全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第3期
收稿日期 : 2011-08-11
基金项目 : 广东省工业攻关项目（2008A010900002, 2010A010500003)
作者简介 : 戴苏 , 男 , 硕士研究生 , 研究方向 : 脂肪酶基因克隆表达及应用 ; E-mail: sugardai@126.com
通讯作者 : 韩双艳 , 女 , 博士 , 副教授 , 研究方向 : 微生物酶学 ; E-mail: syhan@scut.edu.cn
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）碱性脂肪酶基因在
毕赤酵母中的表达
戴苏 赵小兰 林影 韩双艳
（华南理工大学生物科学与工程学院，广州 510006）
摘 要： 将来自枯草芽孢杆菌的碱性脂肪酶基因经密码子优化，全基因合成后克隆到 pPICZαA载体，构建了 pPICZαA-bsl分
泌型重组质粒，该重组质粒经限制性内切酶 Pme I线性化后使用 LiCl法转化到毕赤酵母 X-33，经过筛选获得分泌表达碱性脂肪酶
的重组毕赤酵母 X-33/pPICZαA-bsl。摇瓶发酵液上清酶活最高可达 4.78 U/mL，初步研究了该脂肪酶的酶学性质，其最适作用温度
为 40-60℃，最适 pH9.0，且具有高度耐碱的特性。该重组脂肪酶对旧新闻纸具备较明显的脱墨能力。
关键词： 枯草芽孢杆菌 碱性脂肪酶 密码子优化 毕赤酵母 分泌表达 脱墨
Expression of Bacillus subtilis Alkaline Lipase Gene in Pichia pastoris
Dai Su Zhao Xiaolan Lin Ying Han Shuangyan
（School of Bioscience and Bioengineering，South China University of Technology，Guangzhou 510006）
Abstract: The aim of the present study was to express and evaluate a previously cloned lipase gene. The alkaline lipase gene was
optimized and subcloned into the secreted expression vector pPICZαA to construction a recombinant plasmid pPICZαA-bsl, then the recombinant
plasmid was transformated into the Pichia pastoris X33. The recombinant yeast x33/pPICZαA-bsl could secrete alkaline lipase, and the maximum
activity of the culture supernatant was 4.78 U/mL when the recombinant strain was cultured on a rotary shaker. The properties of the recombinant
lipase was be tentatively researched, the results showed that the optimal temperature and pH of this lipase were 40-60℃ and 9.0, and the lipase
was extreme alkaline-resistant. The recombinant lipase showed obvious deinking ability in old news paper deinking test.
Key words: Bacillus subtilis Alkaline lipase Codon optimization Pichia pastoris Secreted expression Deinking
脂肪酶（Lipase EC 3.1.1.3）是重要的工业酶制
剂品种之一，可以催化解脂、酯交换、酯合成等反
应，广泛应用于油脂加工、食品、医药、日化、制
浆造纸等工业生产［1, 2］。 近年来，脂肪酶在废纸脱墨、
消除制浆造纸过程中的树脂障碍等方面的新用途［3, 4］
逐渐发展起来。
毕赤酵母（Pichia pastoris）是近几年发展起来
的一种新型的真核表达系统，具有表达量高、表达
稳定及分泌能力强的特点，与大肠杆菌、哺乳动物
细胞、昆虫表达系统相比，不但具有原核生物生长快、
操作简便的优点，而且还具有真核细胞翻译后的加
工和修饰功能，从而大量表达有生物活性的外源蛋
白［5-7］。本研究以毕赤酵母 X33 作为表达宿主，异
源表达经密码子优化的枯草芽孢杆菌碱性脂肪酶基
因。研究表明，该脂肪酶具有高度耐碱的特性，符
合造纸行业和洗涤行业对酶性质的要求，具备在制
浆造纸树脂控制、废纸脱墨和洗涤行业应用的潜力。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株和质粒 pPICZαA 购自 Invitrogen 公司，
Pichia pastoris X-33、菌株 E. coli Top10F 由本实验
室保存。
1.1.2 分子克隆用酶和试剂 PrimerSTAR 高保真
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第3期136
DNA 聚合酶，ExTaq DNA 聚合酶，限制性内切酶
EcoR I、Xba I，T4 DNA 连接酶，DNA Marker 购自
大连宝生物（TaKaRa）工程有限公司。质粒提取
试剂盒（Plasmid Miniprep Kit）购自 Biomiga 公司。
胶回收试剂盒，PCR 纯化试剂盒为 Quiagen 产品，
购自基因公司。
1.1.3 主要化学试剂 1 mol/L 磷酸钾缓冲液（pH
6.0）：132 mL 1 mol/L K2HPO4 和 868 mL 1 mol/L
KH2PO4 混 合 均 匀， 调 整 pH 为 6.0， 高 压 灭 菌。
500× 生 物 素（0.02%）：溶 解 20 mg 生 物 素 于
100 mL 水中，过滤除菌，置于 4℃保存。0.1 mol/L
LiCl、1 mol/L LiCl、50% PEG。
1.1.4 培养基 LB 培养基：10.0 g 蛋白胨，5.0 g 酵
母提取物，10.0 g 氯化钠，用蒸馏水溶解，并定容
至 1 L，固体培养基加 2% 琼脂粉，121℃高压灭菌
20 min，备用。
转化子筛选培养基：含抗生素 Zeocin（25 μg/mL）
的 LB 液体培养基 ；含抗生素 Zeocin（25 μg/mL）的
LB 固体培养基。
用于培养 Pichia pastoris 的 YPD 培养基 ：2%
蛋白胨，1% 酵母粉，2% 葡萄糖（抗性培养基加
100 μg/mL 的 Zeocin）；固体培养基加 2% 的琼脂粉，
115℃高压灭菌 20 min 备用。
三丁酸甘油酯固体培养基 ：0.5% 硫酸铵，0.3%
酵母提取物，0.1% PVA，0.5% 甲醇，4×10-5% 生物
素（过滤除菌），2% 琼脂、10% 1 mol/L 磷酸钾缓冲
液（pH6.0），三丁酸甘油酯 0.5%。
BMGY 液体培养基 ：1.34% YNB，1% 酵母提
取物，2% 蛋白胨，121℃高压灭菌 20 min 后加入
4×10-5% 生物素（过滤除菌），100 mmol/L 磷酸钾缓
冲液（pH6.0），1% 的甘油。
BMMY 液体培养基 ：1.34% YNB，1% 酵母提
取物，2% 蛋白胨，121℃高压灭菌 20 min 后加入
4×10-5% 生物素（过滤除菌），100 mmol/L 磷酸钾缓
冲液 pH6.0，0.5% 甲醇。
1.2 方法
1.2.1 脂肪酶基因的优化及全基因合成 从GenBank
上获取脂肪酶 BSL 基因序列（登录号 FJ481899）［8］，
使用 OptimumGeneTM 密码子优化软件对脂肪酶基因
进行了全面优化，包括 CAI 值优化、G+C 含量优化、
重复序列优化，mRNA 二级结构优化等，优化后委
托南京金斯瑞生物公司进行全基因合成。
1.2.2 脂肪酶基因的克隆 PCR 扩增反应体系 ：
5×PrimerSTAR buffer 10 μL，ddH2O 34 μL， 引 物
BSL-F 0.5 μL，引物 BSL-R 0.5 μL，质粒模板 0.5 μL，
PrimerSTAR 高保真酶 0.5 μL。 扩增程序 ：94℃ 预
变性 4 min ；94℃变性 30 s，54℃退火 30 s，72℃
延伸 1 min，共 30 个循环 ；72℃延伸 7 min，PCR
产物经凝胶电泳鉴定正确后切胶纯化存于 -20℃
备用。
1.2.3 重组质粒 pPICZαA-bsl 的构建 pPICZαA 质
粒和目的基因 PCR 产物都用限制性内切酶 EcoR Ⅰ
和 Xba Ⅰ进行双酶切，切胶纯化回收后，用 T4
DNA 连接酶 16℃过夜连接酶切产物，然后用 CaCl2
转化法转入 E. coli Top10，在含 25 μg/mL Zeocin 的
LB 培养基平板上涂板，过夜培养。挑取阳性转化
子过夜培养后提取质粒，用限制性内切酶 EcoR I 和
Xba I 进行双酶切鉴定。
1.2.4 重组毕赤酵母的构建 重组质粒使用 Pme I
限制性内切酶进行线性化后使用 LiCl 法转化到毕
赤酵母 X-33，取转化产物涂布于含 100 μg/mL 的
Zeocin YPD 平板上，30℃培养 2-3 d，挑取阳性克
隆子进行菌落 PCR 鉴定。
1.2.5 重组转化子的菌落 PCR 使用东洋纺（上
海）生物科技有限公司的高成功率的酵母菌落 PCR
酶 KOD FX 进行菌落 PCR 反应，反应体系：2×PCR
Buffer 10 μL，0.4 mmol/L dNTPs 4 μL，AOX 通用引
物 10.5 μL，AOX 通用引物 20.5 μL，KOD FX 0.5 μL，
ddH2O 4.5 μL，用灭菌牙签从单菌落挑取菌体，加
入反应体系，充分混匀。反应程序 ：94℃预变性
4 min ；98℃变性 10 s，55℃退火 30 s，68℃延伸
3 min，共 30 个循环 ；68℃延伸 10 min。
1.2.6 三丁酸甘油酯乳化平板筛选高表达转化
子 将菌落 PCR 验证为阳性的转化子用牙签均匀
点接于三丁酸甘油酯乳化平板上，培养 3-4 d 观察
水解圈的大小，水解圈越大，产酶水平越高。
1.2.7 重组毕赤酵母的诱导表达及酶活检测 挑取
高表达转化子，接种于含有 50 mL BMGY 培养基的
250 mL 三角瓶中，30℃，250 r/min 振荡培养 16-20 h
2012年第3期 137戴苏等 ：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）碱性脂肪酶基因在毕赤酵母中的表达
至 OD600 达到 2-6。离心收集菌体，再将其重悬浮
于 BMMY 培养基中，稀释至 OD600 为 0.8-1.0，继续
振荡培养，每隔 24 h 向 BMMY 培养基中补加甲醇至
终浓度为 1.0% 进行诱导表达。同时测定重组菌的
发酵生长曲线，取 1 mL 发酵液 4℃，6 000 r/min 离
心 10 min，取上清以对硝基苯酚辛酸酯（4-nitrophenyl
decanoate）作为底物，在 pH8.0 40℃条件下反应
5 min，用酶标仪测脂肪酶酶活。酶活定义 ：在
40℃，pH8.0 条件下，每分钟分解底物产生 1 μmol
对硝基苯酚为一个酶活单位。
1.2.8 表达产物的 SDS-PAGE 分析 重组毕赤酵母
X-33/pPICZαA-BSL 和阴性对照菌 X-33/pPICZαA 诱
导培养 168 h，取发酵上清液进行 12% SDS-PAGE 电
泳，考马斯亮蓝 R250 染色，检测目的蛋白表达。
1.2.9 重组脂肪酶酶学性质分析 表达产物经过
10 kD 超滤膜包超滤纯化之后，测定其最适温度，最
适 pH 值，以及温度稳定性和 pH 稳定性。
为考察该脂肪酶的最适作用 pH，配制了 pH 分
别为 5.0、6.0（柠檬酸钠缓冲液），7.0、8.0（Tris-HCl
缓冲液），9.0、10.0、11.0（Gly-NaOH 缓冲液）的缓
冲液，浓度均为50 mmol/L。分别用以上缓冲液配制底
物，加入纯化后的酶液，在 40℃条件下反应 10 min，
使用酶标仪测量相对酶活力。同时，为了考察该脂
肪酶的 pH 稳定性，将纯化后的酶液在 pH5.0-11.0
的缓冲液中浸泡 24 h 后，测量剩余酶活力。
为了考察该重组脂肪酶的最适作用温度，在 pH
为 9.0 的 Gly-NaOH 缓冲液中，配制底物 P-NPP（对
硝基苯酚棕榈酸酯），加入纯化后的脂肪酶在 30℃、
40℃、50℃、60℃、70℃和 80℃分别反应 10 min，
使用酶标仪测量相对酶活力。同时，为了考察该
重组酶的温度稳定性，将纯化后的脂肪酶分别在
30℃、40℃、50℃、60℃、70℃和 80℃水浴中保温
1 h后，在pH9.0，温度40℃条件下测量剩余的酶活力。
1.2.10 重组脂肪酶在旧新闻纸脱墨中的初步研
究 本研究初步考察了该重组脂肪酶对旧新闻纸的
脱墨效果。取旧新闻纸（旧广州日报）手工撕成
3 cm×3 cm 碎片，装入密闭塑料袋过夜平衡水分。
测量纸片干度，根据干度称取相当于 180 g 绝干纸
碎片，加水调节浆浓至 10%，使用水力碎浆机疏解
10 min，然后加入浓缩后的酶液（1.5 U/g 绝干浆）。
继续疏解 20 min 后，将纸浆转移至浮选槽，加入
脱墨助剂。调节浆浓至 1% 浮选 7 min，取 500 mL
脱墨浆抄片检测白度和 ERIC 值（即有效残余油墨
量，该值越小，脱墨效果越好，反之亦然）。另做
一个不加酶液，其他步骤同上的阴性对照组以及碎
浆之后直接抄纸的空白对照组（即原浆）。
2 结果
2.1 密码子优化结果
密码子优化结果如表 1 所示。CAI 值即密码子
适应指数，该值越高，说明宿主菌对该基因的适
应力越好。G+C 含量 30%-70% 为宜。应尽量避免
Poly A 和不稳定结构（destabilizing）。
表 1 密码子优化结果
优化因素 优化前 优化后
CAI 0.63 0.83
G+C 含量（%） 45.47 42.97
Poly A 2 个 0 个
不稳定结构 1 个 0 个
2.2 脂肪酶基因克隆结果
以包含目的基因BSL的质粒pUC57-BSL为模板，
进行 PCR 扩增枯草芽孢杆菌脂肪酶基因。PCR 扩增
产物经 0.8% 琼脂糖凝胶电泳检测，结果（图 1） 显示，
可见 550 bp 左右有一条较亮的扩增带，大小与目的
片段 546 bp 一致，无明显非特异条带，表明扩增获
得枯草芽孢杆菌脂肪酶基因。
图 1 枯草芽孢杆菌碱性脂肪酶基因的 PCR
克隆产物检测图
M. DNAMarker; 1. PCR 产物
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第3期138
2.3 重组质粒pPICZαA-bsl的构建
按照方法“1.2.3”所述构建重组质粒 pPICZαA-
bsl，重组质粒经 EcoR Ⅰ和 XbaⅠ双酶切鉴定（图 2），
可知目的基因 bsl 已正确插入表达载体 pPICZαA 中。
培养 2-3 d 后，观察水解圈大小，结果（图 4）发现
重组酵母菌 X-33/pPICZαA-bsl 周围产生明显水解圈，
水解圈比阴性对照菌 X-33/pPICZαA 明显偏大。
M. Marker 250 bp Ladder; 1. pPICZαA 经 EcoR Ⅰ和 XbaⅠ双酶切
图 2 重组质粒双酶切鉴定电泳图
2.4 重组毕赤酵母的构建和筛选
Zeocin 抗性平板上长出数百个转化子，随机挑
取菌落使用 AOX 通用引物进行了菌落 PCR，结果
如图3所示。重组菌的菌落PCR能扩增出两个条带，
2 100 bp 处条带为以毕赤酵母自身基因组中 AOX
基因为模板的扩增产物，1 100 bp 大小的条带为以
整合到毕赤酵母基因组中的重组质粒为模板的扩增
产物，表明重组质粒已成功整合到了毕赤酵母基因
组中。
M. Marker 250 bp Ladder; 1. 重组菌落 ; 2.X-33
图 3 重组毕赤酵母 X-33/pPICZαA-bsl的
菌落 PCR产物鉴定图
2.5 三丁酸甘油酯乳化平板筛选高表达转化子
为了进一步筛选高表达转化子，将重组酵母转
化子用牙签均匀点接到三丁酸甘油酯乳化平板上，
黑线上方两个菌落为阴性对照 X-33/pPICZαA，下方为
重组菌 X-33/pPICZαA-BSL
图 4 三丁酸甘油酯乳化板筛选高表达转化子
2.6 重组转化子碱性脂肪酶基因的诱导表达及酶
活测定
按照方法“1.2.7”对筛选的重组毕赤酵母添加
终浓度 1% 的甲醇进行诱导培养，每隔 24 h 取样测
量发酵液的菌体浓度 OD600 和发酵液上清的脂肪酶
酶活。结果（图 5）显示，诱导到 144 h，菌体浓
度达到最高，OD600 达 55.6。诱导至 168 h，达最大
酶活力 4.78 U/mL。
■表示菌体生长曲线 ；▲表示产酶特征曲线
图 5 重组毕赤酵母生长曲线和产酶曲线
2.7 表达产物的SDS-PAGE分析
结果（图 6）显示，空载 X-33 发酵上清无明
显蛋白条带，说明毕赤酵母作为宿主菌具有背景蛋
2012年第3期 139戴苏等 ：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）碱性脂肪酶基因在毕赤酵母中的表达
白少的优点。重组酵母 X-33/pPICZαA-BSL 发酵上
清液在 32 kD 左右有一条明显的条带，应为目的条
带。目的蛋白大小比理论值（22 kD）偏大，可能
是由于脂肪酶基因在毕赤酵母中表达时，酶蛋白被
糖基化修饰的结果。
2.8.2 重组脂肪酶 BSL 最适作用温度及温度稳定
性 结果（图 8）显示，该脂肪酶在 40℃条件下，
酶活力最高，40-60℃范围内，都能维持 90% 以上
的酶活力。在 60℃保温 1 h 后，仍能保持 76.1% 的
酶活力，在 70℃和 80℃保温 1 h 后，分别能保持
56.6%和50.2%的酶活力，显示了较高的温度稳定性。
M. 蛋白 Marker ；1.X-33/pPICZαA 空载发酵液上清 ；
2.X-33/pPICZαA-BSL 诱导 168 h 发酵液上清
图 6 重组毕赤酵母发酵液上清 SDS-PAGE分析
2.8 重组脂肪酶的酶学性质分析
2.8.1 重组脂肪酶 BSL 的最适作用 pH 及 pH 稳定
性 结果（图 7）显示，该重组脂肪酶具有明显的嗜
碱特性，在 pH9.0 条件下，酶活力最高，在 pH10.0
条件下，能保持 96% 的酶活力。同时，该脂肪酶在
碱性条件下高度稳定，在 pH 高达 11.0 的缓冲液中
浸泡 24 h，酶活力几乎不损失，显示出高度耐碱的
特性。
●表示在不同 pH 条件下，脂肪酶活力的变化曲线 ； ▲表示在
不同 pH 的缓冲液浸泡 24 h 后，剩余酶活力的变化曲线
图 7 重组脂肪酶最适 pH及 pH稳定性
■表示不同温度下，酶活力的变化曲线 ；●表示不同温度温育后，
剩余酶活力的变化曲线
图 8 重组脂肪酶最适温度及温度稳定性
2.9 重组脂肪酶在旧新闻纸脱墨中的初步应用
结果（表 2）显示，经重组脂肪酶处理的脱墨
浆白度比原浆高 8.79，比不加酶处理的阴性对照高
4.24，白度提高幅度分别为 20.8% 和 10%，提示该
重组脂肪酶具备较明显的脱墨能力，下一步将对该
脂肪酶的脱墨效果进行深入研究，优化脱墨工艺，
为其工业应用奠定基础。
表 2 重组脂肪酶对旧新闻纸脱墨效果
处理组别 白度 ISO（%） ERIC 值
原浆 42.18 1354.03
非酶处理 46.73 842.31
酶处理 50.97 580.98
3 讨论
脂肪酶作为一种重要的工业用酶，吸引了众多
生物科研工作者的目光，相关脂肪酶基因在毕赤酵
母中异源表达的报道层出不穷。如 2003 年袁彩等［9］
实现扩展青霉的脂肪酶基因在毕赤酵母中的高效表
达，发酵液酶活达 260 U/mL。2009 年郑艳等［10］实
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第3期140
现疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶基因在毕赤酵母中的表
达，小规模发酵量达 0.93 mg/mL，其分泌表达的最
高酶活为 7.2 U/mL，该重组酶最适反应温度和 pH 分
别是 60℃和 8.0。表达蛋白在 60℃保温 1 h 后仍有
完全酶活，具有较高的热稳定性。但目前尚未有在
毕赤酵母中异源表达枯草芽孢杆菌脂肪酶基因的报
道。本研究通过密码子优化来自枯草芽孢杆菌的脂
肪酶基因 BSL，成功实现该基因在毕赤酵母中的表
达。通过酶学性质研究发现，该脂肪酶具备高度耐碱，
较为耐热的特性。初步研究发现经该重组脂肪酶处
理的脱墨浆比原浆白度提高 20.8%，显示了较强的
脱墨能力，下一步研究将深入考察其脱墨效果，优
化其脱墨工艺。鉴于其摇瓶初步发酵的表达量还不
够高，考虑对其发酵工艺进行优化，构建多拷贝等
手段提高其表达量，为其下一步工业应用奠定基础。
4 结论
本研究构建了 pPICZαA-bsl 分泌型重组质粒，
实现了枯草芽孢杆菌脂肪酶基因在毕赤酵母 X-33
中的表达。重组毕赤酵母摇瓶发酵液上清酶活最高
可达 4.78 U/mL，初步研究了该脂肪酶的酶学性质，
其最适作用温度为 40-60℃，最适 pH 为 9.0，且具
有高度耐碱的特性。经该重组脂肪酶处理的脱墨浆
比原浆白度提高 20.8%，表明该重组脂肪酶在旧新
闻纸（ONP）脱墨中具有较明显的效果。
参 考 文 献
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［2］ Woolley P, Petersen SB. Lipases, their structure, biochemistry and
applica-tion［M］. Cambridge: Cambridge University Press, 1994:
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［3］ 顾琪萍 , 勇强 , 尤纪雪 , 等 . 脂肪酶用于废报纸脱墨的研究 . 中
国造纸 , 2003, 22（4）:7-11.
［4］ 陈建平 , 郑毅 . 脂肪酶在新闻纸厂树脂障碍控制中的应用 . 福
建轻纺 , 2007（1）:12-19.
［5］ Romanos M．Advances in the use of Pichia pastoris forhigh-level
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（责任编辑 李楠）