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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 9 期
绿色荧光蛋白(ZsGreen)基因在长石莼细胞中的表达
何建华1，2 汤文仲2 叶静2 田琪琳2，3 何培民2，3
(1上海市农业科学院生物技术研究所，上海 201106;2上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306;
3上海海洋大学海洋科学研究院，上海 201306)
摘 要: 主要研究绿色荧光蛋白(ZsGreen)基因在长石莼(缘管浒苔)细胞中的表达。应用绿色荧光蛋白基因、抗除草
剂 bar 基因、CMV 35S启动子和 SV40 双启动子构建了质粒载体 PSV-bar-ZsGeen，采用改进的 PEG 法将质粒载体 PSV-bar-Zs-
Geen导入到缘管浒苔原生质体中，经过细胞培养发育再生藻株，通过除草剂筛选出阳性藻株，且转化率达 38． 58%，进一步
PCR分子检测和显微荧光检测表明，绿色荧光蛋白基因在转基因植株中得到表达，为今后转基因浒苔研究奠定基础。
关键词: GFP PEG转化 缘管浒苔 报告基因
Expression of Green Fluorescent Protein(ZsGreen)in Ulva linza
He Jianhua1，2 Tang Wenzhong2 Ye Jing2 Tian Qilin2，3 He Peimin2，3
(1Biotechnology Research Institute of Shanghai Academy of Agricultural Sciences，Shanghai 201106;
2College of Fisheries and Life Science，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306;
3 Institute of Ocean Science，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306)
Abstract: In this paper，expression of green fluorescent protein(ZsGreen)in Ulva linza was studied． The PSV-bar-ZsGeen ex-
pression vector was successfully constructed，which contained PPT resistance gene bar，the promoter of CMV 35S and SV40． With im-
proved PEG method，the PSV-bar-ZsGreen vectors were transferred into protoplasts of Ulva linza and the transferred protoplasts were
cultured and regenerated into younger plants． The transferred cells(or plants)resisting to Basta were selected，and the relative transfor-
mation rate reached up to 38． 58% ． The further study successfully constructed the detection system with PCR technology and Fluores-
cence microscope OLYMPAS IX71 on the lever of gene and protein． All these studies would built foundation for the further research on
transgenic Ulva linza．
Key words: GFP PEG-mediated transformation Ulva linza Reporter gene
收稿日期:2011-04-13
基金项目:国家自然科学基金资助项目(30371101) ，国家“863”计划资助项目(2009AA064401)
作者简介:何建华，男，硕士研究生，研究方向:转基因技术，代谢工程;E-mail:lovebio412@ yahoo． com． cn
通讯作者:何培民，男，博士，教授，博士生导师，研究方向:藻类生物技术与分子生物学;E-mail:pmhe@ shou． edu． cn
缘管浒苔(Ulva linza)隶属绿藻门(Chlorophyco-
phyta) ，绿藻纲(Chlorophyceae) ，莼目(Ulvales) ，石
莼科(Ulvaceae)。浒苔类作为一种大型经济海藻，
其产品清香独特，在日本及韩国已大规模栽培生产，
我国南方也已开始栽培生产［1］。浒苔藻体光合作
用效率高，生长快，日相对生长率可高达 50%［2］。
利用大型海藻浒苔生物质成功制成生物油、生物乙
醇已经实现［3］。浒苔提取物蛋白粉、绿藻精、多糖
等具有抗癌、抗溃疡、免疫调节等药用价值［4，5］，浒
苔可制成饲料添加剂，2008 年青岛绿潮爆发成体浒
苔被制成饲料出口日本、韩国［6］。
已报道浒苔可以快速吸收氮、磷改善水质，是一
种重要的“反硝化反应器”［7］，并且通过相生相克作
用改变水域生态系统的结构和交替顺序［8］，具有显
著的生态修复作用［9］。缘管浒苔生长快、开展具有
自身不含毒蛋白、栽培成本低、生物量大及有利于改
善环境等优点，因而通过基因工程技术将缘管浒苔
开发为廉价高效的生物反应器，大量生产高附加值
产品，开展浒苔资源化利用与深加工有着深远的
意义。
2011 年第 9 期 何建华等:绿色荧光蛋白(ZsGreen)基因在长石莼细胞中的表达
绿色荧光蛋白作为报告基因，在微生物、动物、
单子叶植物、双子叶植物等都获得成功表达［10 － 13］。
在藻类基因工程中，一般将 GUS和 lacZ作为报告基
因通过化学染色方法检测，灵敏度较高，但无法活体
表达水平的跟踪检测;而绿色荧光蛋白可以作为活
体检测指标，在转基因研究具有得天独厚优势。目
前有关绿色荧光蛋白在大型绿藻细胞中其作为报告
基因尚未见报道。
本研究选取 ZsGreen 为报告基因，构建带 CMV
35S 启动子和 SV40 双启动子的质粒载体 PSV-bar-
ZsGreen，并试图将其在长石莼(缘管浒苔)中表达，
为进一步优化选择大型绿藻的转基因转化模型和转
基因大型绿藻资源利用深加工作初步探索。
1 材料与方法
1． 1 材料
长石莼(缘管浒苔) (Ulva linza)藻体为上海海
洋大学实验室保存，株系为 YSJ12。试验用 pSV-bar
质粒由中国科学院秦松教授提供;pZsGreen1-N1 购
自 Clontech公司。
1． 2 方法
1. 2. 1 藻类培养 挑选生长旺盛藻体，放人盛有
VES培养液的三角瓶中进行单株藻体培养，放置于
光照培养箱充气培养。培养条件:20℃，光照周期
12L∶ 12D，光照强度 40 μmol /m2s，每隔 4 － 6 d 更换
新鲜培养基。
1. 2. 2 转化质粒载体构建与扩增 根据 pZsGreen1-
N1表达载体序列设计一对特异引物，在上游引物
pZsGeen1 P1和下游引物 pZsGreen2 P2的5端分别加
上 XbaⅠ酶切位点(下划线部分) ，引物序列如下:
pZsGreen1 P1:5-TCTAGAGTTATTAATAGTA-
ATCAATTACGG-3;P2:5-TCTAGATCAGGGCAAG-
GCGGAG CCGG-3。
PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后。胶回收纯化
PCR产物连接到 pMD20-T载体送样进行 DNA 序列
测定，确定序列克隆正确并正向插入。
用 XbaⅠ37℃酶切 PSV-bar 质粒和正向插入测
序正确的质粒 pMD20-T;过夜后转化 DH5α 感受态
菌，筛选阳性克隆引物序列为:
Test bar + pZsG1:5-GCACCATCGTCAACCAC-
TACATC-3;Test2 + pAs1500:5-GTACATGAAGGCG-
GCGGACAAG-3。
构建的质粒命名为 pSV-bar-ZsGreen，送样
测序。
1. 2. 3 长石莼(缘管浒苔)原生质体制备与 PEG法
转化 长石莼(缘管浒苔)原生质体制备方法参考
Uppalapati等［14］及叶静等［15］文献描述的酶解方法，
酶液配方为:2% Cellulase Onozuka R-10，2% Macer-
ozyme R-10，3% NaCl，1 mmol /L CaCl2，0． 6 mol /L甘
露醇，pH6． 5，50 mmol /L MES 黑暗酶解 2 h。将所
获得的原生质体纯化收集后，利用改进的 PEG
法［16］将质粒转化原生质体，转化介质成分为
0． 6 mol /L甘露醇;15 mmol /L MgCl2;0． 1% MES;用
KOH溶液调 pH至 5． 6，调整原生质体数量约为 2 ×
105个，设置不同 PEG 浓度及 pH、质粒量等优化
PEG 方法，试验组设 4 个平行样，并设阴性对
照组。
1. 2. 4 转化长石莼(缘管浒苔)原生质体筛选 采
用 Basta筛选，方法参见叶静等［17］文献。培养 10 d
后在倒置显微镜下观察原生质体再生小苗，并随机
选择 10 个视野对再生小苗计数，按照以下公式计算
出细胞相对转化率(或相对出苗率) :
相对转化率(%)=(试验组出苗数 －阴性对照
组出苗数)/空白对照组出苗数 × 100%
1. 2. 5 长石莼(缘管浒苔)转基因植株 PCR检测 采
用 LiCl法提取转化 30 d 后植株总 DNA，并设立阴
性对照组和空白对照组。设计特异性引物为 Test
DNA + pZsG1:5-GGCACGGACTTGGCCTTGTA-3，
Test DNA + pZsG2:5-TGGGACCGCTCCTTCCTGTT-
3以扩增长 296 bp的 bar基因片段。PCR反应体系
为 25 μL，反应程序:94℃变性 40 s，60℃退火 30 s，
72℃延伸 45 s，共扩增 30 个循环。扩增后用 1． 0%
琼脂糖凝胶电泳进行检测。
1. 2. 6 长石莼(缘管浒苔)转基因植株荧光检测 转
化 48 h后，随机吸取原生质体用 OLYMPAS IX71 荧
光倒置显微镜观察。将培养 5 d 后的转化试验组和
阴性对照组长石莼(缘管浒苔)细胞转入含 5 ppm
潮霉素的 VSE培养液(比重 1． 015)中筛选，培养条
件为光照强度为 72 μmol /m2s，温度 20℃，光照周期
为 12D∶ 12L。压力培养 3 个月后用 OLYMPAS IX71
荧光倒置显微镜观察。
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 9 期
2 结果与分析
2． 1 质粒构建与鉴定
利用 PCR方法构建带有启动子和表达序列的表
达载体 pSV-bar-ZsGeen(图 1) ，经 Test bar + pAsG1和
Test2 + pAs1500一对引物扩增后，获得目的片段长度
与预期结果一致，且测序结果也与预期结果相符。
A:1，2．质粒 pZsGreen，M． λ-Hind III digest;B:1，2．含 Xba I接头的质粒 pZsGreen的 PCR产物，M． 250 bp DNA Ladder Marker;C:1．
连接 PCR产物后的 pMD20-T，M． 250 bp DNA Ladder Marker;D:M1． DL2000 DNA Marker，2． Xba I酶切后 pMD20-T，3． Xba I酶切后
pSV-bar-ZsGreen质粒，4． Xba I酶切后 pSV-bar 质粒，5． pSV-bar-ZsGreen 质粒，M6． λ-Hind III DNA Marker;E:1． pSV-bar-ZsGreen 质
粒的 PCR产物，M． 250 bp DNA Ladder Marker
图 1 pSV-bar-ZsGreen质粒载体构建
2． 2 长石莼(缘管浒苔)原生质体 PEG 转化方法
优化
图 2 为不同终浓度的 PEG6000对转化效率的影
响，随着 PEG浓度的升高，转化效率越来越高，但是
PEG浓度过高会影响细胞的稳定性，使细胞破碎，
细胞碎片增加，使成活率降低。转化体系中 PEG 浓
度为 20%时，转化效率达到 36%，而此时细胞破碎
不多，对观察分析等后续试验不会造成太大影响，因
此长石莼(缘管浒苔)原生质体转化最适 PEG 终浓
度为 20%。
图 3 显示的是不同 pH的 PEG6000溶液对转化效
率的影响，随着 PEG 浓度的升高，转化效率越来越
高，在 pH8. 0 左右达到最大值，随后随着 pH的进一
步升高而下降。
图 2 PEG6000终浓度对转化效率的影响
图 4 显示的是质粒 DNA 含量对转化效率的影
响，在原生质体量一定(2 × 105个)时，随着质粒浓
度的升高，转化效率也升高，当质粒升高到 25 μg
时，转化效率的变化则不是很大。外源加入的质粒
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2011 年第 9 期 何建华等:绿色荧光蛋白(ZsGreen)基因在长石莼细胞中的表达
图 3 PEG6000溶液 pH值对转化效率的影响
DNA对原生质体稳定性的影响不大，细胞破碎都较
少。因此，转化 2 × 105个原生质体细胞的质粒 DNA
的量选择为 20 μg。
图 4 质粒 DNA含量对转化效率的影响
通过优化，在终浓度为 20% PEG6000，pH8． 0 条
件下 20 μg 质粒 DNA 转化 2 × 105个原生质体细胞
可以取得较好的效果，平均转换率为 38． 58%。
2． 3 转化植株筛选与 PCR检测
提取的转化 30 d后的小苗总 DNA和阴性对照
组总 DNA，以特异性引物 Test DNA + pAsG1 和 Test
DNA + pAsG2 进行 PCR 扩增。其中阴性对照组中
未出现条带，转化后的总 DNA扩增出的条带与从质
粒中扩增的条带大小一致(图 5) ，测序所获得的目
的片段 296 bp与预计序列一致。
1．阴性对照;2 － 4．转化小苗总 DNA的 PCR
产物;M． 250 bp DNA Marker
图 5 PCR电泳图谱
2． 4 转化植株荧光检测
图 6-A为转化 12 h 后的原生质体在蓝光激发
下呈现的绿色荧光，表明绿色荧光蛋白基因在细胞
内得到瞬间表达;而未转化的细胞因叶绿素干扰呈
现出红色荧光。
A． 12 h在原生质体中表达;B． 30 d后在转化藻体细胞中表达(绿色荧光为下方箭头所指;红色荧光为上方箭头所指)
图 6 绿色荧光蛋白基因在长石莼(缘管浒苔)原生质体和藻体中表达
将转化的原生质体继续培养至 72 h 后，原生质
体已开始再生发育为藻株，其中转化的藻株仍然呈
明显绿色荧光。1 周后将再生藻株转移至加有 basta
培养液中进行持续压力培养。培养 1 个月后，转化
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藻体在荧光显微镜下观察到整棵藻体均呈现出绿色
荧光，而阴性对照组始终呈现出红色荧光(图 6-B) ，
表明绿色荧光蛋白基因已在转化的长石莼(缘管浒
苔)细胞中得到表达。
3 讨论
由于大型海藻的生长环境为流动的水体，因此
对转基因海藻安全性问题的考虑不同于陆地作物，
特别应考虑孢子释放可能造成的基因逃逸问题。在
转基因种植方面，一方面可以利用海边的池塘进行
养殖，控制可能的基因逃逸;另一方面本实验室现在
已经建立起来封闭水体的精养模式和光生物反应
器［18］，对浒苔的野外栽培、繁殖方式进行了有益探
索。将目前“绿潮”灾害物种与南方开放式、低产出
栽培形式，升级成为封闭式、小规模、高产出形式，将
大大提高浒苔的深加工利用。
GUS和 LacZ常作为瞬时表达报告基因，本实验
室也曾利用 GUS和 LacZ基因对长石莼(缘管浒苔)
瞬时表达进行验证。但对 GUS 和 LacZ 活性分析不
仅耗时费力而且需要加入外源底物和诱导物(如
IPTG，X-gal)。用荧光蛋白代替 GUS 和 LacZ 不仅
可以使用各种荧光显微镜均可进行检测，而且能够
对启动子活性等优化条件进行直观分析，并且荧光
蛋白抗体已经实现商业化，利用其抗体通过 Western
blotting可以实现蛋白表达的量化。
PEG转化方法中 PEG 的浓度、pH、质粒量与原
生质体数量相对量对转化效率有很大影响，我们通
过对这些因素的试验优化了大型绿藻缘管浒苔的转
化系统，取得了一定效果。进一步地提高转化效率
需要从载体分子构件等方面继续优化，如转录阶段
元件调控，启动子和终止子上;在翻译阶段元件的调
控等，还可以通过受体细胞生理状态、与其他转基因
方法的比较等方面深入探索大型绿藻缘管浒苔的转
化系统。
利用荧光蛋白作为报告基因检测转基因植物
时，其表达水平受基因拷贝数和启动子影响。有报
道认为，转化子中基因插入染色体的拷贝数越高，基
因的表达效率越高。在荧光显微镜下，转录藻株具
有强烈荧光，说明其可能存在多拷贝。SV40 启动子
在哺乳动物、CMV 35S 启动子在哺乳动物和高等植
物中获得广泛应用［19］。作为在真核生物中对 Zs-
Green具有特异性驱动的启动子，本试验在原有载
体基础上构建含有 SV40 启动子和 CMV 35S启动子
的双启动子表达质粒，并获得瞬间表达，表明 SV40
和 CMV 35S启动子能驱动绿色荧光蛋白在大型绿
藻中瞬间表达。
目前，莱茵衣藻叶绿体 atpA 驱动的 EGFP 在盐
生杜氏藻获得表达［20］，但尚未见其他绿藻启动子驱
动荧光蛋白表达报道。浒苔叶绿体 rubisco 大亚基
及其上游启动子已经克隆［21］，可以利用藻内源启动
子与其他高效启动子共同作用，从而提高外源基因
的表达效率。
基于原生质体再生技术，已经发展了电击法、玻
璃珠法、碳硅钎丝穿刺法等方法［22］，在 PEG 法的基
础上，利用本研究的载体对原有技术进行改善，可能
开发出其他缘管浒苔的转化方法。
利用本次构建的质粒载体可以进一步研究启动
子活性、对密码子偏爱、对叶绿体基因组基因编码区
的影响和其对绿色荧光蛋白的启动效果。这为深入
研究大型绿藻叶绿体的转录调控元件和调控机制以
及优化缘管浒苔转化模型奠定了基础。
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(责任编辑 马鑫
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