全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第4期
收稿日期:2008-02-25
基金项目:农业部“引进国际先进农业科学技术”项目(2003-Q03),教育部长江学者和创新团队发展计划(IRTO453),四川省玉米生物技术
“十五”攻关项目
作者简介:杨爱国(1977-),男,博士,研究方向:作物遗传育种与分子生物学;E-mail:yag-100@163.com
通讯作者:赵琦,教授,博导,Tel:010-68901494,E-mail:zhaoqi@mail.cnu.edu.cn
改变植物的性状表现,转基因是最直接有效的手段。植物遗传转化方法有很多,其中农杆菌介导法由
于其可以转入的片段长、拷贝数少、遗传稳定性好等优点,长期以来一直是科学工作者重点采用的转基因
农杆菌介导玉米胚性愈伤的遗传转化研究
杨爱国 1,2 刘爽 3 赵琦 3 赵玉锦 1 张世煌 1 潘光堂 4
(1中国农业科学院作物科学研究所,北京 100081;2中国农业科学院烟草研究所,青岛 266101;3首都师范大学,北京 100037;
4四川农业大学玉米研究所,雅安 625014)
摘 要: 利用 3种不同类型的农杆菌菌株C58、LBA4404和 EHA105携带外源 GUS基因分别侵染玉米自交系齐
319和18(红)胚性愈伤。结果显示,不同的菌株和自交系间的搭配,其遗传转化效率差异很大,GUS瞬时表达率呈极显著
差异(F=24.92**),抗性愈伤率也呈极显著差异(F=19.43**)。其中,EHA105-齐319组合遗传转化效率最高,其GUS瞬时表
达率平均为55.5%,最高可达71.1%;其抗性愈伤率平均为14.4%,最高可达20%;对22株转基因T0代抗性植株进行 PCR
检测,其中PCR呈阳性植株有11株,阳性率为50%。进一步对此22株T0代抗性植株进行叶片组织化学染色分析,结果
显示,PCR呈阳性的植株中均有GUS基因表达。从而证明,外源GUS基因在转基因玉米T0代植株中得到稳定表达,而且
验证了PCR检测结果和GUS表达分析结果的一致性。
关键词: 农杆菌菌株 基因型 玉米愈伤 转化率
Agrobacteriumtumefaciens-mediatedTransformationofMaize
EmbryonicCali
YangAiguo1,2 LiuShuang3 ZhaoQi3 ZhaoYujin1 ZhangShihuang1 PanGuangtang4
(1InstituteofCropSciences,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100081;2InstituteofTobaccoSciences,
ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Qingdao266101;3CapitalNormalUniversity,Beijing100037;4MaizeResearch
Institute,SichuanAgriculturalUniversity,Yaan625014)
Abstract: ThreetypesofAgrobacterium strainsC58,LBA4404andEHA105containingstandardbinaryvector
pCAMBIA1301withGUSasreportergenewereusedtoinoculatemaizeembryoniccalioftwoeliteinbredlinesQi
319and18(red),respectively.TheresultsindicatedthatthetransformationeficienciesincludingeficienciesofGUS
transientexpresion(F=24.92**)andregeneratedresistantcali(F=19.43**)weresignificantdiferentbetweensixcombinations
ofbacteriastrainsandmaizeinbredlines.EHA105-Qi319wastheoptimizedcombinationfortransformation,andaverage
GUStransientexpresioneficiencywas55.5%,andsomeupto71.1%.Theeficiencyofaverageregeneratedresistantcali
was14.4%,andsomeupto20%.PCR analysiswasconductedwith22regeneratedresistantT0generationplantsandthe
eficiencyofpositiveplantswas50%.HistochemicalGUSasaywasconductedwiththoseresistantplants.Theresults
indicatedthatintensebluestainingwasobservedintheleavesofalPCR positiveplantsasexpected,andnoGUS
expresionwasobservedintheleavesofPCR negativeandwildtypemaizeplants.TheresultsprovedthatforeignGUS
genewasexpresedstablyintheT0 generationmaizeplantsandalsoconfirmedtheconsistencyofPCR analysiswith
histochemicalGUSasay.
Keywords: AgrobacteriumstrainsGenotype MaizecaliTransformationeficiency
2008年第4期
策略。目前,在双子叶植物中,农杆菌介导的遗传转化体系已趋于成熟。单子叶植物中,水稻的遗传转化体
系也被广泛应用,而作为三大粮食作物之一的玉米,虽然国外一系列转基因品种已经投入农业生产,转化
方法趋于成熟,但由于专利保护以及商业机密等因素,到目前为止,这些成熟的转化方法并没有引入我国
被广泛应用,在国内,农杆菌介导的遗传转化仍然十分困难。
目前,在比较成熟的玉米遗传转化体系中,受体材料多数采用幼胚,但实践证明作为转基因受体材料,
玉米幼胚需要在授粉后 10~15d,幼胚大小不超过 2.0mm时利用,超过这个时期,幼胚过大,转化效率则大
大降低;另外,玉米生育期长,在我国北方地区,幼胚的利用严重受季节性限制;而且,在温室种植的玉米受
温室效应影响导致其幼胚活力不如大田,从而影响其遗传转化效率。以上这些因素导致用幼胚作受体材料
受到很大程度限制。
利用从幼胚诱导的胚性愈伤作转基因受体材料则能避免上述因素的影响。首先,愈伤作受体材料受各
种外界环境因素影响较小;其次,一个幼胚通过继代足以产生大量的胚性愈伤,而且愈伤可以长期继代保
存,随时拿来作为转基因受体材料,这样既保证了充足的受体材料供给,又不受季节性限制;另外,目前玉
米胚性愈伤诱导及再生体系已非常成熟,玉米自交系齐 319和 18(红)胚性愈伤诱导率可达到 90%以上。
目前为止,用玉米胚性愈伤作受体材料的遗传转化方法,国内外均没有系统的研究与报导。因此,以玉米优
良自交系齐 319和 18(红)胚性愈伤作为遗传转化受体材料,着力建立和优化农杆菌介导的胚性愈伤的遗
传转化体系,为玉米的遗传转化创建新的更有效实用的方法,从而为基因工程改变玉米品质奠定基础。
1 材料与方法
1.1 玉米材料
玉米自交系 18-599(红)(简称 18红)胚性愈伤由四川农业大学玉米研究所提供;齐 319种子由本实验
室提供,春季田间播种,夏季取幼胚诱导胚性愈伤。
1.2 菌株及质粒
3种农杆菌菌株分别为章鱼碱型菌株 LBA4404、胭脂碱型菌株 C58和农杆碱型菌株 EHA105,均为植
物遗传转化研究中常用的农杆菌菌株。双元质粒载体 pCAMBIA1301以潮霉素为选择标记,GUS基因由
CaMV35S为启动子及 nos为终止子,GUS基因编码序列中包含一内含子,保证 GUS基因只在植物组织中表
达,而在细菌体内不表达,从而避免在组织化学分析中出现假阳性[1]。
1.3 培养基及成分
1.3.1 愈伤诱导及后期培养培养基成分(表 1)。
表 1 玉米愈伤诱导及后期培养培养成分
杨爱国等:农杆菌介导玉米胚性愈伤的遗传转化研究 105
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第4期
1.3.2 侵染过程中所用培养基成分 玉米胚性愈伤侵染液:液体继代培养基 (pH值 5.2)+乙酰丁香酮
(200μM)+Tween20(0.1%);
愈伤共培养培养基:固体继代培养基(pH值 5.8)+乙酰丁香酮(200μM)+AgNO3(0.85mg/L);
恢复培养基:固体继代培养基(pH值 5.8)+AgNO3(0.85mg/L)+羧苄青霉素(200mg/L)+头孢霉
素(400mg/L);
筛选培养基:固体继代培养基(pH值 5.8)+羧苄青霉素(200mg/L)+头孢霉素(400~500mg/L)+潮霉素。
1.4 转化方法
1.4.1 胚性愈伤的诱导及继代 取授粉后 11~13d的玉米果穗,剥去最外两层苞叶,用 70%乙醇喷洒苞叶
表面,然后剥去层层苞叶,当剩最后一层时,再用 70%乙醇喷洒苞叶表面,立刻将果穗转入超净工作台,去
掉苞叶和花丝,用解剖刀削去子粒顶部 2/3胚乳,用镊子从中上部挑出幼胚 (幼胚大小最适为 0.8~
2.0mm),盾片向上接种于含有固体诱导培养基的培养皿里,27℃暗培养。2周后,夹掉愈伤组织上长出的胚
芽、胚根。接种 4周后,淘汰严重褐变或水渍状、质地较软、无结构的愈伤,精细挑选长势好的Ⅱ型胚性愈
伤,即色泽鲜亮、致密颗粒状、干燥松散、有结构、生长旺盛的愈伤组织[2]于继代培养基上 27℃暗培养。随
后,每 2~3周将生长较好的愈伤转接到新的继代培养基中。通过继代以达到筛选、纯化和扩大繁殖胚性愈
伤组织的目的。大约 10~12周后,不断继代和扩繁的愈伤就可以用作遗传转化。
1.4.2 遗传转化
1.4.2.1 侵染液的准备 分别挑取 EHA105、LBA4404和 C58等 3个菌株(均含有双元载体 pCAMBIA1301)
单克隆,于 5ml液体 YEP培养基中(含有 100mg/L卡那霉素和 50mg/L利福平),28℃200r/min摇菌 48h。随
后,将 4ml菌液转移到含有 200ml液体 YEP培养基中(不含任何抗生素),28℃200r/min培养直到菌液浓度
OD600为 0.8。室温下 3000r/min离心 20min,收集菌体,然后用愈伤侵染液重悬菌体,调菌液浓度为 OD600为
0.5,随后侵染液于 28℃100r/min培养 30min,用以侵染玉米愈伤。
1.4.2.2 侵染 超净工作台中挑选供转化的玉米胚性愈伤,置于 100ml空三角瓶中,放置 1h左右(避免风
干)。将上述制备的侵染液倒入含有愈伤的三角瓶中,不时摇动浸泡 20min。随后倒去侵染液,用已灭菌的
吸水纸吸干愈伤表面菌液,将愈伤接种于垫有一张灭菌滤纸的共培养培养基上,22℃暗培养 5d。
1.4.2.3 抗性愈伤的筛选及植株再生 共培养过的愈伤用无菌水洗涤直到变清为止,再用含有头孢霉素
(400mg/L)的无菌水洗一次,无菌吸水纸吸干愈伤表面的液体后,将愈伤分为两部分,一部分用于 GUS瞬
时表达的组织化学分析;另一部分用作抗性筛选。
抗性筛选的愈伤接种于恢复培养基上 27℃暗培养 3d,再依次转到潮霉素浓度分别为 3mg/L、5mg/L和
10mg/L的筛选培养基上 27℃连续筛选 3轮,每轮 3周。筛选过后将抗性愈伤接种到固体继代培养基上,继
续 27℃暗培养,使愈伤繁殖增生 (如果愈伤块过小则不利于分化成苗),然后接种到含有潮霉素浓度为
10mg/L的分化培养基上,27℃光照培养。4周后,将抗性愈伤分化出的幼苗转到生根壮苗培养基上,27℃光
照培养。
当抗性苗长到大约 25cm并且具有 3条以上的新根时,打开封口膜,倒入少量无菌水以防止霉菌污染
和培养基失水,光照培养一周。随后将幼苗移栽到营养钵(珍珠岩/营养土=1/3,并灭菌)中,浇 1/10MS盐,
于温室中继续 27℃光照培养,2周后,将幼苗移栽至大田,精细管理。
1.5 转基因愈伤 GUS瞬时表达率分析
取共培养后并用无菌水清洗干净的愈伤,置于 50%X-gluc染色液中,37℃温浴 24h。统计愈伤 GUS瞬
时表达率,GUS瞬时表达率=GUS表达愈伤数(有蓝斑的愈伤)/总处理愈伤数。
1.6 转基因植株的 PCR检测
PCR检测引物为 5-TGGAGCATCAGGGCGG-3和 5-TTGCCAGAGGTGCGGATT-3(分别与 GUS基因的
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编码序列[3]互补),PCR反应程序为:94℃5min;94℃50s,62℃45s,72℃1min(每循环降低 0.5℃,共 34个循
环);94℃50s,45℃45s,72℃1min(共 20循环);72℃10min。
1.7 转基因植株叶片 GUS染色
取幼苗叶片,在 50%X-gluc染色液中浸泡 30min,37℃温浴过夜。将叶片转到 70%乙醇中脱色一次,随
后转到 95%乙醇中再脱色一次,直到阴性对照材料呈白色[4]。照相,白色背景下的蓝色小点为 GUS表达。
2 结果与分析
2.1 不同菌株及愈伤材料对玉米愈伤遗传转化效率的影响
农杆菌介导的植物遗传转化过程中,菌株类型和外植体材料起着关键性作用,不同菌株对同一植物材
料的遗传转化效率有很大差异;反之,同一菌株对不同基因型背景材料的转化效率也不尽相同。图 1和图
2结果显示,不同菌株和自交系间的搭配,其遗传转化效率差异很大,GUS表达率呈极显著差异 (F=
24.92**),抗性愈伤率(抗性愈伤数/抗性筛选愈伤总数)也呈极显著差异(F=19.43**)。4次重复实验结果证
明,EHA105-齐 319在 6个组合中转化效率最高,其 GUS表达率最高达到 71.1%,最低为 37.1%,平均为
55.5%;其抗性愈伤率最高为 20%,最低为 10.8%,平均为 14.4%。EHA105-18(红)组合次之,其 GUS表达率
最高达到 38.3%,最低为 21%,平均为 30.3%;其抗性愈伤率最高为 13.3%,最低为 5.5%,平均为 9.4%。
LBA4404-18(红)组合 GUS表达率最高达到 20.1%,最低为 14.3%,平均为 18.1%;其抗性愈伤率最高为
8.9%,最低为 6.0%,平均为 7.5%。LBA4404-齐 319组合 GUS表达率最高达到 15.4%,最低为 5.9%,平均为
10.4%;其抗性愈伤率最高为 7.5%,最低为 3.9%,平均为 5.8%。在本研究中,C58-齐 319和 C58-18(红)两
个组合的 GUS表达和抗性愈伤全部为 0,从而说明,农杆菌菌株 C58和本研究中的两个玉米自交系齐 319
及 18(红)之间确实不能形成有效侵染和转化关系。
图 1 不同菌株及自交系材料对玉米愈伤
遗传转化效率的影响
柱上垂直线表示对平均值的正负偏差:柱上字母表示不同组
合间的差异比较,用最小显著差数法计算而得,A、B和 C表
示差异极显著(p<0.01),a、b和 c表示差异显著(p<0.05)
图 2 不同菌株及自交系材料对玉米愈伤遗传
转化效率的影响
A,在共培养基上的胚性愈伤组织;B,EHA105-齐 319;C,
EHA105-18红;D,LBA4404-18红;E,LBA4404-齐 319;F,胚
性愈伤上 GUS表达状况
2.2 T0代转基因植株的 PCR检测及叶片的 GUS表达分析
对 22株 T0代抗性植株进行 PCR检测,结果显示,50%抗性植株检测结果呈阳性,图 3为部分植株的
PCR检测结果。与此同时,取抗性植株叶片进行 GUS基因表达分析。结果显示,PCR检测为阳性的植株叶
片中均有 GUS表达的蓝斑出现,而阴性植株叶片中无蓝色出现(图 3),从而证明外源 GUS基因在部分转
基因玉米 T0代植株中得到稳定表达,而且验证了 PCR检测结果和 GUS检测结果的一致性。
3 讨论
3.1 农杆菌菌株类型对遗传转化的影响
根据产生的冠瘿碱类型不同,可以将农杆菌菌株分成 3类:胭脂碱型(Nopaline)、章鱼碱型(Octopine)
杨爱国等:农杆菌介导玉米胚性愈伤的遗传转化研究 107
生物技术通报Biotechnology Bulletin2008年第4期
和农杆碱型 (Agropine)或称为琥珀碱型
(Succinamopine)。不同类型农杆菌染色体背
景不同,其表现特性以及对植物侵染能力也
不同。EHA105是 EHA101的衍生菌株,包含
EHA101中的卸甲载体 pTiBO542[5],在这个载
体中,包含 virA和 virG基因,virA可以直接
感应酚类物质诱导化合物,被称为感应蛋白
(senser)。活化的 VirA蛋白激活 virG基因产
生 DNA结合蛋白,这个蛋白可以激活其它
vir基因,vir基因活化的最终结果就导致了
T-DNA的加工和转移。因此 virA、G这种双因
子调控体系可以提高其菌体对外植体的侵染
能力[6]。
Hood等[5]曾报导在烟草转基因过程中 EHA105的侵染能力比来自胭脂碱型、章鱼碱型的菌株 MOG101、
MOG301侵染能力强。Rashid[7]和 Huang[8]分别用水稻和玉米幼胚为外植体得出类似的结论。利用 3种不同
类型菌株携带双元质粒载体 pCAMBIA1301侵染玉米胚性愈伤,结果证明农杆碱型菌株 EHA105对玉米愈
伤的侵染能力比胭脂碱型菌株 C58和章鱼碱型菌株 LBA4404强,与前人的研究结果一致。因此,在农杆菌
介导的玉米遗传转化过程中,以 EHA105为侵染菌株是非常必要的。
3.2玉米基因型对遗传转化的影响
不同基因型玉米受体材料对农杆菌的敏感性不同,从而影响农杆菌对玉米的附着,许多试验表明大多
数玉米基因型细胞表面缺乏可供农杆菌识别并与之附着的位点。杨剑波等[9]通过电镜观察发现附着在玉
米悬浮细胞上的农杆菌数量仅为对照胡萝卜的 8.4%左右。Schalappi等[10]通过农杆菌对玉米幼胚亲和性的
研究,证明感受态的细胞是农杆菌转化所必需的,只有那些再生和整合能力强的感受态细胞才能得到转化
植株,但大多数玉米基因型缺乏感受态的细胞。Ishida等[11]发现玉米不同基因型之间转化效率差异显著,而
HiⅡ[4,12~14]和 A188[15~18]被许多实验所证明,是农杆菌转化的理想受体。利用玉米自交系齐 319和 18(红)为
胚性愈伤的来源,研究了农杆菌对二者的转化效率,结果证明齐 319是个不错的农杆菌转化受体材料,这
一结果前人尚未报导过。
3.3玉米遗传转化过程中阳性转化细胞和再生植株的一致性
抗性筛选过程中,非转化细胞能否被筛选剂杀死与再生植株是否为假阳性密切相关。在筛选过程中,
造成假阳性的原因有:(1)外植体上非转化部位与选择培养基未充分接触,选择压不起作用,而且非转化部
位通过转化细胞得到营养,存活下来; (2)一部分外植体存在生理抗性较强的特性,选择压不够,未能导致
死亡。因此,在遗传转化过程中出现假阳性植株是不可避免的。
同时,转化细胞能否成长为再生植株也影响了最终的转化效率。在抗性筛选过程中,总有一部分转化
细胞最终无法形成抗性愈伤,进而形成再生植株。造成这种现象的原因有:(1)外植体上非转化细胞部位与
选择培养基接触,从而导致非转化细胞被筛选剂杀死,褐化,阻断了营养成分向转化细胞的输送; (2)农杆
菌、筛选剂和抑菌剂等对一部分生长势较弱的转化细胞造成伤害,导致其死亡。(3)后期组织培养过程中,
人为因素的影响,包括污染和愈伤筛选造成抗性细胞的丢失等情况。因此,在转化过程中,得到的抗性愈伤
率和抗性植株率均比 GUS瞬时表达率低,这是不可避免的,本研究结果也证实了这种现象。
参考 文献
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图 3 转基因玉米抗性植株的 PCR检测及 GUS表达分析
M,DNA标准分子量(DL2000);1~6,转基因抗性植株,其中 1、4和 5为
PCR呈阴性植株,2、3和 6为 PCR呈阳性植株; ;CK-,野生型植株;CK+,
阳性对照
(下转第121页)
108
2008年第4期
(上接第108页)
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去除。采用改良 CTAB法提取元宝枫基因组 DNA的过程中,使用酚类物质的结合剂 PVP,有效防止了多酚
物质氧化成醌类。PVP还能作为澄清剂吸附叶中元宝枫的多糖等杂质,使之沉淀去除;同时使用了适量浓
度的乙醇,可以在不影响 DNA产率的条件下有效地除去多糖等杂质。同时将加入 RNaseA消化 RNA的步
骤改在最后进行等一系列改进,可以获得高质量的 DNA。
采用改良 CTAB法提取元宝枫叶片 DNA,不仅操作过程简便,省时间,且提取效果非常理想,尤其在对
大群体样本 DNA进行提取时,该法优势更加明显。对元宝枫叶片 DNA的提取不仅为今后对元宝枫种质资
源研究和分子生物学方面的研究奠定了基础,而且对从彩叶植物以及富含色素、多糖、多酚类物质的植物
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