 随机引物法和 PCR 法标记探针效率的比较
M ：DL5000 DNA Marker ；1 ：30 μg DNA ；2 ：40 μg DNA ；3 ：50 μg DNA ；
4 ：60 μg DNA
图 3 甘蔗基因组 DNA 量酶切效果检测
2000
bp
M 1 2
1000
750
500
200
100
654321
B
A
CK
2.2 甘蔗基因组DNA酶切
甘蔗基因组不同 DNA 量酶切结束后，取 5 μL
电泳检测，酶解效果较好，差异并不明显。其余酶
切产物回收后进行电泳检测如图 3 所示，甘蔗基因
组 DNA 量为 30 μg 、40 μg 时，泳道自上而下成均
匀弥散状，电泳效果最好。但 DNA 量为 30 μg 时，
由于 DNA 量少，泳道亮度较暗。当 DNA 量增加到
50 μg、60 μg 时，随着 DNA 量的增加，泳道两侧边
缘出现高亮度的轨道就越明显，泳道中间 DNA 片段
就越少。
40 μg DNA 在 400 μL 体系中进行酶切时间比较，
酶切 6 h 和 8 h，酶切不充分，条带并没有成均一的
弥散状。酶切 10 h 和 12 h 的酶切效果最好，酶切产
物成均匀的弥散状，酶切 10 h 和 12 h 效果较接近
（图略）。根据甘蔗基因组不同 DNA 量的酶切及不
同酶切时间的实验结果，最后确定酶切体系为 ：40
M 1 2 3 4
μg DNA 在 400 μL 体系中加入 8 μL 的限制性内切酶，
酶切 10 h。对不同样品按此酶切体系进行酶切，酶
切产物沉淀溶解后，低压过夜电泳。
2.3 Southern杂交检测结果
图 4-A 显示，采用随机引物法标记的探针杂交
结果很不理想，特异性差，几乎无目的带，背景深。
图 4-B 显示，PCR 法标记的探针杂交背景浅，杂交
条带清晰，能直观的看出转基因植株的拷贝数，杂
交效率较高。
M ：DL5000 DNA Marker ；1 ：对照非转基因植株 ；2 ：B11 ；3 ：B26 ；4 ：B34 ；
5 ：B45 ；6 ：B74。 A ：随机引物标记法 ； B ：PCR 标记法
图 4 不同探针标记方法的杂交结果
M 1 2 3 4 5 6 M 1 2 3 4 5 6A B
3 讨论
随机引物法可标记的 DNA 长度范围为 ：300-
1 500 bp，一般每隔 20-25 个核苷酸掺入一个标记
的核苷酸，标记效率低［13］。标记所需 DNA 量较多，
一般 20 μL 体系需 1 μg（至少 300 ng）模板 DNA，
标记耗时，且探针需要纯化，否则容易造成杂交背
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景过深，影响实验结果的分析和研究。PCR 标记
法一般适合于小片段标记，标记效率较高，标记需
要模板量较少，如基因组 DNA 1-50 ng，质粒 DNA
10-100 pg 即可。对模板纯度要求不高，标记操作方
便快捷，标记的探针无需纯化即可用于 Southern 杂
交，该方法采用专一的酶进行标记，价格相对昂贵，
但是每次杂交加入的探针量较少。本研究就随机引
物法和 PCR 法标记探针的效率进行了比较，PCR 法
标记探针稀释浓度为 0.3 pg/μL 时，其显色强度与随
机引物法标记的探针稀释浓度为 3 pg/μL 时的显色
亮度一致，表明 PCR 法标记探针的标记效率显著高
于随机引物法，两者相差一个数量级，该结论与之
前报道的文献结果相符［14］。从本研究的探针标记结
果及最后两者的杂交结果分析，Southern 杂交采用
PCR 标记法标记探针更为灵敏。
酶切是做好 Southern 杂交的前提，本实验就甘
蔗基因组 DNA 酶切量和酶切时间进行了研究。基因
组 DNA 酶切量依据植物基因组特性不同，使用基
因组 DNA 量也不同，一般植物用于 Southern 杂交的
DNA 量在 5-15 μg 左右便可取得良好的杂交效果。
本实验甘蔗基因组 DNA 酶切量选择在 30-60 μg，主
要是由于甘蔗具有染色体数目多，基因组庞大的特
点，因此常规的 DNA 量是无法满足甘蔗 Southern 杂
交，本团队曾用过 10、20 和 30 μg 的 DNA，杂交效
果都不理想，条带较弱，无法分辨植株的拷贝数。
一般用于杂交的甘蔗基因组 DNA 酶切时间为 12 h
以上，时间较长［15］。为了节约时间加快整个实验的
进度，因此本实验在采用 400 μL 的大酶切体系前提
下，进行了酶切时间为 6、8、10 和 12 h 的酶切效
果比较，实验结果证明了甘蔗基因组尽管在 400 μL
的大酶切体系下，仍然需要较长的酶切时间才能彻
底酶解。
杂交过程中杂交温度、探针加入量是实验成功
的关键，不同基因的杂交温度需根据试剂盒杂交温
度计算公式进行计算，杂交温度过高和过低都不利
于探针与目的片段的结合。本实验依据试剂盒说明
书杂交温度计算公式得出 Bar 基因的杂交温度为 38-
42℃，实验取中间值 40℃作为杂交温度。探针加入
量根据试剂盒说明书如果要检测复杂基因组中的单
拷贝基因，探针浓度为 25 ng/mL 计算加入。在 5 mL
杂交液中 PCR 法标记的探针加入量为 1.5 μL，随机
引物法标记的探针加入量为 10 μL。为了减少探针的
损失，本实验将探针加入到 100 μL 预杂交液中，进
行沸水处理变性。本实验就随机引物法与 PCR 法两
种探针杂交结果比较，采用随机引物法探针的杂交
结果背景较采用 PCR 法探针深，杂交条带不清晰这
与之前报导的相关文献结果相符［5，10］，采用随机引
物法探针进行杂交实验，产生杂交背景高，杂交条
带不清晰的原因可能是由于探针没有纯化。之前有
相关文献报导随机引物法如果想要获得低背景的杂
交条带可以通过对标记的探针进行纯化处理［10］。
4 结论
本研究以转基因甘蔗为材料，就探针不同标
记方法的比较、甘蔗基因组 DNA 的提取、基因组
DNA 酶切量、酶切时间及杂交过程等方面，对地高
辛标记的 Southern 杂交技术进行了优化研究。使用
改良的 CTAB 法提取的甘蔗 DNA 能满足后期实验的
要求，PCR 法标记的探针较随机引物法标记的探针
更适合用于甘蔗 Southern 杂交，40 μg 高纯度的甘蔗
基因组 DNA 在 400 μL 酶切体系中，酶切 10 h 可获
得良好的酶切效果。杂交温度 40℃，杂交 18 h，可
获得杂交背景清晰的杂交条带。
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（责任编辑 狄艳红）