全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 7 期
苦荞中查尔酮合成酶全长基因的克隆及其序列分析
胡耀辉1 王冠2 刘凯3 于寒松1
(1吉林农业大学食品科学与工程学院，长春 130118;2吉林农业大学生命科学学院，长春 130118;
3吉林农业大学食品科学与工程学院和吉林省农业综合开发办公室，长春 130118)
摘 要: 选用乌克兰伊琳娜苦荞为试验材料，以从叶片中提取的 RNA 为模板，应用 RACE 技术结合 CODEHOP 引物设
计方法成功克隆出苦荞中查尔酮合成酶 cDNA序列后，将其序列电子合并其全长后设计基因全长特异性引物。以 DNA 为模
板进行 PCR扩增出基因序列。通过生物信息学分析表明，该基因全长为 1 906 bp，具有一个 463 bp的内含子序列，编码区长
度为 1 188 bp，编码 395 个氨基酸。Blastn序列比对发现本试验所获得的 CHS基因序列与相近物种 Rheum palmatum(登录号:
DQ205352. 1)的 CHS基因同源性达 86%。将得到的序列命名为 RaCHS 并提交 GenBank，登录号为 HQ434624。应用 Clustal
xl. 81 和 MEGA4 软件构建系统进化树，并进行了同源性分析。
关键词: 苦荞 查尔酮合成酶 RACE 内含子 进化树
Molecular Cloning and Analysis of a Chalone Synthase Gene from
Fagopyrum tataricum
Hu Yaohui1 Wang Guan2 Liu Kai3 Yu Hansong1
(1College of Food Science and Engineering，Jilin Agricultural University，Changchun 130118;2Academy of
Life Science Jilin Agricultural University，Changchun 130118;3College of Food Science and
Engineering and the Office of Comprehensive Development，Jilin Agricultural University，Changchun 130118)
Abstract: Buckwheat from shanxi as experiment material，total RNA was extracted from the leaves． Then the cDNA sequence of
chalcone synthase was cloned by RACE combined with CODEHOP primer design method． The full-length cDNA CHS gene was ampli-
fied using DNA as template by PCR． Bioinformatics analysis show that the full-length of CHS gene sequence of Fagopyrum tataricum is
1 906 bp，including an intron which is 463 bp，and the open reading frame is 1 188 bp encoding 395 amino acids． Phylogenic analysis by
the Blastn on NCBI showed that the identity to other Fagopyrum is 86% ． The gene is named as RaCHS(GenBank accession number is
HQ434624)． Phylogenetic tree constructed by the software of Clustal xl． 81 and MEGA4．
Key words: Fagopyrum tataricum Chalone synthase RACE Introns Cladogram
收稿日期:2010-12-14
基金项目:国家农业部“948”项目(2008-z27)
作者简介:胡耀辉，男，学士，教授，研究方向:食品生物制造与新资源利用;E-mail:huyaohui@ vip． 163． com
通讯作者:于寒松，男，博士，讲师，研究方向:食品生物技术;E-mail:yuhansong@ jluhp． edu． cn
苦荞(Fagopyrum tataricum)学名鞑靼荞麦，属
双子叶蓼科(Polygonaceae)荞麦属(Fagopyrum escu-
lentum)植物［1，2］。研究表明，苦荞具有防治糖尿病、
冠心病、抗癌、防止内出血、降血脂、降血糖及延缓衰
老等多种生理功能［3 － 7］，这些生理功能和药用价值
与苦荞中富含生物活性成分类黄酮有十分密切的
关系［8］。
在生物类黄酮合成途径中，查尔酮合成酶(chal-
cone synthase，CHS)是类黄酮物质合成途径的第一
个酶，也是植物次生代谢途径中的关键酶之一，它催
化丙二酰辅酶 A 的 3 个乙酸基和对羟苯丙烯酰辅
酶 A的 1 个乙酸基缩合［9］，以 4-香豆酰-CoA为最佳
底物，生成查尔酮［10］。而查尔酮是植物类黄酮
(plant flavonoid)物质合成的前体［11］。提高该关键
酶表达量很有可能提高植物或植物细胞内查尔酮的
含量，进而提高类黄酮的含量。因此，克隆苦荞中查
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 7 期
尔酮合成酶基因对在分子水平上调控类黄酮的合成
具有重要的意义。
目前为止，有关苦荞中类黄酮化合物含量的测
定，合成途径及调控的研究报道较多，但是从分子水
平上调控类黄酮化合物的合成和苦荞中 CHS 全长基
因序列的克隆都尚未见报道。因此本研究以苦荞为
材料，采用 RACE(rapid-amplification of cDNA ends)
技术结合 CODEHOP(consensus-degenerate hybrid oli-
gonucleotide primers)引物设计方法克隆苦荞中查尔
酮合成酶基因 cDNA 全序列，并对其进行生物信息
学分析，为从分子水平上调控苦荞中类黄酮化合物
的含量提供前期基础。
1 材料与方法
1. 1 材料
乌克兰伊琳娜苦荞。转化受体菌(Escherichia
coli)DH5α，为本实验室保存。M-MLV 反转录酶为
Promega公司产品，Ex Taq DNA 聚合酶，dNTP，DNA
Marker，pMD18-T载体试剂盒等购自宝生物工程有
限公司。
1. 2 方法
1. 2. 1 苦荞叶片总 RNA 的提取 采用改进的
CTAB-LiCl法，具体步骤参考文献［12］。
1. 2. 2 引物设计
1. 2. 2. 1 3-RACE简并引物设计 上游引物设计:
根据在 GenBank 上已发布的查尔酮合成酶氨基酸
序列，选取其中 6 个，包括 Fagopyrum esculentum(登
录号:ABV72596. 1)、Aquilaria sinensis(登录号:ABM-
73434. 1)、Rheum palmatum(登录号:ABB13607. 1)、Dict-
amnus albus(登录号:CAH61575. 1)、Daucus carota (登
录号:BAA03784. 1)、Populus alba(登录号:ABD24-
222. 1)将这些序列以 FASTA 格式提交到 http:/ /
bioinformatics． weizmann． ac． il /blocks /blockmkr /
www /make_blocks． htmt得到 6 个酶的氨基酸保守区
序列，将最保守的序列提交到在线引物设计软件
CODEHOP(http:/ /bioinformatics． weizmann． ac． il /
blocks /codehop． html)中进行引物设计，得到的引物
命名为 J3CHS，序列:5-CATGATGTACCAGCARG-
GTTGC-3。下游引物设计:根据反转录的引物 P1:
5-GAGGACTCGAGCTCAAGCTTTTTTTTTTTTT-3，
设计下游引物序列为 P2:5-GAGGACTCGAGCT-
CAAGC-3。
1. 2. 2. 2 5-RACE简并引物设计 上游引物设计:
由于苦荞中查尔酮合成酶 5端序列通过生物信息
学手段分析比较保守，所以根据保守序列设计引物
命名为 J5CHSup，序列:5-ATGGCACCGACGGTCCAG-
GA-3。下游引物设计:根据克隆的 3端 cDNA序列设
计引物命名为 J5CHSdown，序列:5-CAGACGACGAG-
GACACGAGC-3。
1. 2. 2. 3 RaCHS基因全长特异性引物设计 根据
电子合并后 cDNA序列开放阅读框(ORF)两端设计
基因全长特异引物。上游引物命名为 CHSup，序列:
5-ATGGCACCGACGGTCCAGGA-3;下游引物命名为
CHSdown，序列:5-AGTTGGCTAGGGTGGTGG-3。
1. 2. 3 PCR扩增条件 以反转录合成的 cDNA 第
一链为模板进行 3-RACE 试验，PCR 程序:94℃预
变性 3 min;94℃ 30 s，56℃ 45 s，72℃ 1 min，30 个
循环;72℃延伸 10 min。5-RACE 试验的 PCR 程
序:94℃预变性 3 min;94℃ 30 s，60℃ 45 s，72℃ 1
min，30 个循环;72℃延伸 10 min。RaCHS 基因全长
序列试验的 PCR 条件:94℃预变性 3 min;94℃ 30
s，58℃ 45 s，72℃ 1 min，35 个循环;72℃延伸 10
min。目的基因的回收、连接、转化、鉴定均按常规方
法［13］操作，序列测定由上海生工生物工程技术服务
有限公司完成。
1. 2. 4 RaCHS生物信息学分析 应用 Clustalxl． 81
和 MEGA4 软件进行序列分析和进化树的建立;核
酸和蛋白质序列同源性分析应用 NCBI 的 Blastn 和
Blastp完成。
2 结果与分析
2. 1 RNA提取
采用改进的 CTAB-LiCl 法提取苦荞叶片总
RNA，电泳结果见图 1。因为锂离子在一定 pH下能
选择性的沉淀核酸，但容易使小分子 RNA 损失，所
以图 1 中只显示 28S 和 18S 的 rRNA 条带，但是在
18S条带附近可以看出弥散性条带，证明 mRNA 丰
度较高，可以作为下一步扩增基因的模板。经紫外
分光光度计进行纯度测定得知 OD260 /OD280值为
1. 91，说明此总 RNA的纯度较高。
66
2011 年第 7 期 胡耀辉等:苦荞中查尔酮合成酶全长基因的克隆及其序列分析
图 1 苦荞叶片总 RNA的电泳图
2. 2 3-RACE试验结果
以提取的苦荞叶片总 RNA 为模板，利用引物
P1 进行反转录，利用引物 P2 和 J3CHS进行 PCR，反
应结束后进行琼脂糖凝胶电泳，结果(图 2)显示 3-
RACE试验获得一条约 800 bp左右的条带。所得片
段与 pMD18-T simple 载体连接，转化大肠杆菌后送
测序公司测序。测序结果显示该序列长为 891 bp，
通过 Blastn序列比对发现与 Rheum palmatum(登录
号:DQ205352. 1)同源性达 88%，是一个新基因，命
名为 RaCHS。
M. DL2000 marker;1． RNA的 PCR扩增结果
图 2 RaCHS 3-RACE结果
2. 3 5-RACE试验结果
以提取的苦荞叶片总 RNA 为模板，利用引物
P1 进行反转录，利用引物 J5CHSup 和 J5CHSdown
进行 PCR，反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳，结果
显示 5-RACE试验获得一个约 550 bp 左右的基因
片段(图 3)。所得片段与 pMD18-T simple 载体连
接，转化大肠杆菌后送测序公司测序。测序结果，序
列长为 572 bp，通过 Blastn 序列比对发现与 Rheum
palmatum(登录号:DQ205352. 1)同源性达 87%。
M. DL2000 marker;1． PCR扩增结果
图 3 RaCHS 5-RACE结果
2. 4 RaCHS基因的电子合并及全长 cDNA的克隆
利用 DNAman 软件对分离的 RaCHS 基因的
cDNA 3端序列和 5端序列测序结果进行电子合
并，得到全长 1 443 bp的序列。利用引物 CHSup 和
CHSdown进行 PCR，扩增出长度为 1 906 bp 的基因
片段(图 4)。同样，该条带经回收，pMD18-T simple
载体连接，转化，鉴定后测序，测序结果除了 + 182
bp到 + 644 bp 的碱基序列以外，其余同电子合并的
结果相符。结果表明序列在 + 182 bp 到 + 644 bp
之间有一个 463 bp的内含子序列。
M. DL2000 marker;1． RaCHS全长 cDNA的 PCR扩增结果
图 4 RaCHS全长 cDNA的 PCR扩增
2. 5 RaCHS基因的生物信息学分析
2. 5. 1 RaCHS 基因的结构域分析 将获得的
RaCHS基因的 DNA 序列通过 NCBI 网上的 Bankit
工具递交 GenBank(登录号:HQ434624)。将 cD-
NA序列翻译成氨基酸序列并应用 NCBI 的 Blastp
程序进行分析，分析结果(图 5)显示，这个基因属
于查尔酮合成酶超家族。RaCHS 翻译蛋白具有
BcsA型结构域，代表 RaCHS可能属于查尔酮茋合
酶类蛋白。
76
·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 7 期
图 5 RaCHS蛋白的结构功能域分析
2. 5. 2 RaCHS基因的进化分析 利用 Clustal X 软
件对 RaCHS基因片段推导的氨基酸序列与其他植
物中功能已鉴定的查尔酮合成酶氨基酸序列进行多
重序列比对，并应用 MEGA4 软件中 Bootstrap test中
的邻位相接算法(Neighbor-Joining)构建进化树(图
6) ，分支上的数字代表该分支的 Bootstrap 支持率。
由图 6 可以看出，RaCHS 基因的同源关系最近的是
蓼科的掌叶大黄(Rheum palmatum) ，与石竹科的满
天星(Gypsophila paniculata)的同源关系也较近，而
与其他植物的同源关系较远。
图 6 RaCHS基因与已鉴定的部分植物查尔
酮合成酶分子系统发育进化树分析
3 结论
查尔酮合成酶(CHS)是类黄酮物质合成途径
中的关键酶。CHS 以 4-香豆酰-CoA 为最佳底物催
化合成生成查尔酮，进而经过一系列途径合成类黄
酮物质，提高该酶表达量可提高植物或植物细胞内
查尔酮的含量，进而提高类黄酮的含量。因此，克隆
苦荞中查尔酮合成酶基因对在分子水平上调控类黄
酮的合成具有重要意义。
到目前为止，本试验首次从苦荞中克隆出 CHS
全长基因序列，并首次应用 RACE(rapid-amplifica-
tion of cDNA ends)技术结合 CODEHOP引物设计方
法成功克隆出苦荞中查尔酮合成酶(chalcone syn-
thase，CHS)基因 cDNA 全序列。序列全长为 1 906
bp，具有一个 463 bp 的内含子序列，编码区长度为
1 188 bp，编码 395 个氨基酸，通过分析 RaCHS基因
序列发现与相近物种的 CHS 基因序列同源性高达
86%。研究结果为阐明苦荞生物类黄酮合成的分子
基础，探索提高苦荞生物类黄酮含量的有效途径奠
定基础。
参 考 文 献
［1］顾尧臣． 小宗粮食加工(四)———荞麦加工． 粮食与饲料工业，
1999(7) :19-23．
［2］林汝法．中国荞麦［M］．北京:中国农业出版社，1994．
［3］孟铭伦，王化忠．苦荞复合食品对糖尿病的降糖作用．辽宁实用
糖尿病杂志，2000，8(3) :22-23．
［4］林洪生．金荞麦抗肿瘤研究进展．中西医结合学报，2004，2(1) :
72-73．
［5］Kayashita J，Shimaoka I，Nakajoh M. Production of buckwheat protein
extract and its hypoc-holesterolemic effect． Current Advances in
Buck-wheat Research，Vol． 2［M］． Japan:Shinshu University Press，
1995:91．
［6］He J，Klag MJ，Whelton MJ，et al． Otsand buckwheat intakes and car-
diovascular disease risk factors in an ethnic minority in China． Am J
Clin Nutr，1995，61:366．
［7］Kreft I，Skrabanja V，Ikeda S，et al． Dietary value of buckwheat． Re-
search Reports UL，1996，67:79．
［8］ Jez JM，Noel JP. Mechanism of chalcone synthase:pKa of the catalyt-
ic cysteine and the role of the conserved histidine in a plant
polyketide synthase． J Biol Chem，2000，275:39640-39643．
［9］Heller W，Craig R，Harris CM． Two alleles of single ocopy chalcones
synt hase gene in parsley differ by a transposable-like element． Arch
Biochem Biophya，1980，200:617-619．
［10］乔小燕，马春雷，陈亮．植物类黄酮生物合成途径及重要基因的
调控．天然产物研究与开发，2009(2) :354-360．
［11］Martin CR. Structure，function，and regulation of the chalcone syn-
thase． International Review of Cytology，1993，147:233-284．
(下转第 72 页)
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 7 期
工程研究中进一步应用奠定基础。
参 考 文 献
［1］马莲菊，张宝石．特异性启动子在植物基因工程中的应用．生物
工程学报，2006，22(6) :882-890．
［2］宋扬，周军会，张永强．植物组织特异性启动子研究．生物技术通
报，2007(6) :21-24．
［3］姚嵘，马三梅．植物果实的特异型启动子． 生命的化学，2006，26
(4) :336-338．
［4］胡廷章，罗凯，甘丽萍，等．植物基因启动子的类型及其应用．湖
北农业科学，2007，46(1) :149-151．
［5］王淼，王旭静，唐巧玲，等．高等植物绿色组织特异表达启动子研
究进展．中国农业科技导报，2010，12(2) :33-37．
［6］李翠，谢华，徐勇，等．桃 PpMADS1 基因启动子的克隆及功能分
析．中国生物工程杂志，2010，30(5) :57-62．
［7］林元震，张志毅，郭海，等． 杨树葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)
基因启动子的克隆与分析． 基因组学与应用生物学，2009，28
(3) :445-449．
［8］王静澄，李昊，崔东清，等．毛白杨 PtSEP3-1 基因启动子的克隆分
析及其表达载体构建． 基因组学与应用生物学，2010，29(2) :
239-244．
［9］萨姆布鲁克 J，弗里奇 EF，曼尼阿蒂斯 T． 分子克隆实验指南
［M］．北京:科学出版社，1992．
［10］Liu XJ，Prat S，Willmitzer L，et al． Cis regulatory elements directing
tuber-specific and sucrose-inducible expression of a chimeric class I
patatin promoter GUS-gene fusion． Mol Gen Genet，1990，223(3) :
401-406．
［11］刘兴军，赵微平，林忠平． 马铃薯 Patatin class-Ⅰ启动子及信号
肽基因的克隆和序列分析．生物工程进展，1996，16(2) :29-30．
［12］ Iglesias AA，Barry GF，Meyer C，et al． Expression of the potato tu-
ber ADP-glucose pyrophosphorylase in Escherichia coli． The Journal
of Biological Chemistry，1993，268(2) :1081-1086．
(责任编辑 马鑫
櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧
)
(上接第 68 页)
［12］于寒松，张继星，马兰青，等． 利用 CODEHOP 方法克隆高山红
景天葡萄糖基转移酶基因 cDNA 片段． 吉林农业大学学报，
2008，30(2) :150-153．
［13］ Sambrook J，Russell DW. Molecular cloning:a laboratory manual
［M］(3rd ed．)． New York:Cold Spring Harbor Laboratory
Press，2001．
［14］牛天敏，马会勤，陈尚武． 大豆查尔酮合成酶(CHS)基因的克
隆、表达及其在雪莲提取液中的代谢产物分析．中国生物工程
杂志，2007，27(2) :58-64．
［15］谢修志，陈兆平，王小菁．非洲菊查尔酮合酶基因的克隆、序列
分析及在大肠杆菌中的表达． 热带亚热带植物学报，2004，12
(5) :431-434．
［16］ Xu F，Cheng SY，Wang Y，et al． Efficient amplification and se-
quence analysis of chalcone synthase gene from Ginkgo biloba by
thermal asymmetric interlaced PCR. J Fruit Science，2007，24(2) :
237-243．
(责任编辑 李楠)
27