全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·综述与专论· 2008年第4期
收稿日期:2007-12-28
基金项目:国家自然科学基金资助项目(30360066);国家科技攻关计划引导项目(2003BA546C);兵团科委项目(NKB02SDXNK01SW)
作者简介:赵英(1974-)女,博士研究生,从事果树与生物技术研究;Tel:0993-2665353,E-mail:zy2665353@126.com
通讯作者:牛建新,Tel:0993-2096770,E-mail:njx105@163.com
1995年7月Science杂志首次刊登了 TIGR(The
InstituteforGenomicResearch)采用全新测序方法完
成的流感嗜血杆菌 (Haemopophilusinfluenzae,RD)
全基因组测序与组合的论文,这是人类完成的第一
个单细胞微生物的全基因组序列的测定,标志着基
因组时代的真正开始[1]。目前,已完成微生物基因
组全序列测定的有 88个,正在进行的有 182个[2]。
Strauss和 Falkow宣称:对许多微生物学家而言,20
世纪末期标志着微生物基因组学的开始[3]。果树病
毒作为一种微生物,其基因组的研究势必也将成为
今后相当长时间内研究的热点。收集相关资料,对
果树病毒基因组研究的意义和测序策略进行了综
述,为今后的果树病毒基因组序列的深入研究提供
新的思路。
1 果树病毒基因组研究的意义
病毒对果树生产的影响是多方面的,果树一旦
被病毒侵染,将终生带毒持久危害,无法用化学药
剂进行有效控制。病毒多为系统侵染,树体周身带
毒,轻者树体生长不良,干扰果树正常生理代谢引
起树体减弱、叶片变色和果实畸形,重者导致树体
急剧衰退、提前枯死或采前落果,甚至绝产,病毒病
的发生和危害已成为我国当前果树生产上丞待解
决的问题。
随着分子生物学的发展,美、欧、日等国家已相
继开展了果树病毒基因全序列或部分序列的测定
工作,根据病毒基因组序列分析制定出基因工程培
育抗病毒果树新品种的战略,为果树病毒防治开辟
新的途径[4]。20世纪 80年代后期,植物抗病毒基因
果树病毒基因组测序的研究
赵英 牛建新
(石河子大学农学院园艺系,石河子 832003)
摘 要: 果树病毒病害由于其危害严重及防治困难,一直是世界植物病理学者和果树生产者所关注的一个重要问
题。而果树病毒基因组的研究在了解病毒基因的结构、功能,病毒基因的致病性及病毒的准确分类等方面有着重要的作
用,因此,综述了果树病毒基因组研究的意义,介绍了果树病毒基因组测序策略中病毒基因组模板的制备、测序方法及测
序产物的注释等方面,并展望了果树病毒基因组测序研究的前景。
关键词: 果树 病毒 基因组 测序
TheResearchofVirusGenomicinFruitTrees
ZhaoYing NiuJianxin
(DepartmentofHorticulture,AgriculturalColegeofShiheziUniversity,Shihezi832003)
Abstract: Fruittreeviruswasalwaysanimportantquestiontowhichtheplantpathologyscholarandthefruit
treeproducerpaysatentionintheworldbecauseitsharm wasseriousanddificultinpreventingandcontroling.The
researchofvirusgenomicinfruittreeswasveryimportantinmanyaspects,suchasvirusgenestructure,thefunction,
viralgenepathogenicityandvirusaccurateclasification.Therefore,thisarticlesummarizedthesignificanceoftheresearch
ofvirusgenomicandintroducedthesequencingstrategyofthefruittreevirusgenomic,includingfruittreevirus
genomictemplatepreparation,measuredofsequencingandannotatedproduct,andforewordtheprospectoftheresearch
ofvirusgenomic.
Keywords: FruittreesVirusGenomic Sequencing
2008年第4期
工程策略研究取得了很大发展。利用病毒本身的一
些基因导入植物成功获得了一大批抗病毒基因工
程植株,已经应用和提出的有导入病毒外壳蛋白基
因,利用病毒卫星 RNA,利用病毒非结构蛋白基因
如复制酶基因、运动蛋白基因、核酸结合蛋白基因
等。但是抗病毒转基因工程绝大部分工作集中于草
本的双子叶植物,对重要的禾谷类作物以及多年生
的果树、树木等木本植物研究较少[5]。因此,通过果
树病毒基因组序列的研究,可以为果树抗病毒基因
工程提供一定的理论基础。同时对果树病毒基因组
研究也有如下意义。
首先,对果树病毒全基因组进行测序并将果树
病毒的基因组序列知识与用来分析序列的情报工
具结合起来,研究果树病毒的毒力和致病性 [7],发
掘果树病毒基因组中潜在的遗传信息,获得未知功
能的病毒核酸序列。其次,使用计算机分析软件对
所获得的核酸序列进行分析,检索具有核苷酸、氨
基酸序列同源性或相似性的基因或蛋白质,以及蛋
白质结合位点、启动子、SD序列 (核糖体结合序
列)、终止密码子等,参考具有同源性的已知功能的
基因或蛋白质的资料,推测和研究所获得的 DNA
序列的功能[8],用于果树病毒分类、亲缘关系分析
等基础理论的研究。自第九界病毒学大会后,与动
物和细菌病毒一样,植物病毒采用了科属种的分类
系统,其中一个重要的分类依据就是病毒基因组的
核苷酸序列和结构[5]。再次,对病毒完整或部分基
因组序列功能及表达策略进行分析,了解病毒的形
态及生物学特性,使果树病毒的分类不断完善并且
日趋合理化。
2 果树病毒基因组测序策略
果树病毒基因组测序策略的重点包括果树病
毒基因组模板的制备、测序方法及测序产物的注释
等方面。
2.1 模板制备
一般果树病毒基因组测序模板的制备包括两
个方面:(1)获得纯化病毒粒子作为模版进行 RT-
PCR或是用于克隆。由于木本植物的病毒含量很
低,一般是通过汁液摩擦接种的方法将病毒转接在
草本指示植物上,再从草本上提取总 RNA,或是提
取 dsRNA以获得纯化的病毒粒子,如果病毒全基
因组序列已知,在进行同源病毒基因组测序时也可
以直接从木本植物上提取总 RNA或 dsRNA;(2)
DNA测序模板的制备。待测 DNA模板的浓度与纯
度,以及在循环测序反应中的终浓度是其测序成功
与否的前提条件,也是最易出现问题的环节。DNA
模板的类型主要有 ssDNA(如 M13)、dsDNA(如各类
质粒)、粘粒、BAC(BacterialArtificialChromosomes)、
细菌基因组 DNA等。其中 PCR产物及质粒 DNA是
果树病毒基因组中最常用的测序 DNA模板[9]。
2.2 测序方法
2.2.1 随机测序 随机测序法包括鸟枪法与人工
转座子法。其共同特点是无特定方向性,而是随机
对靶 DNA进行测序,最后通过计算机拼装而得到
完整的序列信息。
2.2.1.1 鸟枪法 所谓鸟枪法,其基本过程是采用
一定的物理或化学方法虽随机的把待测 DNA序列
进行消化,使其切割成大小适于进行测序的随机片
段,然后将切割后的片段亚克隆到适合载体 (如
M13噬菌体),从载体制备测序模板,进行单套测
序,最后归纳个亚克隆测序的结果,用计算机进行
序列分析,得出完整的 DNA序列[10]。20世纪 80年
代初 Sanger成功地用鸟枪法完成了一种 λ噬菌体
的全基因组序列测定[10],之后该方法又被成功地应
用于更大一些的病毒 DNA[11]、细胞器 DNA[11,12]、以
及细菌基因组 DNA的序列测定[1]。基于鸟枪法的全
基因组测序策略主要有 2种[15]:(1)分级鸟枪法测
序,这种方法在对基因组较大的物种进行测序时有
着优势,有利于不同的实验室之间开展合作,在早
期的微生物全基因组测序中应用广泛;(2)全基因
组鸟枪法测序,这种方法的优点是省去了复杂的构
建物理图的过程。由于计算能力和拼接软件功能的
不断提高,用这种方法对微生物全基因组进行测序
已越来越普遍,甚至基因组较大的物种也使用这种
方法。鸟枪法的主要优点在于它的速度以及无须提
供相关的遗传图与物理图。经验证明,完成大小不
到 5M的任何一个生物基因组的测序,一年时间足
足有余.对于一些缺少重复顺序的小基因组而言,
鸟枪法不失为最佳的选择。其缺点是随机亚克隆易
造成重复测定和丢失一些序列[10]。目前,果树病毒
由于碱基数目相对较少,一般多采用鸟枪法进行全
赵英等:果树病毒基因组测序的研究 19
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第4期
长基因的测序。
2.2.1.2 人工转座子法 转座子是具有跳跃功能
的 DNA元件,它是细菌或酵母菌染色体上的特定
基因区,可编码特定蛋白,使转座子从自身染色体
上的某一区域转移到另一区域。转座子元件已被应
用于 DNA图谱和测序的有 Ty1,Tn5,Tn7,Tn10等,
以及其它衍生物[16,17]。转座子对目标 DNA插入有位
点的选择性,但人工合成转座子对于目标 DNA的
插入选择完全呈随机过程。人工合成转座子用于测
序有以下几个优点:①一次体外反应即可形成大量
转座子的插入,这些插入足可使 DNA测序更加便
利。②由于是人工合成的转座子,所以可以在其上
加入更利于 DNA制图和测序的基因元件。③因人
工转座子上两头带有特殊引物位点,所以插入位点
两侧序列可有效、迅速地得到确定。又由于可同时
测定一系列带有转座子的质粒,能同时平行得到大
量序列信息,较之引物法测序更加快捷和便利。
采用随机法,所要测定的序列通常会比靶
DNA的实际长度多 4~6倍。在大多数情况下,直至
双链 90%左右的序列测出后,才能得到单一的一
段邻接不断的序列。随机测序方法需用计算机进行
原始序列资料的分类、整理和排序,并由于测序的
重复性,对实验室的物力与人力亦有较大浪费。另
外,因为计算机无法对散在的重复序列进行排序,
如靶 DNA可能有散在的重复序列时,应尽量不用
鸟枪法进行测序。
2.2.2 定向测序法 定向测序法指特定地从目的
片段的某一端开始测序,直至将靶片段全部测完。
测序具有方向性,因而不会有大量重复测定的出
现,在果树病毒的测序中应用的较多。定向测序法
又可分为引物测序法和定向缺失法。主要包括以下
两种法。
2.2.2.1 引物测序法 引物测序法指在第一次测
序结果的基础上设计新的寡核苷酸,合成一段与其
互补的寡核苷酸作为下一步延伸的引物,并依次类
推,从而循序渐进地获得靶 DNA的全部序列。其优
点克服了鸟枪法的盲目性,并省去了亚克隆制备的
繁琐步骤[9],无需大量的重复测序,也不需随后的
计算机排序工作,能大大节约人力与物力。其限制
性在于:(1)如靶 DNA有散在的多重复序列,则不
宜使用引物测序法。因为设计的寡核苷酸引物可能
会在多个位点发生退火,导致测序失败;(2)多个寡
核苷酸引物的合成费用相当可观,为了保证寡核苷
酸引物与靶 DNA中的正确序列能够互补,每次设
计新的寡核苷酸引物时应尽量不要过于靠近上次
读序的末端,而这样势必导致需合成的寡核苷酸引
物数增加。(3)因为每次测序后需再次设计新的寡
核苷酸引物,引物合成需一段时间,所以会花费较
长的时间才能测定一段特定序列[18]。目前有人把此
方法进行改进,用人工合成的 6碱基随机引物来进
行测序[9]。
2.2.2.2 定向缺失法 定向缺失法是将一个靶
DNA变成若干套嵌套的缺失突变体,这些突变体
从靶 DNA一端或另一端渐进地缺失一定量的核苷
酸,使靶序列中远不可测的区段逐渐落入可用通用
引物进行测序的范围之中,即对靶 DNA的测序按
计划有秩序地进行。定向缺失法的缺点是有时需投
入大量的时间生成并鉴定一整套嵌套缺失体,但一
旦缺失体制备完成,则测序会大大简化。一般可通
过外切核酸酶Ⅲ法、BAL31核酸酶法、胰 DNA酶Ⅰ
法来获得缺失突变体[18]。
2.2.3 其它测序方法 自 1977年 Sanger创立了链
终止反应测序法以来,基因组测序技术得到了突飞
猛进的发展,1986年 Hood实验室的 Smith用四色
荧光标记的测序引物,单一泳道电泳,激光诱导荧
光法(LIF)进行测序,使测序方法由手工进入自动
化操作;Prober则是用荧光标记双脱氧核苷酸链终
止法进行测序的,这两种方法分别被 Perkin-Elmer
和 Dupont公司商品化为测序仪。荧光标记法是医
学和生物学检测领域中取得的重大突破,目前的
DNA测序方法多建立于其基础之上,荧光标记自
动化分析仪已成为 DNA测序技术进步最明显的标
志。近年来又有人研制了毛细管列阵电泳和 DNA
芯片,极大地提高了测序速度和效率;与此同时,质
谱技术与显微制造技术(microfabrication)的发展和
应用为 DNA分子的序列分析提供了又一种强有力
的工具。相信,随着分子生物学学科的交叉及测序
成本的降低,超薄凝胶板电泳(ultrathinslabgelelec
trophoresis)、毛细管电泳 (capilaryelectrophoresis,
CE)、八聚体测序技术(octamersequencingtechnology,
20
2008年第4期
OST)、转录测序(transcriptionalsequencing)、质辅助
激光解吸电离飞行时间质谱 (matrix-as-sistedlaser
desorption/ionizationtime-of-flightmassspectrometry,
MALDI-MS)、单分子测序技术(singlemoleculeseque
ncingtechnol2ogy,SMS)技术等[19],这些应用于人类
基因组测序的新方法必将以其快捷、高效的优势应
用于果树病毒基因组测序研究当中。
2.3 产物序列注释
所有测序工作完成后,应该进行基因组的注释
(Annotation)工作,找出所有的可能的基因,对它们
的功能进行预测,并可以在此基础上对果树病毒的
代谢途径、进化等等进行研究。应该说这是基因组
测序的目的。不过,由于前一阶段的测序工作是后
一阶段工作的前提,因此对这一阶段的战略问题进
行正确的决策,对降低研究费用和正确完成研究工
作是至关重要的[15]。注释工作包括:(1)碱基组成成
分分析。这是最基本的工作,也是最容易的工作。目
前有现成的软件来完成这种统计工作;(2)密码子
的偏嗜性(codonusagebias)分析;(3)开放阅读框
的鉴定。开放阅读框是基因组注释中一项重要的必
不可少的工作。可通过 NCBI网站中的 ORFfinger
等来完成;(4)移框检测和校正;(5)编码序列分
析;(6)基因检索;(7)基因鉴定;(8)重复序列、插
入序列等特殊元件的检索;(9)复制元点的鉴定;
(10)同源性基因检索。对于同源性检索一般可通过
核苷酸序列对比核苷酸序列检索和核苷酸序列对
比蛋白质序列两种方式查询;(11)垂直同源蛋白质
的聚类分析等[20]。
目前,在已发表的关于病毒基因组的文章中,
对于基因组的注释还只是“部分注释”或“相对注
释”,还有很多的意义没有能读懂。因此,对于一个
果树病毒基因组的“完全注释”绝不是一朝一夕的,
在目前阶段有些问题还是无法读懂的,它有赖于新
技术、新软件和新理论的出现才能解决。“完全注
释”也需要几代人的共同努力才能完成。
3 果树病毒基因组研究的展望
综观国内外对果树病毒病研究,其发展趋势是
在调查鉴定病毒种类的基础上,研究明确病毒病生
物学及理化特性,改进病毒检测方法,培育无毒母
本树,建立无病毒苗繁育体系,解决果树病毒病对
生产造成的危害。
随着分子生物学理论和技术方法对病毒学研
究的应用和渗透,近年来科研人员在病毒分子生物
学、病毒诊断和预防等方面取得了较大的进展,当
前病毒学研究的重点主要局限在‘病毒’这一单一
因素,集中表现在对病毒基因结构和功能进行分
析。病毒作为一种细胞内寄生物,病毒与宿主和机
体相互作用关系决定了病毒感染、复制和致病的分
子基础。由于病毒与宿主细胞和机体相互作用关系
的复杂性和多样性,传统的分子生物学方法很难对
这一问题进行深入、系统、全面的研究。因此,对于
病毒基因组进行有计划的大规模的测序及诠释将
有助于深入的研究病毒的致病机理。而果树病毒病
研究的发展是与植物病毒学的发展紧密相连的,同
时,由于果树为多年生木本植物,以无性繁殖为主,
其病毒病的发生有自身的特点。因此,果树病毒基
因组的研究在了解病毒基因的结构、功能,病毒基
因的致病性及病毒的准确分类等方面有着重要的
作用,其研究的应用前景也非常广阔。
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