全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第6期
收稿日期 : 2011-10-28
基金项目 : 国家牧草产业技术体系
作者简介 : 任伟 , 男 , 硕士 , 研究方向 : 牧草逆境生理与分子生物学 ; E-mail: wren84@163.com
通讯作者 : 王志锋 , 男 , 博士 , 研究员 , 研究方向 : 牧草遗传育种 ; E-mail: wzf1223@163.com
朝鲜碱茅 ISSR-PCR反应体系的建立与优化
任伟1 徐安凯1 徐博2 于洪柱1 王志锋1
（1 吉林省农业科学院，公主岭 136100 ；2 中国农业科学院草原研究所，呼和浩特 010010）
摘 要： 为进一步开展朝鲜碱茅种质资源遗传多样性的研究，以野生朝鲜碱茅（Puccinellia chinampoensis）为材料，通过单
因子试验对 ISSR-PCR反应进行优化。确立最佳的 PCR反应体系：在 20 μL反应体系中，含有模板 DNA 40 ng，dNTPs 0.2 mmol/L，
引物 0.8 μmol/L，Taq DNA聚合酶 1 U，MgCl2 2.5 mmol/L和 10×PCR Buffer（Mg2+ free）2 μL。此外，还筛选到 10条扩增稳定、条
带丰富的候选引物，并确定了各自的最佳退火温度。
关键词： 朝鲜碱茅 ISSR 单因子试验 体系优化
Establishment and Optimization of ISSR-PCR Reaction System for
Puccinellia chinampoensis
Ren Wei1 Xu Ankai1 Xu Bo2 Yu Hongzhu1 Wang Zhifeng1
（1Academy of Agricultural Sciences of Jilin Province, Gongzhuling 136100; 2 Grassland Research Institute, CAAS, Hohhot 010010）
Abstract: It is necessary to establish and optimize the ISSR-PCR reaction system for studying the genetic diversity of Puccinellia
chinampoensis. To obtain the best amplification result of Puccinellia chinampoensis with clear, repeatable and rich polymorphism bands, the
ISSR reaction system including dNTPs, Mg2+, primer, template DNA and Taq DNA polymerase was optimized. Results showed that the optimum
concentrations of five reactants in 20 μL reaction mixture were as follows: genomic DNA 40 ng, dNTPs 0.2 mmol/L, primer 0.8 μmol/L, Taq DNA
polymerase 1 U, MgCl2 2.5 mmol/L and 10×PCR Buffer（Mg2+ free）2 μL. 10 primers with stable amplification bands and rich polymorphism
for ISSR-PCR were selected from 100 candidate primers, which the optimal annealing temperature was also found. This optimized ISSR reaction
system would provide reference for genetic diversity analysis, germplasm resources classification and map construction.
Key words: Puccinellia chinampoensis ISSR Single factor tests Optimization
碱茅（Puccinellia）是一种重要的抗盐碱牧草，
是我国北方盐渍化草地的主要建群种及重要的先锋
植物，是植物抗逆研究领域的珍贵材料，具有极强
的抗寒和耐盐碱特性。早在 20 世纪 80 年代，就以
其适应性强、分布广、改良效果好等特点在我国 10
多个省区大面积的种植推广，并取得了显著的经济
效益、社会效益和生态效益［1］。近年来碱茅分子生
物学领域的研究方兴未艾，许多重要的抗逆功能基
因在碱茅中陆续得到分离克隆，显现出其在培育转
基因农作物和牧草中的巨大应用价值［2］。其中，朝
鲜碱茅（Puccinellia chinampoensis）是松嫩草原上的
优势种群。因此，应该加大对朝鲜碱茅种质资源的
收集与保护，加强朝鲜碱茅遗传多样性和遗传结构
的研究。
随着遗传多样性研究的深入发展，遗传多样性
标记已从传统的以表型识别为基础的形态标记、以
染色体结构和数目为特征的细胞学标记及具有组织、
发育和物种特异性的同工酶标记发展到目前广泛开
展的以 DNA 多态性为基础的 DNA 分子标记［3］。简
单重复序列中间区域（inter simple sequence repeat，
ISSR）作为一种分子标记手段，具有一些较其他分
子标记方法更优越的特点，不需要预知靶序列，每
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第6期60
一个引物可产生较多的多态性片段，有较高的退火
温度和更长的引物序列，可产生更可靠和重复性好
的扩增带，而且模板需要量少，多态性丰富，能更
多地揭示基因组的多态性［4］。因此，ISSR 被认为是
研究遗传多样性的一种非常有效分子标记手段，已
成功应用于居群生物学研究［5］ 、品种鉴定［6］ 、构
建遗传图谱［7］和物种分类系统学研究［8］等。
但是由于 ISSR 分子标记是基于 PCR 的技术方
法，它的稳定性容易受到各种因素的影响，需要
预先对其反应体系进行探索与优化［9］。目前，有
关朝鲜碱茅 ISSR 的研究鲜有报道，腾兆岩等［10］
和沙伟等［11］分别对同属的禾本科牧草星星草
（Puccinellia tenuiflora）的 RAPD 和 ISSR 反应体系进
行了正交优化研究，其中后者的研究结果表明，星
星草的 ISSR 扩增产物大多分布在 250-500 bp 之间。
为了取得更长片段的扩增产物，本试验采取单因素
试验设计的方法，旨在研究不同浓度 Taq DNA 聚合
酶、dNTPs 混合液、引物、镁离子和模板 DNA 对朝
鲜碱茅 ISSR-PCR 反应的影响，并对候选引物及其退
火温度进行筛选，建立适应朝鲜碱茅的 ISSR 反应体
系，旨在为进一步研究其遗传多样性奠定基础，也
为更好地区分朝鲜碱茅和星星草提供分子依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
供试植物材料为朝鲜碱茅，于 2009 年 4 月采自
吉林省西部大安盐碱草地。野外采集幼苗叶片，清
洗干净后，迅速放入冰盒，带回实验室放入低温冰
箱（-70℃）保存，备用。
本试验所用的 100 条 ISSR 引物为加拿大哥伦比
亚大学（UBC）公布的第 9 套引物，由上海生工有
限公司负责合成。Taq DNA 聚合酶、dNTPs 混合液、
镁离子、10×PCR Buffer（Mg2+ free）均由上海生工
有限公司提供。其余试剂为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 基因组 DNA 的提取与检测 参照经典的 SDS
法提取朝鲜碱茅基因组 DNA［12］，利用分光光度法
测定所提取的总 DNA 浓度与纯度，并将 DNA 浓度
稀释为 40 ng/μL，用 0.8% 琼脂糖凝胶电泳检测所提
取 DNA 的质量。
1.2.2 试验处理 以随机选取的 834 号引物作为固
定引物，其序列为：5-AGAGAGAGAGAGAGAGYT-5。
反应体系总体积为 20 μL，参照其他植物的 ISSR 研
究结果［13，14］，设计一个原始的反应体系：40 ng 模板
DNA、0.2 mmol/L dNTPs、0.5 μmol/L 引物、1 U Taq
DNA 聚 合 酶、2.5 mmol/L MgCl2 和 2 μL 10×PCR
Buffer（Mg2+ free）。在这个体系的基础上，针对 Taq
DNA 聚合酶、dNTPs 混合液、引物、镁离子和模板
DNA 的用量分别设计 4 个不同的浓度梯度（表 1），
每次只改变其中一个影响因素，其他因素保持不变。
表 1 ISSR反应系统优化设计
因素 1 2 3 4
Taq酶（U） 0.5 1.0 1.5 2.0
dNTPs（mmol/L） 0.1 0.2 0.4 0.8
引物（μmol/L） 0.2 0.5 0.8 1.0
DNA（ng） 10 20 40 80
Mg2+（mmol/L） 1.5 2.0 2.5 3.0
1.2.3 ISSR 反应程序与电泳 在德国 Biometra 公司
生产的梯度 PCR 仪中进行不同处理的扩增，扩增
程序为 ：94℃预变性 5 min ；94℃变性 30 s，54℃
退火 35 s，72℃延伸 2 min，32 个循环 ；72℃延伸 7
min ；16℃保存。反应结束后，将扩增产物在 1.5 %
琼脂糖凝胶上电泳，电压不超过 5 V/cm，缓冲液为
1×TBE，电泳结束后在凝胶成像系统上显影扫描。
1.2.4 引物的筛选及其退火温度的确定 根据确立
的最适 ISSR 反应体系，对 100 个候选引物进行筛
选，根据每个引物的 Tm 值设计退火温度的可能范
围，并由梯度PCR仪自动生成12个不同的退火温度，
每个退火温度重复 2 次，其余步骤如上所述。
1.2.5 ISSR 优化体系的验证 提取大安盐碱草地不
同采样点的 24 株朝鲜碱茅的总 DNA，随机选择筛
选出的 2 个引物来验证这个 ISSR 反应体系的准确性
与可重复性。
2 结果
2.1 基因组DNA的提取分析
采用 SDS 法提取朝鲜碱茅幼苗的基因组 DNA，
5 份材料提取得到的 DNA，A260 /A280 均在 1.8 左右，
说明蛋白质、多糖等杂质去除的比较干净，DNA 纯
2012年第6期 61任伟等 ：朝鲜碱茅 ISSR-PCR 反应体系的建立与优化
度较高。结果（图 1）显示，条带整齐、清晰，无
拖尾现象，说明没有降解，提取基因组 DNA 的质量
满足 ISSR 的试验要求。
增产物的产量 ；当浓度过高时，不仅会产生错误渗
入，而且还会导致不扩增的现象。如图 3 所示，当
dNTPs 的浓度为 0.4 mmol/L 时，条带严重缺失，只
扩增出些许微弱的条带，浓度增加至 0.8 mmol/L 时，
已经扩增不出任何条带。而当 dNTPs 的浓度低至
0.1 mmol/L 时，虽然可以扩增出条带，但是带型较
弱，不清晰，并且有拖尾现象。只有第 2 泳道（0.2
mmol/L）扩增产物丰富，条带清晰，较易分辨，满
足 ISSR 的试验要求，因此，本试验中最佳 dNTPs 浓
度为 0.2 mmol/L。1-5. 样品 ；M. 15 000 bp DNA Marker
图 1 基因组 DNA电泳检测
2.2 Taq DNA聚合酶用量对ISSR反应体系的影响
在任何一个 PCR 反应中，Taq DNA 聚合酶都
起着举足轻重的作用，它的质量与用量直接影响到
ISSR 反应的扩增结果。如图 2 所示，Taq DNA 聚合
酶浓度为 0.5-2.0 U 时，均有扩增条带产生，当用量
为 0.5 U 时，带型比较弱且条带数较少，随着用量
的逐渐增加，带型明显增强，扩增结果也更加丰富，
但是容易产生特异性扩增，条带亮度偏大，甚至形
成弥散状，在 750 bp 附近的扩增带很难分辨（第 4
泳道），不利于后期的统计分析，只有第 2 泳道（1.0
U）条带丰富易于分辨，综合试验结果与科研成本，
确定本体系 Taq DNA 聚合酶的用量为 1.0 U/20 μL。
1. 0.5 U ；2. 1.0 U ；3. 1.5 U ；4. 2.0 U ；M. DNA Marker
图 2 Taq DNA聚合酶用量对 ISSR-PCR的影响
2.3 dNTPs浓度对ISSR反应体系的影响
在 PCR 反应中，dNTPs 起着提供原材料的作
用，当其浓度过低时，会使反应提前终止，降低扩
M. DNA Marker ；1. 0.1 mmol/L ；2. 0.2 mmol/L ；3. 0.4 mmol/L ；4. 0.8 mmol/L
图 3 dNTPs浓度对 ISSR-PCR的影响
2.4 引物浓度对ISSR反应体系的影响
不同的引物浓度也会对 ISSR-PCR 反应产生明
显的影响。如图 4 所示当引物浓度为 0.2 μmol/L 时，
扩增条带严重缺失，并且带型很弱，亮度不够，不
予采用 ；当引物浓度增加为 0.5 μmol/L 时，扩增产
物和条带亮度均有所增加 ；当引物浓度为 0.8 μmol/L
时，条带数目最多，亮度明显增加，较易分辨 ；当
引物浓度升为 1.0 μmol/L 时，虽然带型较亮，但是
在 2 000 bp 附近的扩增条带有所丢失，泳道背景也
变得模糊，有进一步弥散的趋势。本着清晰、经济
的原则，确定本体系的最适引物浓度为 0.8 μmol/L。
2.5 模板DNA用量对ISSR反应体系的影响
隋晓青和王堃［15］研究表明，ISSR 反应体系对
模板 DNA 用量的适应范围较广。如图 5 所示，模板
DNA 用量从 10-80 ng 均可以扩增出有效的条带，但
是不同的模板量对 ISSR 反应体系也存在一定的影
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第6期62
响。从图5可以看出，当模板DNA含量为10-20 ng时，
扩增产物的亮度比较低 ；当模板 DNA 含量提高至
40 ng 时，亮度明显增加，条带更加丰富、清晰，易
于统计分析，但是当模板 DNA 含量继续增加至 80
ng 时，条带又变的比较模糊，偏暗，背景加深，形
成弥散。根据以上分析，确定适合于朝鲜碱茅 ISSR
反应体系的模板 DNA 用量为 40 ng/20 μL。
扩增条带的数量持续增加，带型逐渐清晰，但是当
镁离子浓度增加至 3.0 mmol/L 时，只剩下两条主带，
其余扩增产物成弥散状，亮度较低，模糊不清，不
易分辨。因此，本试验确定镁离子的合适浓度为
2.5 mmol/L。
M. DNA Marker ；1. 10 ng ；2. 20 ng ；3. 40 ng ；4. 80 ng
图 5 模板 DNA用量对 ISSR-PCR的影响
M. DNA Marker ；1.0.2 μmol/L ；2.0.5μ mol/L ；3. 0.8 μmol/L ；4.1.0 μmol/L
图 4 引物浓度对 ISSR-PCR的影响
2.6 镁离子浓度对ISSR反应体系的影响
镁离子不仅是 PCR 反应中的重要组成部分，而
且还参与了 PCR 反应中的变性、退火等过程，对
ISSR 扩增产物的质量和数量均有着很大影响［16］。
在朝鲜碱茅 ISSR 反应体系中，不同浓度的镁离子对
扩增条带的数量有很大影响，而对带型的强弱影响
不大。如图 6 所示，随着镁离子浓度的逐渐增加，
M. DNA Marker ；1. 1.5 mmol/L ；2. 2.0 mmol/L ；3. 2.5 mmol/L ；4. 3.0 mmol/L
图 6 镁离子浓度对 ISSR-PCR的影响
2.7 退火温度对ISSR反应体系的影响
退火温度对扩增条带的数量、带型的强弱、条
带的清晰度均有影响，温度过高或过低都会引起反
应效率的降低。如图 7 所示，根据引物 846 的 Tm
值（53.88℃），设计了 12 个不同的退火温度（每个
浓度 2 次重复）。结果表明，第 6 号处理的扩增效
果最好，条带丰富，且带型清晰明亮，重复性好，
最接近 ISSR-PCR 反应的试验要求，所以确定引物
846 在朝鲜碱茅 ISSR 反应程序中的最佳退火温度
为 52.4℃。由于不同的引物，碱基的组成成分不同，
造成 Tm 值也不尽相同，因此需要对 100 条引物逐
个验证，最终从中选出 10 个扩增产物丰富，条带清
晰的引物作为今后研究朝鲜碱茅 ISSR 遗传多样性的
候选引物（表 2）。
2.8 ISSR反应体系的验证
综合以上分析，通过对该反应体系进行单因素
优化，初步确立了朝鲜碱茅 ISSR-PCR 的反应体系 ：
总反应体积为 20 μL，其中包括模板 DNA 40 ng、
dNTPs 0.2 mmol/L、引物 0.8 μmol/L、Taq DNA 聚合
酶 1 U、MgCl2 2.5 mmol/L 和 10×PCR Buffer（Mg2+
free）2 μL。为了验证这个反应体系的准确性与可重
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复性，选取引物 807 和 891 分别对大安盐碱草地 24
个野生朝鲜碱茅个体进行 ISSR-PCR 反应。结果（图
8，图 9）表明，扩增产物丰富，在 250-2 000 bp 之
间均有分布，条带清晰可辩，易于构建 0-1 矩阵，
可用于朝鲜碱茅 ISSR 的相关分析与研究。
3 讨论
碱茅是一种极具抗盐碱性的优质牧草，在“三
北”重度盐碱地的恢复与治理中起着重要的作用，
因此研究和保护碱茅属植物的种质资源显得尤为关
键。吉林省西部地区主要分布有朝鲜碱茅和星星草
（又称小花碱茅）两个草种，它们混生在一起，形
态较为相似，难以区分，长期以来被统称为“碱茅
草”。已有研究结果表明，二者在生物学和栽培学上
1. 48℃ ; 2. 48.2℃ ;3. 48.8℃ ; 4. 49.7℃ ; 5. 50.9℃ ;6. 52.4℃ ;7. 54.3℃ ;
8. 55.9℃ ;9. 57.1℃ ;10. 58.2℃ ;11. 58.7℃ ;12. 59℃
图 7 退火温度对 ISSR-PCR反应的影响
引物 序列（5-3） 退火温度（℃）
807 AGAGAGAGAGAGAGAGT 53.0
834 AGAGAGAGAGAGAGAGYT 49.0
846 CACACACACACACACART 52.4
848 CACACACACACACACARG 54.0
849 GTGTGTGTGTGTGTGTYA 49.7
878 GGATGGATGGATGGAT 50.5
886 VDVCTCTCTCTCTCTCT 50.7
887 DVDTCTCTCTCTCTCTC 50.0
890 VHVGTGTGTGTGTGTGT 56.6
891 HVHTGTGTGTGTGTGTG 58.0
表 2 用于 ISSR扩增的引物及其退火温度
M. DNA Marker ；1-24. 样品
图 8 引物 807的 ISSR-PCR扩增结果
M. DNA Marker ；1-24. 样品
图 9 引物 891的 ISSR-PCR扩增结果
均有所区别，朝鲜碱茅 2n=14，属二倍体盐中生植
物，而星星草染色体数目 2n=28，属四倍体盐生植
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第6期64
物。此外，它们在干物质重、茎叶比、种子形状和
抗盐碱能力上也有所不同［17］。因此，开展朝鲜碱茅
ISSR 遗传多样性的研究，不仅可以分析朝鲜碱茅的
遗传结构，构建朝鲜碱茅的遗传图谱，开发朝鲜碱
茅的种质资源，而且还可以为碱茅属植物的分类学
研究提供分子佐证。
沙伟等［11］曾通过设计正交试验对星星草 ISSR
反应体系进行了优化，扩增出清晰明亮的条带，但
这些产物大多集中在 250-500 bp 之间，扩增范围需
要进一步优化。正交设计具有直观、迅速、简洁等
优点，但也存在一定的局限性。如无法准确找到影
响反应体系的主要因子，不能很好的估计试验误差，
无法找到各种反应因子的最佳参数［18］。因此，本研
究采用了单因素试验设计，取得了较好的研究结果，
扩增条带在 200-2 000 bp 之间均有分布。
试验结果表明，dNTPs、引物和镁离子浓度在
朝鲜碱茅 ISSR 反应体系中起主要作用，直接影响
到扩增条带的数量和清晰度，Taq DNA 聚合酶和模
板 DNA 的用量对条带的明暗程度有所影响。这是因
为镁离子是 Taq DNA 聚合酶的激活剂，其浓度不仅
影响酶的活性及 DNA 的合成，而且对引物与模板的
结合效率、模板与 PCR 产物的解链温度以及产物的
特异性和引物二聚体的形成均有影响［19］，是 ISSR-
PCR 反应体系中的关键作用因子，在本试验中镁离
子的最佳浓度为 2.5 mmol/L。dNTPs 作为 PCR 反应
中的原材料，浓度过高，会导致错误掺入，条带严
重缺失 ；浓度过低，又会降低合成效率，影响扩增
结果［20］。试验结果表明，朝鲜碱茅 ISSR-PCR 反应
体系中 dNTPs 的最适浓度为 0.2 mmol/L。引物浓度
也要调控在一定范围内，浓度过低时，导致扩增产
物偏少，带型弱 ；浓度过高时，会引起模板与引物
错配，特异性降低，二聚体形成的几率增大［21］。本
试验中，当引物浓度为 0.8 μmol/L 时，扩增效果最
好，略高于常用的 PCR 反应体系（0.5 μmol/L）。而
Taq DNA 聚合酶和模板 DNA 也是影响 ISSR-PCR 反
应的重要因素［22］，单因素试验结果表明，它们的最
佳用量分别为 1 U/20 μL 和 40 ng/20 μL。本试验在前
人研究的基础上，每种因素仅设置了 4 个主要的浓
度梯度，虽然可以直观的观察到每种因素对朝鲜碱
茅 ISSR 反应体系的影响规律，但是有待于多增加一
些浓度梯度，将此反应体系做进一步优化。
为了获得稳定可靠的扩增效果，在确定了 5 种
反应因子的最适浓度之后，对 100 条备选引物及其
退火温度进行了逐一筛选，因为并不是每条引物都
适应于朝鲜碱茅的基因组 DNA，每个物种都具有自
身的特异性。对于每条引物而言，由于其碱基不同，
Tm 值不同，它们的最佳退火温度势必也不相同。试
验结果表明，退火温度过低会使引物与模板发生错
配，产生非特异性条带 ；但温度过高时，引物与模
板的结合会受到抑制，扩增条带的数目减少，亮度
减弱。
4 结论
本研究探索出适用于朝鲜碱茅ISSR-PCR反应的
最佳体系 ： 在 20 μL 反应体系中，含有模板 DNA 40
ng，dNTPs 0.2 mmol/L，引物 0.8 μmol/L，Taq DNA 聚
合酶 1 U，MgCl2 2.5 mmol/L 和 10×PCR Buffer（Mg2+
free）2 μL。此外，还筛选到 10 条扩增稳定、条带
丰富的候选引物，并确定了各自的最佳退火温度，
为开展朝鲜碱茅 ISSR 的有关研究奠定了基础。
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（责任编辑 狄艳红）