全 文 :·综述与专论· 2013年第5期
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
收稿日期 :2013-01-30
基金项目 :山西省农业科技攻关项目(20090311022,20110311015-1),山西省人事厅择优项目,山西省人事厅引进人才项目
作者简介 :高行英,女,硕士研究生,研究方向 :蔬菜育种及生物技术 ;E-mail :zirou1019@163.com
通讯作者 :侯雷平,男,硕士,教授,研究方向 :蔬菜栽培及生物技术 ;E-mail :sxndhlp@126.com
葱蒜类蔬菜是百合科葱属中以嫩叶、假茎、鳞
茎或花薹为食用器官的二年生草本植物。该类蔬菜
在我国栽培历史悠久,在不同的生态环境下通过人
工选择和自然淘汰,产生了丰富的形态变异和生态
分化类型,包括洋葱(A. cepa L.)、大蒜(A. sativu-
m L.)、韭菜(A. tuberosum Rottl. ex Spr.)、大葱(A.
fistulosum L.)、细香葱(A. schoenoprasum L.)、韭葱
(A. porrum L.)、 胡 葱(A. ascalonicum L.) 和 薤(A.
chinensis G. Don) 等[1]。
葱蒜类蔬菜以其丰富的营养成分以及独特的辛
香风味而成为调味佳品,同时又有药用和保健价值。
如韭菜中含丰富的维生素 C、碳水化合物及硫、磷
和铁等矿物质,尤其富含胡萝卜素和纤维素,还含
有辛香的挥发性物质——硫化丙烯,有增进食欲和
杀菌的作用[2];洋葱含有蛋白质、粗纤维及糖等多
种营养成分,还含有 18 种氨基酸及硒、锌、铜及镁
葱蒜类蔬菜遗传转化研究进展
高行英 李梅兰 王婷婷 侯雷平
(山西农业大学园艺学院,太谷 030801)
摘 要 : 葱蒜类蔬菜营养丰富,药用价值高,在人们的生活中起着举足轻重的作用。对葱蒜类蔬菜遗传转化的种类及性状
进行概括,并总结遗传转化所采用的方法和使用的外植体,就农杆菌介导转化的相关因素等方面进行详细而全面的叙述,并对葱
蒜类蔬菜遗传转化的前景进行展望。
关键词 : 葱蒜类蔬菜 遗传转化 研究进展
Research Progress on Genetic Transformation of Allium Vegetables
Gao Xingying Li Meilan Wang Tingting Hou Leiping
(College of Horticulture,Shanxi Agricultural University,Taigu 030801)
Abstract: Allium vegetables which are riched in nutritions and have high medicinal value play an important role in people’s life. This
paper summarized the types of Allium and characters that have been genetically transformed successfully. At the same time, the transformation
methods and the explant types used were stated in the paper. In addition, the paper completely presented the related factors to Agrobacterium-
mediated transformation in details and prospected the genetic transformation of Allium vegetables.
Key words: Allium vegetables Genetic transformation Research progress
等多种微量元素,除具有杀菌作用外,还具有抗心
血管疾病、抗癌、降血压及防治骨质疏松等作用[3];
而大蒜对葡萄球菌、肺炎双球菌及大肠杆菌等均具
有杀灭作用,且具有降血压、降血脂、抗衰老、抗
血栓形成和防治糖尿病等功能。此外,还有抗氧化、
抗癌、抗突变、抗气喘和免疫调节等很多生物学活
性[4]。近年来,研究还发现这类植物中含有一类含
硫化合物——蒜素以及与之相关的一些含硫次生代
谢物,在防治肿瘤方面也有独特的作用,使其作用
及其机理的研究倍受关注[5]。
随着转基因技术的日益成熟,许多植物已经取
得新品种,这也为葱蒜类蔬菜的育种提供了一条新
的途径。目前,在葱蒜类蔬菜的转化研究方面已经
取得了一些成果。本文是通过对葱蒜类蔬菜遗传转
化的研究进行总结,以期为葱蒜类的遗传转化提供
参考。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第5期2
1 转化成功的蔬菜种类和性状
有 关 葱 蒜 类 蔬 菜 遗 传 转 化 的 研 究 从 20 世 纪
90 年代就已开始一以来对于相关的各种因素进行
了优化,最早研究成功的是洋葱。Eady 和 Joubert
等[6,7]对洋葱转化过程中的相关因素包括酚类物
质的作用进行的研究和探讨,成功进行了遗传转
化,其将 GUS 基因导入洋葱并进行了表达[8]。之
后 Barandiaran 等[9] 将 GUS 基 因 导 入 大 蒜 中, 核
酸分析的结果表明该基因已经整合到大蒜的基因组
中 ;Zheng 等[10]将目的基因导入韭葱体内后,组织
的 GUS 染色效果明显,转基因植株移植到温室后生
长良好 ;张松等[11]采用农杆菌介导法对韭菜进行
遗传转化,通过 PCR 分析及 Southern 检测,外源基
因已经整合到韭菜染色体上 ;谭伟等[12]对大葱转
化中的各种因素进行优化,并成功获得转基因大蒜
新品种。葱蒜类蔬菜遗传转化陆续成功,目前已经
获得成功的品种包括 :大蒜、韭葱、大葱及韭菜等,
其中研究最多且最成熟的为洋葱和大蒜。
从转化的性状看,最早获得的是抗除草剂基因
的导入。Eady 等[13]利用农杆菌介导法将 Bar 基因
导入洋葱幼胚得到抗除草剂植株,用草铵膦喷雾处
理,转基因植株仍能正常生长 ;Sun 等[14]将 Bar 基
因导入洋葱表皮细胞得到抗除草剂洋葱品种 ;Park
等[15]以大蒜愈伤组织作为受体,利用基因枪转化
抗除草剂基因,获得再生植株,当除草剂浓度为 3
mg/L 时,植株仍能生存。另外,抗虫基因的导入也
相当成熟。Zheng 等[16]将 cry1Ca 基因转入大蒜愈
伤组织得到转基因抗虫植株,用转基因大蒜叶片饲
喂 3 d 的甜菜夜蛾幼虫,结果表明转 cry1Ca 基因的
大蒜对甜菜夜蛾具有抗性 ;谭伟等[12]将苏云金杆
菌基因 CryIA (b)转入大葱组织得到抗虫大葱。
另外,还进行了抗逆性方面的转化。徐启江
等[17]将锌指蛋白 OSISAPI 基因导入洋葱鳞茎盘胚
性愈伤组织转化后,进行 NaCl 和 NaHCO3 复合盐进
行胁迫处理,当总浓度为 200 mmol/L 时,处理 7 d
后未转基因植株枯萎黄化、甚至死亡,而转基因植
株生长正常,且转基因植株的最大耐受浓度为 400
mmol/L ;刘海燕等[18]将 MpASR 基因导入洋葱表皮
在非生物胁迫,如冷、干旱、盐、水淹、重金属和
机械伤害等条件下诱导表达,从而获得抗逆境能力
很强的洋葱植株。洋葱中含有致泪成分环蒜氨酸,
Kamata 等[19]将催泪因子合成酶(LFS)基因导入洋
葱体内,得到抑制环蒜氨酸合成的洋葱品种。
2 遗传转化的方法
目前,已成功实现葱蒜类遗传转化并获得转化
植株的方法,即基因枪法和农杆菌介导法。1987 年,
Vlein 首先报道了利用基因枪法将 TMV(烟草花叶
病毒)RNA 吸附到钨粒表面,轰击洋葱表皮细胞,
经检测发现病毒 RNA 能进行复制,并以同样技术将
CAT 基因导入洋葱表皮细胞 ;Eady 等[8]通过基因
枪法转化洋葱胚根尖,培养 1-2 周的根尖 GUS 表达
率达到 20% 左右,4-8 周根尖的表达率达到 30% ;
徐启江等 [17]转化洋葱胚性愈伤后的 GUS 基因瞬时
表达率达到 73.33% ;Sun 等[14]对洋葱鳞茎表皮细
胞进行转化,转化规模为 90%,转化的细胞率为
2.5% ;Aswath 等[20]成功应用该法转化了洋葱愈伤
组织,转化率达到 23% ;Barandiaran 等[9]应用基因
枪法介导转化了不同大蒜外植体包括成熟种子、未
成熟种子、嫩叶及愈伤组织,PCR 结果表明所有的
材料均能进行转化,而 GUS 瞬时表达率表明叶片的
转化效果最佳,幼嫩鳞茎次之,表达率均达到 40%
以上。
农杆菌介导法是目前应用最广泛,且结果较为
理想、技术较为成熟的一种基因转化方法。Eady 等[8]
以农杆菌介导洋葱转化,GUS 染色瞬时表达为 15%
左右 ;Aswath 等[20]转化了洋葱愈伤组织,转化率
为 27% ;而 Sun 等[14] 以农杆菌介导洋葱转化后,
转化规模为 30%,转化的细胞率为 11%,说明两种
转化方法分别有各自的优点。另外,Kamata 等[19]
转化洋葱愈伤组织后 GFP 的荧光表达率达到 50% ;
Kondo 等[21]转化大蒜茎尖分生组织后,Southern 杂
交检测表明转基因株系都是单拷贝 ;Eady 等[22]采
用农杆菌介导法转化韭葱和大蒜也得到两个转基因
株系。
3 采用的外植体种类
葱蒜类蔬菜可作为外植体的组织包括茎尖、鳞
茎盘、双鳞片、花蕾、子房、胚珠、花托和未成熟
的胚等。目前,遗传转化中所用的受体材料多为愈
2013年第5期 3高行英等 :葱蒜类蔬菜遗传转化研究进展
伤组织,其来源众多,最常用的是种子胚根。Zheng
等[10]用大蒜幼胚和成熟种子作为外植体诱导愈伤
组织进行转化获得了转化植株 ;Aswath 等[20]用洋
葱成熟胚,通过愈伤组织再生途径成功获得转基因
再生植株,且转化率达到 20% 以上。另外,Zheng 等[16]
以试管苗根尖、珠芽诱导的愈伤组织进行转化及再
生也获得了转化体,胚根尖的转化率达到 1.47%,
试管苗根尖的转化率为 1.23%,而株芽的转化率仅
有 0.32% ;Buiteveld 等[23]用韭葱的胚性愈伤组织建
立的胚性悬浮细胞系分离原生质体,经培养获得了
再生植株,从而为转化奠定基础。
在葱蒜类蔬菜的转化过程中,常采用幼胚、根
尖、叶片和茎尖等组织直接进行转化。Sun 等[14]、
刘海燕等[18]和刘肖等[24]以洋葱表皮直接进行转化
获得成功,而 Eady 等[25]多用洋葱幼胚直接进行转
化,转化后的细胞进入再生体系得到转基因植株。
Barandiaran 等[9]用洋葱幼嫩叶片进行转化,GUS 瞬
时表达达到 40% 以上 ;Kenel 等[26]对大蒜幼嫩叶组
织进行转化,其 GFP 表达率达到 55%,转化效率为
4.1%。另外,Eady 等[8]还以预培养 2 d 的胚根进行
转化,GUS 表达率达到 20% ;张松等[11]用预培养 6
d 后的根尖转化后再生率达到 39%,出芽率达到 4%。
4 农杆菌介导转化的相关因素
在农杆菌介导的遗传转化中,存在多种遗传因
子和外界因素影响。为了提高转化效率,人们从植
株基因型、菌株及菌液浓度、侵染条件和共培养条
件等方面对农杆菌介导遗传转化方法进行优化,不
同程度地提高了转化效率[27]。
4.1 植株基因型
不同基因型对农杆菌的敏感程度不同,Zheng
等[16]研究表明 3 种大蒜品种 Messidrome、Morasol
发 现 Printanor 转 化 后,Printanor 的 转 化 率 为 1.5%
左右,而其他品种的转化率仅在 0.5% 左右 ;Zheng
等[10]研究 Atlas、Bawang Bali 和 Kuning 3 种大葱品
种及 Sturon 和 Hyton 洋葱品种对转化的影响发现,
Bawang Bali 的 GUS 瞬时表达达到 70%,而 Atlas 为
40% 左右。另外,植物基因型还通过影响再生体系
的建立而影响转化,Bohanec 等[28]取洋葱子房诱
导单倍体,4 个品种中 Daytona 再生频率为 0,而
Xph3371 再生频率为 7.6% ;张松等[29]同样取韭菜
14 个品种根尖,其愈伤组织诱导率和不定芽诱导率
也不同。Saika 等[30]在不同水稻品种 Nipponbare 和
Kasalath 对转化影响的结果表明,Kasalath 的绿色荧
光性和转化效果更高,也说明了这一问题。
4.2 农杆菌菌株和菌液浓度
农杆菌菌株属性对转化的成功具有决定性影
响。不同菌株对同一受体材料的侵染能力相差较大。
许多报告表明,EHA101、LBA 4404、A281、C58 和
ASE1 等 菌 株 的 转 化 效 果 较 好。 葱 蒜 类 植 株 转 化
中最常用的菌株为 LBA4404。Zheng 等[10] 用两种
菌 株 EHA105 和 LBA4404 进 行 转 化, 对 香 葱 而 言
LBA4404 的效果好,而对洋葱而言 EHA105 的效果
更好 ;杨爱国等[31]在农杆菌介导玉米转化中的研
究表明,EHA105 菌株转化后 GUS 表达率达到 70%,
再生率达到 20%,而用 LBA4404 进行转化 GUS 表
达率为 40%,再生率为 14%。
菌液浓度对不同的植物外植体转化存在差异。
浓度过低时,农杆菌数量过少,导致转化效率较低;
随着浓度的升高,转化率有所上升 ;但浓度过高时,
农杆菌将外植体全面包围,不利于洗菌,导致部分
外植体死亡,使转化率下降。在葱蒜类蔬菜的遗传
转化中大多采用的菌液 OD600 为 0.6 左右,刘海燕等
[18]
研究表明,OD600 为 0.6 时,洋葱表皮细胞的转化率
均值最大。当 OD600 为 0.2 时,转化效果不明显,转
化率随农杆菌浓度的增加而增加 ;而当 OD600 大于
0.6 时,洋葱表皮细胞呈空泡化,死亡细胞越来越多。
Kamata 等[19]则认为洋葱悬浮培养的愈伤组织转化
所用浓度 OD600 为 0.1-0.2。Kondo 等
[21]在大葱转化
中,农杆菌的 OD600 值也为 0.6 ;Eady 等
[22]在韭菜
和大蒜转化时,OD500 下的菌液浓度为 0.5-1.0 时效
果最佳,本研究结果也表明,韭菜转化中最佳的菌
液浓度 OD600 为 0.6。
4.3 侵染方式和时间
单子叶植物细胞缺乏农杆菌附着位点,农杆菌
侵染方式一般是应用创伤细胞 :菌液浸泡侵染 ;抽
气减压和超声波辅助的农杆菌介导法(SAAT )等促
进农杆菌的吸附,提高转化效率。Eady 等[25]认为
先将洋葱幼胚与菌液涡旋混合 30 s,然后将组织放
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第5期4
置在真空环境中渗透 30 min,菌液侵入组织的效果
最佳,而且此方法被很多研究人员采纳,用于韭菜
和大蒜等植株的转化。张松等[11]用直接浸泡法侵
染表明,当菌液 OD600 为 0.6 时,侵染 5 min,韭菜
转化率达到 5. 6 %。
菌液侵染时间对转化也是相当重要的,侵染时
间短时,菌体与受体细胞接触时间短,吸附于外植
体的菌体少,转化率低 ;随着侵染时间的延长,转
化率得到提升,但侵染时间过长,菌体数目过大会
导致受体细胞受到严重的损伤,且不能彻底除菌。
葱蒜类蔬菜的侵染时间不等,常用的侵染时间为
5-10 min。Aswath 等[20]转化洋葱时的侵染浓度为 5
min ;Zheng 等[10]侵染大蒜的时间为 10 min ;刘肖
飞等[24]则认为将洋葱表皮侵染 20 min 的转化效率
最高 ;徐春波等[32]在紫花苜蓿的遗传转化中,菌
液 OD600 为 0.6,侵染 10 min 时,GUS 阳性发生率最高,
与本研究通过农杆菌介导韭菜转化的试验结果一致。
4.4 共培养条件
共培养在整个转化过程中完成农杆菌的附着、
T-DNA 的转移整合,农杆菌附着外植体表面后并不
能立刻转化,只有在创伤部位生存一定时间后菌株
才能诱导肿瘤。谭伟等[12]在大葱的研究中表明,
GUS 基因瞬间表达率均值从大到小依次是共培养时
间 3 d> 2 d> 4 d> 1 d> 5 d ;共培养时间 <3 d 时,随
共培养时间的延长,GUS 基因瞬间表达率增加 ;>3
d 时,则相反。Eady 等[13]认为菌液用真空渗透法
处理 30 min,再进行共培养 6 d 后的转化效率最高。
共培养温度在转化中充当着重要的角色。虽然,外
植体共培养试验通常采用 25℃,但是认为较低的温
度(19-22℃)是更佳。Kondo 等[21]在大葱的研究中,
当温度为 22℃时 GUS 瞬时表达率最高,为 64%,温
度为 20℃时 GUS 表达率 54.2%,而温度为 24℃时反
而下降到 44.2%。我们在韭菜转化中研究结果表明,
共培养 3 d 为最佳时间。
4.5 Vir 基因的活化
1985 年,Stachel 等[33]首次从烟草叶片的伤口
中分离出乙酰丁香酮(AS)和羟基乙酰丁香酮(HO-
AS),并证明这些酚类物质能激活 Ti 质粒上 Vir 区基
因的表达。Joubert 等[7]研究了酚类物质对洋葱转化
遗传的影响发现,当 AS 浓度为 100 μmol/L 时,细
菌的生长和 Vir 毒性的活化能力最高 ;对洋葱幼胚
进行转化,AS 浓度为 250 μmol/L,组织的 GUS 表达
率为 60%,浓度过高时表达率反而下降。另外,在
100 μmol/L 浓度下,多种酚类化合物的作用中,AS
的作用最佳 ;其次为苄叉丙酮。Eady 等[25]在菌液
培养过程中加入 200 μmol/L AS 诱导活化农杆菌 4 h
后用于转化,转化效率达到 2.7%。张佳星等[34]阐
述了单子叶植物不是农杆菌的天然宿主,需添加外
源信号物质如 AS 来促进侵染效果,AS 是农杆菌与
植物共培养时必不可少的。
5 展望
运用基因工程培育转基因葱蒜类新品种为育种
开辟了新的途径,具有广阔的应用前景,但在实际
工作中存在许多问题和挑战。首先,可用于葱蒜类
转化的基因较少,遗传转化技术需要克服植株再生、
基因型的依赖性,以及组织培养中的遗传变异等问
题 ;其次,外源基因在转基因植株体内的表达效果
不甚理想,基因沉默是转基因过程普遍存在的问题;
再次,转基因安全性问题尚未完全明了和控制。因
此,需要挖掘更多的基因资源用于葱蒜类遗传转化,
不断完善已有的转化方法,发展新的转化体系和方
法,建立起一个转化效率高、重复性好、简易、快
速及适应性广的高效转化体系,从而使目的基因由
随机整合到定向定位整合,多个目的基因导入同一
受体并在转化植株中完整地表达。同时,对标记基
因进行去除或改造,或培育无抗生素标记基因(PMI)
的转基因植物,建立健全转基因安全评价机制。葱
蒜类转基因技术现今尚未完善,优良农艺性状基因
的转化较少。因此,对葱蒜类蔬菜进行进一步遗传
转化研究非常必要,以得到更加优质的品种。
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(责任编辑 狄艳红)