全 文 :技术与方法
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 3期
微生物分子生态学技术在湖泊微生物
多样性研究中的应用
武婷婷 生吉萍 申琳
(中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京 100083)
摘 要: 微生物是湖泊生物圈物质循环和能量流动的主要参与者, 在湖泊的生态系统中起着重要的作用。但是, 湖泊
中存在着大量不可培养的细菌,利用传统的培养技术, 无法对湖泊微生物的多样性进行深入而全面的研究,而不依赖培养的
分子生物学技术的发展为此方面研究开辟了新的路径。微生物分子生态学作为分子生物学与微生物生态学交叉产生的学
科, 在研究湖泊微生物多样性方面已经得到了广泛的应用。主要综述了变性梯度凝胶电泳 ( PCRDGGE)技术, 末端限制性酶
切片段长度多态性技术 ( TRFLP ), 16S rDNA克隆文库技术等微生物分子生态学技术在研究湖泊微生物多样性方面的应用
情况。
关键词: 湖泊 分子生态学 微生物多样性 16S rDNA PCRDGGE
Application ofM icrobialM olecular Ecology Techniques
inM icrobialD iversity of Lake
Wu T ingting Sheng J ip ing Shen L in
(College of Food Science and Nutr itional Eng ineering, China Agricultural University, Beijing100083)
Abstrac:t A sm a jo r participants in nutr ient c ircu lation and energy flow in the lake, m icroorgan ism s p lay an important ro le in eco l
ogy and env ironm ent of lake. Due to lack o f cu ltured bacter ia in aquatic ecosystem s, the div ers ity o f bacte rial comm un ities has no t been
ex tensively studied by trad itiona l m ethod. H ow ever, deve lopm ents in m o lecular b io log ical techno logy which w ere culture independent
br ing a new path for scien tists to investigate bacter ia l communities. M o lecular eco logy, as the intersec tant sub jec t o f mo lecu lar b io logy
and m icrob ial ecology, is be ing preva lent in m icrob ia l d iversity o f lake. In this paper, som e m ethods, including PCRDGGE, RFLP,
16SrDNA c lon ing librar ies we re described. And the ir applica tions o fwh ich in them icrob ial d iversity of lakew ere a lso summ arized in the
rev iew.
Key words: Lake M o lecu la r eco logy M icrob ia l d iversity 16S rDNA PCRDGGE
收稿日期: 20091126
基金项目:农业部公益性行业 (农业 )科研专项 ( 200803033 )
作者简介:武婷婷,女,硕士研究生,从事果疏采后病理与农副产品资源综合利用研究; Em ai:l w u tingt ing@ 126. com
通讯作者:申琳,男,博士, Em ai:l pingshen@ sau. edu. cn
微生物是地球上所有生命中必不可少的一个部
分,它在环境气候形成、地球化学循环、地质演化和
生物进化中扮演着重要的角色。微生物作为物质循
环和能量流动的主要参与者,与区域环境有着密切
的关系,在湖泊生态系统特别是氮磷循环中起着至
关重要的作用。湖泊微生物的多样性研究, 有助于
人们更为深入地掌握湖泊微生物的分布特征及其在
湖泊生态系统中的功能与作用,对深入开展湖泊生
态环境研究具有重要的意义。
传统上的微生物分离培养方法虽然在过去的几
百年推动着微生物学科的发展, 是微生物学发展的
基础,但是存在着很多的缺陷。由于现有的微生物
分离和培养方法无法再现其天然环境条件, 导致绝
大多数微生物难以培养, 采用标准微生物学培养技
术测定不同生境微生物可培养性, 发现海水中微生
物可培养性约为 0001% - 01% , 淡水中约为
2010年第 3期 武婷婷等:微生物分子生态学技术在湖泊微生物多样性研究中的应用
025%, 土壤中约为 03% ,活性污泥中约为 1% -
15%左右 [ 1] ,这就给客观认识环境中微生物的存在
状况造成了严重地障碍。
近年来,随着分子生物学的发展, 基于 DNA方
法的群落分析方法也得到了迅速的发展,如 16S rD
NA技术、变性梯度凝胶电泳技术 ( DGGE )、限制性
酶切片段长度多态性技术 ( RFLP)和宏基因组文库
技术等多种分子生物学技术的发展, 克服了经典培
养方法的不足以及容易引起种群丢失等缺陷, 可以
使人们更更快速地了解环境中微生物多样性, 为微
生物生态的研究开辟了一条新途径。分子生物学技
术在湖泊微生物多样性的研究中也得到了广泛的应
用,极大了促进了湖泊遗传多样性、种群结构和湖泊
微生物生态功能的研究。
1 分子生态学技术在湖泊微生物多样性研
究中的应用
1. 1 16S rDNA克隆技术在湖泊微生物多样性研究
中的应用
1. 1. 1 16S rDNA克隆技术的原理 16S rDNA克
隆文库法是微生物分子生态学中用以调查环境中原
核微生物组成的常用方法之一, 在 1990年首次被
G iovannoni等 [ 2]应用于分析马尾藻海海面浮游微生
物的多样性。目前 16S rDNA克隆文库技术已经在
研究微生物多样性方面已经得到了广泛的应用。首
先从样品的总 DNA中 PCR获得其中所有的 16S rD
NA,将其插入载体并转化宿主, 构建克隆文库。随
机挑取文库中的克隆,对其进行插入片段测序,通过
序列分析获得其 16S rDNA所对应的微生物的系统
发育地位,并可以根据含有同种序列插入片段的克
隆数的多少,分析样品中对应细菌的分布比例。
1. 1. 2 16S rDNA克隆技术的应用 16S rDNA克
隆文库技术在研究湖泊微生物多样性方面、特别是
细菌和古细菌的多样性方面, 取得了很大的进展。
Duckw orth等 [ 3]采用克隆文库研究非洲大裂谷东部
肯尼亚地区的碱湖细菌和古菌的多样性, 发现了一
个属于热孢菌属的新种。 1997年, H iom s等 [ 4]通过
16S rDNA克隆文库研究了 Ad irondack南部地区 7
个湖泊的细菌多样性, 分析湖泊酸化对其细菌群落
结构的影响。Lehours等 [ 5]也通过这个方法分析法
国孔雀湖缺氧区不同深度细菌和古菌的群落组成状
况。范华鹏等 [ 6]通过建立 16S rDNA克隆文库的方
法, 分析西藏扎布耶卡盐碱湖古菌多样性, 结果表
明,该湖的嗜盐古菌除分布在 8个嗜盐古菌属外, 还
有一些形成了独立的分支, 预示可能存在新种或新
属, 较全面地认识了盐湖中古菌的组成情况,为进一
步研究我国的盐碱湖微生物生态系统提供了重要依
据。马延和等 [ 7]研究了内蒙古贝尔盐碱湖的细菌
多样性,结果显示该湖中革兰氏阴性菌占大多数,并
存在潜在新种的可能性。Bowm an[ 8]采用克隆文库
的方法分析南极洲西福尔山盐湖中细菌的多样性。
E iler等 [ 9]分析比较瑞士 4个湖泊中蓝藻水华时期
浮游细菌的群落结构,研究蓝藻水华和浮游细菌群
落之间的关系,发现了与蓝藻水华有关的新的基因
簇。吴鑫等 [ 10]也通过这个方法, 建立三、五、七、九
等不同月份的 16S rDNA克隆文库, 分析比较蓝藻
水华前后湖中细菌群落变化情况。 S jling等 [ 11]通
过建立文库的方法分析南极洲的一个冰川湖泊的沉
积物时,发现其中的古细菌含量很少,而大多数细菌
属于变形菌,放线菌和螺旋菌。刘勇勤等 [ 12]研究珠
穆朗玛峰山区冰碛湖和冰川融水中的细菌群落结构
时, 发现该地区存在大量的 CytophagaF lavobacteria
Bacteroides( CFB )菌株是该地区区别于其他高山湖
泊的重要特征。 Sek iguchi等 [ 13]采用克隆文库的方
法分析沿长江水域细菌群落结构的变化,结果显示
主要的细菌群落由上游的 变性菌和 CFB向下游
高 G + C含量的革兰氏阴性菌转变, 该研究为以后
分析三峡大坝的建造引起的细菌群落的改变提供了
参考依据。16S rDNA克隆文库技术在研究湖泊微
生物多样性方面已经得到了广泛的应用,相信在以
后的研究中它会发挥更加巨大的作用。
1. 2 变性梯度凝胶电泳 ( PCRDGGE )技术在湖泊
物多样性研究中的应用
1. 2. 1 PCRDGGE技术的原理 DGGE最早用于
检测 DNA突变, 1993年 Muyzer[ 14]首次将该技术用
于分析土壤的微生物区系, 成为检测微生物多样性
的一种有效方法。一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳能分
离不同大小的 DNA分子, 但是大小相同碱基序列不
同的 DNA片段因其具有相同的迁移行为而不能被
分开。变性梯度凝胶电泳 ( denaturing gradient ge l
elecrophoresis, DGGE )技术在一般聚丙烯酰胺凝胶
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 3期
电泳的基础上添加了呈梯度分布的变性剂 (如尿素
和甲酰胺 ), 使双链 DNA分子迁移到一定的变性剂
浓度并达到其解链温度时, 便开始部分解链。而部
分解链的 DNA分子其迁移率随解链程度增大而减
小,从而使序列不同分子相近的 DNA片段滞留于凝
胶的不同位置,形成相互分开的谱带。理论上认为,
只要选择合适的电泳条件 (变性剂浓度、电泳时间、
电压等 ) ,最低可以检测到一个碱基的差异。
1. 2. 2 PCRDGGE技术的应用 在湖泊微生物多
样性研究方面, DGGE目前广泛的用于湖泊浮游细
菌多样性的研究。 vre s[ 15]通过扩增 16S rDNA的
V3区的方法研究 Sae lenvannet湖不同深度浮游细菌
的多样性组成,结果表明,随着湖深度的增加, 细菌
多样性减少,而古细菌的多样性增加,通过特异性探
针发现了各个深度都有硫酸盐还原细菌和产甲烷菌
的存在。Konopka[ 16]采用 DGGE的方法分析美国印
第安纳州东北部一系列小的锅状湖的浮游细菌的主
要群落组成。Kondo[ 17 ]确定了 Suigetsu湖浮游细菌
群落发生氧化还原反应的合适的深度。颜庆云
等 [ 18]通过 DGGE的方法研究东湖 5个具有不同营
养水平的地点的浮游生物群落的组成, 研究浮游生
物群落对不同环境因子的响应, 并探索 DGGE在监
控湖泊环境变化条件中的应用。余育和等 [ 19]通过
DGGE的方法研究东湖 5个不同地点的浮游生物群
落的遗传多样性,研究它们对主要影响因子之间的
关系。曾巾等 [ 20]分析了太湖和玄武湖沉积物中的
细菌群落的垂直分布, 并通过多变量分析手段证明
pH和有机物含量是影响细菌群落组成的主要因素。
邢鹏等 [ 21]研究太湖梅梁湾和湖心区浮游细菌的种
群基因多样性以及种群基因组成的季节变化特征,
结果表明太湖浮游细菌具有丰富的基因多样性,其
丰度及多种指数都有显著的季节变化规律。 De
W ever等 [ 22]研究了坦噶尼喀湖的细菌群落组成,结
果表明,细菌群落结构随着湖水空间位置的变化而
变化。L indstrm等 [ 23]通过 DGGE的手段研究对于
流动性不大的湖来说, 引入细菌对于其浮游细菌群
落结构的影响,结果表明引入细菌一定程度上影响
了湖水的浮游细菌群落结构。赵兴青等 [ 24] 采用
DGGE技术分析比较了南京市玄武湖、莫愁湖和太
湖的表层沉积物微生物群落结构的不同。 Dem er
gasso和 R ees等 [ 25, 26]也都采用 DGGE的方法分析细
菌群落的多样性。这些试验结果表明, DGGE能有
效分析湖泊微生物生态系统的多样性,通过指纹图
谱直接再现群落结构,监测其种群的变化,并且在研
究微生物多样性时有其独特的优势。在扩增引物的
5 端加上一个 GC夹板, 能分离出 1个碱基的差异,
其重复性也较好, 目前已成为微生物群落遗传多样
性和动态性分析的强有力的工具。
1. 3 限制性酶切片段长度多态性 ( RFLP)和末端限
制性酶切片段长度多态性 ( TRFLP)技术在湖
泊微生物多样性研究中的应用
1. 3. 1 RFLP和 TRFLP技术的原理 限制性酶切
片段长度多态性 ( restrict ion fragment length polymor
ph ism, RFLP)是发展最早的分子标记技术。 RFLP
技术的原理是检测 DNA在限制性内切酶酶切后形
成的特定 DNA片段的大小。因此, 凡是可以引起酶
切位点变异的突变如点突变 (新产生和去除酶切位
点 )和一段 DNA的重新组织, 如插入和缺失造成酶
切位点间的长度发生变化等均可导致 RFLP的产
生。末端限制新片段长度多态性 ( TRFLP)方法是
结合 PCRRFLP发展起来的一种方法, 即利用一定
的标记引物对样品中的 DNA进行特异扩增, 然后进
行限制性内切酶酶切,检测末端限制片段的多样性,
主要应用于微生物群落组成和结构、微生物系统发
育及菌种鉴定研究,是一种应用比较广泛的微生物
生态学研究方法。TRFLP技术最早报道于 1997
年, 被用于研究微生物种群的多样性,目前该技术逐
渐被广泛应用。
1. 3. 2 RFLP和 TRFLP技术的应用 在湖泊微生
物多样性研究中, RFLP和 TRFLP技术的应用以微
生物群落结构及功能的分析为主。Wh itby等 [ 27]利
用 RFLP技术分析了富营养化的淡水中产甲烷菌的
分子多样性。林巍等 [ 28]也利用 RFLP的技术研究中
国北部密云湖的趋磁细菌的多样性。Mark等 [ 29]利
用 TRFLP技术研究美国加利福尼亚州北部温泉湖
微生物群落的稳定性。 Schw arz等 [ 30]采用 TRFLP的
方法研究加里利湖湖底沉积物中古细菌和细菌群落
结构,图谱分析结果显示, 在古细菌群落中 M etha
nom icrobiales和 M ethanosaeta spp. 占优势, 在细菌群
落中, D eltap roteobacteria和硫酸还原菌占优势。Kon
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2010年第 3期 武婷婷等:微生物分子生态学技术在湖泊微生物多样性研究中的应用
stan tin id is
[ 31 ]分析了湖底沉积物中细菌群落的多样
性, 数据显示在好氧且有高浓度的铜存在的条件下
至少有 20种基因型和至少两个属存在。 Pester
等 [ 32]采用 TRFLP技术和克隆文库结合的方法分析
一个滨海湖沉积物中甲烷氧化菌的多样性, TRFLP
结果显示,在最上层沉积物中活性的和在下层沉积
物中非活性的甲烷氧化菌群落结构十分相似。 Jar
dillier
[ 33]同时利用 FISH技术和 TRFLP技术监控湖
泊中氮磷含量和其它因素对原核生物群落结构的影
响。目前,这两项技术已经越来越多的运用到了湖
泊生态环境中微生物群落结构和功能的研究中,这
对于人们更多更深入地了解湖泊生态环境, 更加有
效地保护和利用它们起到了巨大的作用。
2 结语
在分析湖泊微生物多样性的过程中, 采用多种
分子生物学手段相结合的方法能够取长补短, 弥补
单纯使用一种分析方法的不足。随着核酸测序技术
的不断发展、数据库中核酸序列的不断丰富,用分子
生物学手段进行湖泊微生物群落结构必将得到更加
广泛的应用,而湖泊微生物这个神秘的 ! black box∀
也会随着各种技术的不断完善、发展和综合利用而
谜解。
参 考 文 献
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