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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第7期
在植物的花色成分中，类黄酮、甜菜素和类
胡萝卜素是三类最主要的色素［1，2］，且大多数植
物花色素属于类黄酮［3］。 查尔酮合成酶（chalcone
synthase，CHS）是类黄酮类物质合成的关键酶，在
苯丙氨酸合成途径中，香豆酰辅酶 A 和丙二酰辅酶
A 在查尔酮合成酶催化下产生苯基苯乙烯酮［4，5］。
此中间物的异构化和功能基团的进一步取代都能导
致黄酮、异黄酮和花色素苷的合成。这些化合物为
自然界提供了颜色，并参与了植物的多种生理过程，
包括防紫外线辐射、抗病、生长素运输、花粉的育
收稿日期 ：2013-03-12
基金项目 ：四川农业大学大学生科研兴趣培养计划经费项目（04050957）
作者简介 ：张云婷，女，硕士，研究方向 ：园艺植物生物技术 ；E-mail ：asyunting@126.com
通讯作者 ：张勇，男，博士，副教授，研究方向 ：园艺植物生物技术 ；E-mail ：zhyong@sicau.edu.cn
月季查尔酮合成酶基因片段的克隆及其表达分析
张云婷  于定群  程怡  汤浩茹  王清明  张勇
（四川农业大学园艺学院，雅安 625014）
摘 要 ： 采用改良 CTAB 法从月季（Rosa hybrida）花瓣中成功提取出总 RNA，进行反转录合成 cDNA 模板。根据 GenBank
已发表的其他植物 CHS 基因序列的保守结构域设计简并引物，采用同源克隆法进行克隆，获得 RhCHS 片段序列，并分析该片段的
生物学信息，利用半定量 RT-PCR 对不同花发育时期进行表达分析。序列分析结果表明，克隆到的 cDNA 片段长度为 860 bp，编
码 287 个氨基酸残基，GenBank 登录号 KC145553。同源序列比对发现，月季 RhCHS 与其他植物的同源性很高，说明 CHS 在进化
的过程中具有高度的保守性。表达谱分析表明，CHS 在盛花期表达量最高。
关键词 ： 月季 查尔酮合成酶基因 克隆 表达分析
Cloning and Expression Analysis of Chalcone Synthase
Gene from Rosa hybrida
Zhang Yunting Yu Dingqun Cheng Yi Tang Haoru Wang Qingming Zhang Yong
（College of Horticulture，Sichuan Agricultural University，Ya’an 625014）
Abstract:  It was to clone and identify chalcone synthase gene（RcCHS）from Rosa hybrida‘Fairyland’, analysis the characteristic
of the sequence and expression. The total RNA was isolated from the flower petal of Rosa hybrida‘Fairyland’by improved CTAB, then reverse
transcription. Using PCR degenerate primers designed based on GenBank published the conserved sequences of chalcone synthase genes from
other plants to amplify cDNA fragments, a new chalcone synthase gene named RcCHS was cloned. The expression patterns of RcCHS in different
developmental stages were analyzed by semi-quantitative RT-PCR. The length of RcCHS was 860 bp which encoded 287 amino acids, GenBank
accession No. KC145553. Homology analysis showed that the RcCHS of Rosa hybrida‘Fairyland’had high homologies with other plants, and
indicated that CHS in evolution process kept the high conservatism. RcCHS had a highest transcript level in petals at blooming stage.
Key words:  Rosa hybrida RcCHS Cloning Expression analysis
性等［6，7］。查尔酮合成酶的表达受 UV 照射［8］、真
菌侵染等条件诱导［9］，且在花中特异性表达［10］，其
表达量的改变可能导致植物花色的变异［11］。CHS 在
植物中是普遍存在的，现认为最早在陆生植物中出
现。例如，轮藻纲和苔藓植物［6，12-15］。 到目前为
止在 GenBank 注册的与 CHS 有关的核酸序列已经有
5 000 多条，涉及到的植物主要是豆科的大豆、苜蓿、
豌豆 ；十字花科的拟南芥 ；禾本科的水稻、玉米 ；
葡萄科的葡萄等，其中观赏植物主要有矮牵牛、莲、
水仙、菊花、蝴蝶兰和金鱼草等［16］。
2013年第7期 67张云婷等 ：月季查尔酮合成酶基因片段的克隆及其表达分析
CHS 转基因的研究开展得比较广泛。1986 年，
Coen 等［17］对金鱼草的花色突变体研究表明，突变
体花色变淡或变浅蓝色，并推测该现象由 CHS 基因
所 控 制。1990 年 van der Krol 等［18］ 将 CHS 基 因 反
义片段导入矮牵牛，结果花朵色素合成受阻，花冠
颜色变浅，但花药正常。1993 年 Elomaa 等［19］ 利
用农杆菌介导法将 CHS 基因反义片段导入非洲菊
（Gerbera hybrida）中，内源 CHS 合成受到抑制，花
色合成大大受阻，从而使花色发生改变。1994 年
Gutterson 等［20］利用正义和反义手段，将来自菊花
（Chrysanthemum morifolium）的一个 CHS 基因导入开
粉红色花的菊花中，结果分别获得了开浅红色和白
色花的转基因植株。2000 年 Suzuki 等［21］将 CHS 基
因转入蓝色夏蓳中，花瓣部分花色由蓝色变为白色。
2005 年 Koseki 等［22］在 mRNA 水平上分析了矮牵牛
Red Star 6 个花色苷生物合成过程中的重要基因发
现，只有 CHS 基因的表达受到抑制才使花冠形成红
白相间的现象 ；2006 年祝钦拢［23］将彩叶草 CHS 基
因转入烟草中，烟草叶片出现了色斑。从以上结果
可以看出，CHS 在植物花色呈现过程中的重要作用。
长期以来月季的品种改良一直依赖于传统的遗
传育种方法，关于通过调控 CHS 基因的表达量来改
变月季的花色报道较少。基因工程技术在观赏植物
花色育种上可弥补传统育种技术的缺陷，可在保持
原有性状的基础上，改变观赏植物的花色，甚至创
造该物种所不具有的花色，在较短时期内培育出稳
定遗传的新品种、新类型，孕育着巨大的经济效益。
另一方面它也是研究基因表达、调控和互作机理的
热点课题。鉴于此，本试验希望通过克隆得到月季
CHS 基因序列及其表达分析，为进一步花色基因工
程作准备。对月季进行品种改良，使其花色更加多
样化，在园林上具有更好的观赏价值。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料 ‘仙境’月季（Rosa hybrid）由四
川农业大学园艺学院提供，在晴朗的上午 10 点左右
采集月季初开期（S1）、盛开期（S2）、衰败期（S3）
中层花瓣后，进行液氮速冻，置于 -80℃保存备用。
1.1.2 试 剂 3% CTAB，PVP，75% 乙 醇， 氯 仿，
异丙醇，DEPC 处理水，反转录试剂盒（Fermentas），
琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒（生工生物上海有限公
司），Easy-GoTM RT PreMix（北京赛百盛基因技术有
限公司），pMD19-T vector（宝生物工程大连有限公
司），大肠杆菌感受态细胞 JM109（宝生物工程大连
有限公司），LB 平板培养基以及其他常用试剂。
1.1.3 仪器 超低温冰箱（Thermo，美国）、超纯水
系统（F4PN84631，MILLIPORE）、全自动高压灭菌
锅（TOMY， 日 本 ）、PCR（Polymerase Chain React-
ion）仪（Bio-Rad，美国）、低温高速离心机（Eppen-
dorf，德国）、超净工作台（SW-CJ-2FD 型，苏州安
泰）、凝胶成像系统（SYNGENE，美国）、恒温摇床
（HQL150C 型，武汉中科）、恒温箱、电泳仪（北京
六一仪器厂）、电泳槽、电热恒温干燥箱（上海跃进
医疗器械厂）、微波炉等。
1.2 方法
1.2.1 总 RNA 的提取和 cDNA 第一条链的合成 花
瓣 总 RNA 的 提 取 采 用 改 良 后 的 CTAB 法［24］， 在
RNA 提取过程中防止 RNA 污染，减少降解。按照
反转录酶使用方法进行合成 cDNA 第一条链，20 μL
PCR 反应体系，此过程在冰上进行。
1.2.2 查尔酮合成酶基因 cDNA 片段的克隆与测
序 根据 GenBank 上已登录的 CHS 同源基因的蛋白
质保守序列，利用 CODEHOP 软件设计了一对简并
引物，引物由上海生物工程有限公司合成。
引物 ：RhCHSF ：5-CCKTCHYTGGAYGCNMGR-
CARGAC-3 ；RhCHSR ：5-GGBCCRAANCCRAANA-
RMACACC-3。对月季花瓣总 RNA 经反转录后合成的
第一条链 cDNA 进行扩增。扩增程序为 ：94℃预变
性 3 min ；94℃变性 1 min，47℃退火 1 min，72℃延
伸 1 min，34 个循环 ；72℃延伸 10 min ；12℃保存。
扩增产物电泳检测后用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收
目的条带，将回收产物与克隆载体 pGEM-T easy 连
接，转化大肠杆菌 JM109，用蓝白斑筛选重组子，筛
选出阳性克隆及 PCR 检测，选取经鉴定含有目的片
段的菌液送至测序。测序由上海英骏生物公司完成。
1.2.3 表达分析 采用半定量 RT-PCR 的方法，把
月季在初花期（S1）、盛花期（S2）、衰败期（S3）
所提取的总 RNA 进行反转录后，合成单链 cDNA。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第7期68
利用甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作为内参，调
整 PCR 反应模板量。根据 RhCHS 序列，设计一对
特异引物 RhCHS forward 和 reverse，引物 RhCHSF ：
5-CGACTACTACTTCCGTAT-3 ；RhCHSR ：5-
TTCAACAACCACCATATC-3。扩增程序为 ：94℃预
变性 3 min ；94℃变性 1 min，47℃退火 1 min，72℃
延伸 1 min，36 个循环 ；15℃保存。
2 结果
2.1 总RNA的质量检测
从月季花瓣中提取的总 RNA 近无色，不呈胶
状，经琼脂糖凝胶电泳检测，紫外凝胶成像仪观察
发现，在 RNA 条带附近及点样孔周围没有发亮现象，
初步鉴定样品基本不含多酚、蛋白质等杂质 ；同时，
如图 1 所示，28S，18S 和 5S 条带条带清晰干净，
条带之间不弥散。其中 28S RNA 条带的亮度为 18S
RNA 条带的 2 倍，说明提取得到的总 RNA 完整性好。
紫外分光光度计测定，A260/A280=1.91，A260/A230=1.79
表明提取的总 RNA 样品较纯净，样品中多酚及蛋白
质的含量等杂质很少，无 DNA 污染。以上说明改良
后的 CTAB 法适合月季花瓣 RNA 的提取，且提取的
总 RNA 质量较高，可用于后续试验。
28S
18S
5S
图 1 提取的月季花瓣总 RNA 电泳图
M 1
1000
bp
500
300
ⴞḷᶑᑖ
M ：DNA Marker ；1 ：CHS 基因保守区
图 2 月季 CHS 基因保守区序列扩增电泳图
AF400567.1）、 悬 钩 子（Rubus hybrid ：JN602374.1）、
碧桃（Prunus persica ：JN391444.1）等植物的同源性
达到 98%、92%、92%、87% 和 87%，推测该序列
为 CHS 基因 cDNA 的同源片段（表 3）。
表 3 月季与其他蔷薇科植物 CHS 基因同源性比较
登录号 植物 得分 期望值 同源性（%）
AB038246.1 Rosa hybrid 818 0.0 98
HQ423171.1 Rosa chinensis 803 0.0 98
AB201758.1
Fragaria×
ananassa
647 0.0 92
AF400567.1 Rubus idaeus 644 0.0 92
JN602374.1 Rubus hybrid 518 0.0 87
JN391444.1 Prunus persica 509 0.0 87
2.3 不同时期月季查尔酮合成酶基因（CHS）的表达
采用 RT-PCR 的方法对 CHS 在月季花发育过程
中的表达变化进行分析，通过凝胶电泳（图 3）可
以看出，衰败期的 CHS 表达量几乎没有，而盛花期
的表达量最高，CHS 从初花到衰败呈现出先上升后
下降的趋势，与其花瓣颜色变化相一致，这是由于
CHS 影响花色素的积累。
3 讨论
进行分子生物学试验提取高质量的 RNA 是最首
要和关键一步，在提取 RNA 的过程中通常会受到污
染物的干扰。植物组织中富含的糖、酚类、蛋白质、
植物次生代谢物质，DNA 等限制了高质量 RNA 的分
离［25，26］。目前，大多采用 CTAB 法提取 RNA［27-29］。
本试验用的材料是花瓣，色素等次生代谢物质较
多，分离纯净的 RNA 难度较大，所以采取了改良后
的 CTAB 法，通过凝胶电泳和分光光度法对提取的
RNA 进行检测，3 条带清晰完整，RNA 的 A260/A280
2.2 CHS基因cDNA保守区序列的PCR扩增
以逆转录合成的 cDNA 第一链为模板，利用一
对简并引物 RhCHSF 和 RhCHSR 进行保守区扩增，
产物经琼脂糖凝胶电泳，可见一条约 850 bp 的条带
（图 2）。对该片段进行回收、连接转化、测序，得
到一段 860 bp 的 cDNA 序列与预期片段长度一致。
通过 Blast 程序，与 GenBank 上的其他植物的比较
分析，该片段序列与已登录月季品种（Kardinal ：
AB038246.1；Xing-xing-hei：HQ423171.1）、草莓（Fr-
agaria×ananassa ：AB201758.1）、树莓（Rubus idaeus ：
2013年第7期 69张云婷等 ：月季查尔酮合成酶基因片段的克隆及其表达分析
片段，为以后获得 CHS 全长奠定了基础，同时探索
了月季不同发育时期 CHS 的表达情况，为其着色机
理和分子育种提供了理论基础。
4 结论
从月季（Rosa hybrida）花瓣中成功提取出总
RNA，获得 RhCHS 的 cDNA 片段长度为 860 bp，编
码 287 个氨基酸残基，GenBank 登录号 KC145553。
同源序列比对发现，月季 RhCHS 与其他植物的同源
性很高，说明 CHS 在进化的过程中具有高度的保守
性。表达谱分析表明，CHS 在盛花期表达量最高。
参 考 文 献
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RcCHS
S1 S2 S3
GAPDH
S1 ：初开期 ；S2 ：盛开期 ；S3 ：衰败期
图 3 查尔酮合成酶基因（CHS）不同时期表达情况
在 1.8-2.0 范围内，质量较好，符合后续试验的要求，
且该方法简单易行，耗时短。
将克隆得到的核苷酸基因序列翻译成氨基酸
序 列， 提 交 NCBI 在 线 用 BLAST 进 行 搜 索 比 对，
RcCHS 与其他植物有较高的同源性，说明 CHS 在进
化过程中的保守性。PCR 扩增遵循酶促反应定律，
开始的循环内扩增产物呈指数累积，产物和模板呈
线性关系 ；当达到平台效应时，随着循环次数的增
加，产物产率不再增加。半定量 RT-PCR 正是利用
产物和模板的这一线性关系，通过扩增来对比目的
基因的表达。结果显示，月季花瓣初开到衰败，查
尔酮合成酶基因表达的规律，先上升后下降，在盛
花期达到峰值，衰败期几乎无表达，可能因为植物
后期代谢减缓，物质分解消耗等原因。CHS 基因是
一个较大的基因家族，研究表明，在大部分植物当
中 CHS 存在多拷贝，在同源基因之间的表达呈现差
异特性。例如，拟南芥中 CHS 基因在花、叶、果中
都有表达［30］，而矮牵牛中的 CHSA 和 CHSJ 只在花
粉囊和花冠中特异表达［31］。在一些植物中 CHS 在
不同的发育时期表达的位置也不相同。在一些植物
的早期发育阶段，CHS 出现在叶片组织中［32］，而成
熟植株中主要限于花组织中表达［33］。CHS 基因在同
一器官中的表达部位也不尽相同。2006 年，Mahroug
等［34］通过原位杂交技术，表明长春花 CHS 基因在
花瓣的上表皮表达。而有些植物的 CHS 基因则在花
药中表达。2010 年，宋婷婷等［35］在苹果属观赏海
棠 McCHS 基因的克隆及实时定量研究中推测 CHS
的相对表达量在整个叶片的发育过程中会逐渐发生
改变或者发生不同部位、器官的特异表达。大量研
究表明，CHS 基因表达模式受到外界环境因子、上
游启动子序列和转录因子共同调控。
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（责任编辑 狄艳红）