全 文 ：收稿日期:2007-12-25
基金项目:国家“863”计划项目(2006AA02Z153)
作者简介:周利苹(1982-),女,河南郑州人,硕士研究生,主要从事生物化学与分子生物学研究
E-mail:zlp998866@126.com
通讯作者:金坚(1960-),男,教授,博士生导师,从事细胞与分子药理学研究,Tel:(0510)85918219,E-mail:jinjian31@126.com
C肽(C-Peptide,CP)是胰岛素原分子中连接 A链和 B链的连接肽,有 31个氨基酸组成,分子量为
3.02kD,是胰岛素原转变成胰岛素过程中的裂解产物,与胰岛素等分子从胰岛 β细胞中分泌。CP最初被认
为是没有生物活性的,临床上仅被看作是判断胰岛 β细胞功能的指标。近些年来许多研究肯定了 CP具有
多种生物活性,用 CP对胰岛素依赖性病人进行替代治疗已有临床报道[1]。随着对糖尿病基础和临床研究
人血清白蛋白-C肽融合蛋白在毕赤酵母中的分泌表达
周利苹 张莲芬 雷楗勇 张文婷 蔡燕飞 金坚
(江南大学医药学院分子药理研究室 江南大学工业生物技术教育部重点实验室,无锡 214122)
摘 要: 目的 构建重组表达人血清白蛋白(HSA)-C肽(CP)融合蛋白的毕赤酵母表达菌株。方法 根据表达系
统的密码子偏好性优化 CP基因,酶切连接pBlue-HSA质粒(HSA1800bp)和CP(100bp)基因,将 HSA-CP融合基因双酶
切后插入分泌表达载体 pPIC9K中,重组质粒 pPIC9K-HSA-CP经 SalⅠ线性化后,电击转化毕赤酵母 GS115,表型筛选
Mut+转化子。PCR鉴定后,用甲醇诱导摇瓶分泌表达。结果 融合基因约为1900bp,序列测定正确。SDS-PAGE分析表
明表达融合蛋白的相对分子量约为70kD,摇瓶培养表达量为140mg/L,Westernblot鉴定显示表达的融合蛋白为HSA和
CP的杂合分子。结论 实现了HSA-CP融合蛋白在毕赤酵母中的分泌表达,细胞活性研究显示HSA-CP融合蛋白对人
胚肾293细胞的生长具有一定的促进作用。
关键词: C肽 人血清白蛋白 融合蛋白 毕赤酵母
SecretoryExpressionoftheFusionProteinHSA-CPin
PichiaPastoris
ZhouLiping ZhangLianfen LeiJianyong ZhangWenting CaiYanfeiJinJian
(LaboratoryofMolecularPharmacology,SchoolofMedicineandPharmaceutics,TheKeyLaboratoryofIndustrial
Biotechnology,MinistryofEducation,JiangnanUniversity,Wuxi214122)
Abstract: Purpose:TodevelopmenttherecombinantexpresionoffusionproteinHSA-CP,apotentiallong-acting
CPAnaloginPichiapastoris.Methods:InordertooptimizeHSA-CPproduction,thecodonusageofthegeneencoding
forCPwasoptimizedtoPichiapastoriscodonbiasandlowerrepetitiveATandGC content.Theoptimizedartificial
CPgenewasfusedtotheHSAcDNAinthesamereadingframe.ThenthefusiongeneHSA-CPwasclonedinto
PichiapastorisexpresionvectorpPIC9K.DigestedbyrestrictionenzymeSalI,therecombinantvectorpPIC9k-HSA-CP
wastransformedintoPichiapastorisstrainGS115byelectroporation.TheMut+ transformantswereselectedoutfrom
histidine-deficientmedium platesandscreeningforMutphenotype.ConfirmedintegrationbyPCR,therecombinant
strainswereinducedtoexpresfusionproteinHSA-CPbymethanol.Results:Theexpresedfusionproteinhasapparent
molecularweightof70kD observedbySDS-PAGE.Itwasspecificalyrecognizedbyananti-humanHSA polyclonal
antibodyandCPmonoclonalantibodyinWesternblotasay.Theyieldoftherecombinantstrainis140mg/Ldetermined
byC-peptideChemiluminescenceImmunoasaykitandMicroalbuminuriaImmunoasaykit.Conclusion:Thefusionprotein
HSA-CPwasexpresedsuccesfulyinPichiapastorisandcouldefecton293celproliferation.
Keywords: C-peptide Humanserumalbumin Fusionprotein Pichiapastoris
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第3期
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第3期
的深入,发现CP对于延缓糖尿病慢性并发症的发生有重要的作用。在1型糖尿病的治疗中,CP可以改善血管
微循环,缓解神经、心血管、肾脏病变及视网膜的损伤,提示CP有可能成为预防糖尿病慢性并发症的新药[2]。
由于 CP的分子量小和稳定性差,使得 CP的表达非常困难。目前解决此问题的方法主要有 2种,一是
采用融合蛋白的形式表达,一是表达多拷贝的短肽。CP作为潜在的多肽类药物,与其他多肽类药物一样存
在产品稳定性差,体内半衰期短,药物生物利用度低等问题,这也是 CP药物化亟待解决的重要问题。
采用融合蛋白的表达方式,融合载体人血清白蛋白(humanserumalbumin,HSA)是血浆中的主要蛋白
成分,在血浆中的浓度为 40mg/ml,血浆半衰期在 20d左右,在体内主要起维持血浆渗透压、作为内源性和
外源性物质载体等作用[3]。有研究发现 CP活性区域处于 C-端的五肽(EGSLQ),其中 27位 EGLU对于 CP
与其细胞膜受体的结合有重要作用[4]。采用基因工程手段将 HSA与密码子优化过的 CP进行无连接肽的融
合表达设计,将 HSA置于融合蛋白的 N-端,CP置于 C-端,构建 HSA-CP融合蛋白巴斯德毕赤酵母表达工
程菌,以期该融合蛋白既保持 CP的生物活性,又可达到延长其半衰期,提高稳定性和药物生物利用度的问
题。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 质粒、菌株、细胞株 毕赤酵母 PichiapastorisGS115(HIS+Mut+AOX1△∶ARG)和酵母分泌型表达质粒
pPIC9k购自 Invitrogen公司;质粒 T-CP由上海海毅生物技术有限公司合成,大肠杆菌 E.coliXL-1BLUE、含
有 HSA编码基因的质粒 pBlue-HSA由本实验室构建;人胚肾 293细胞株购自中科院细胞库。
1.1.2 工具酶和试剂 质粒小量抽提试剂盒和 DNA胶回收试剂盒为上海博大泰克公司产品。工具酶为
TaKaRa公司产品。酵母抽提物、蛋白胨和酵母氮基 YNB为上海生工产品。尿微量白蛋白检测试剂盒为上
海名典生物工程有限公司产品。HSA多克隆抗体购自成都生物制品所,CP抗体和 CP标准品购自晶美生物
公司。其余试剂均为分析纯试剂。
引物:
Pc15′ GAAACCCTAGGCTTAGAAGCTGAGGACTTGCAAGTTGGTC 3′
Pc25′ GTTGCGGCCGCTTATTGAAGAGAACCTTCCAAAGCCA 3′
Ph15′ TTACAGGTTACCTCCGAAACGATGCACACAAGAGTGAGGTT 3′
其中 Pc1下划线部分为 SaulⅠ酶切位点,Pc2下划线部分为 NotⅠ酶切位点,引物由上海生工生物技
术有限公司合成。Pc1和 Pc2用于扩增 CP基因,Ph1为 HSA上游引物,用于鉴定。
1.1.3 培养基 YPD培养基:1%酵母抽提物,2%胰蛋白胨,2%葡萄糖。BMGY培养基:1%酵母抽提物,2%
胰蛋白胨,1.34%YNB,0.00004%,生物素,1%甘油,100mmol/LpH6.0磷酸钾缓冲液。BMMY培养基:用 1%
甲醇取代上述的 1%甘油,其他类同于 BMGY培养基。
1.2 方法
1.2.1 HSA-CP融合基因的构建 以 Pc1和 Pc2为上下游引物从 T-CP质粒中扩增出 CP基因,用 SaulI和
NotI双酶切 CP基因和 pBlue-HSA质粒(HSA基因下游含有 SaulⅠ和 NotⅠ酶切位点),T4连接酶 16℃连接
过夜后转化大肠杆菌 XL-1BLUE。采用氨苄青霉素(100mg/L)筛选阳性重组子 XL-1/pBlue-HSA-CP,提取质
粒进行酶切,PCR鉴定并送上海生工进行测序分析。
1.2.2 表达载体 pPIC9K-HSA-CP的构建 EcoRI和 NotI分别双酶切重组质粒 pBlue-HSA-CP和表达载体
pPIC9K,凝胶电泳回收目的条带。按照参考文献[5]上的方法进行表达质粒 pPIC9K-HSA-CP的构建、转化和
阳性克隆的筛选。抽提重组质粒 DNA,进行电泳分析、酶切鉴定。
1.2.3 毕赤酵母 GS115的电击转化及筛选 将重组表达载体 pPIC9K-HSA-CP质粒用内切酶 SalI线性化
处理后,电击转化毕赤酵母 GS115。电击结束后立即加入 600μl1mol/L山梨醇,混匀后各取 200μl分别涂布
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于 3块含有 1mol/L山梨醇的 MD平板(1.34%YNB,4×10-5%生物素,2%葡萄糖,1.5%琼脂)上,30℃培养至菌
落出现。将 MD平板上长出的重组子分别用牙签点种于 MM(1.34%YNB,4×10-5%生物素,1%甲醇,1.5%琼
脂)和 MD平板,30℃培养 3~6d,观察在 MM平板上生长缓慢,而在 MD平板上生长较快的为 Mut+型重组子。
1.2.4重组毕赤酵母的 PCR鉴定 按参考文献[6]上的酵母染色体快速分离方法提取重组毕赤酵母 GS115/
pPIC9K-HSA-CP基因组 DNA。在 20μl的反应体系中加入:水 13.6μl,2.5mml的 dNTP 1.6μl,10×pfu Buffer
2μl,5U/μl pfu DNA聚合酶 0.6μl,10μM的引物 Ph1和 Pc2各 0.6μl,提取的染色体 DNA1μl。PCR条件为:
95℃充分变性 5min,94℃变性 1min,55℃退火 1min,72℃延伸 90s,30个循环。凝胶电泳检测 PCR产物。
1.2.5重组子 GS115/pPIC9K-HSA-CP的诱导表达与分析 将筛选得到的 Mut+重组子接种到 10ml BMGY
培养基的 50ml三角瓶中,30℃,250r/min培养至 A600nm值为 6左右,离心收集菌体。再加入 10ml BMMY培养
基,30℃,250r/min下继续诱导培养。每隔 24h补加一次甲醇同时取 100μl发酵样品,离心取上清,SDS-
PAGE检测融合蛋白 HSA-CP的表达情况。
1.2.6表达产物的 Western-blot鉴定 发酵上清液经 SDS-PAGE后,电转移蛋白至硝酸纤维素膜上。用含
50g/L脱脂奶粉的 1×TBS(10mmol/LTris-Cl,15mmol/LNaCl pH7.5)4℃封闭过夜,TBS清洗后分别加入兔抗
人 HSA的多克隆抗体(1∶100)和兔抗人 CP抗体(1∶100)为一抗,室温孵育 2h,TBS清洗后加入辣根过氧化
物酶标记的山羊抗兔的二抗(1∶5 000),室温孵育 2h,用 TBS清洗后加 DAB显色。
1.2.7 SRB法检测 CP的细胞活性 人胚肾 293细胞用含 10%小牛血清的 DMEM培养,培养条件为 5%
CO2,37℃。细胞按照 105个/ml铺在 96孔板内,100μl细胞悬液/孔。培养一天后,低血清饥饿培养 24h,实现
细胞生长的同步化。换含有不同浓度 CP标准品和 HSA-CP样品的 10%小牛血清的 DMEM细胞培养液
200μl/孔。对照组不加 CP和 HSA-CP,每个条件设置 4个重复。培养 48h后,吸去培养液,每孔加 100μl50%
三氯乙酸,静置 5min后移入 4℃冰箱静置 1h。用去离子水洗净后,每孔加 1%乙酸配制的 4%的 SRB100μl,
染色 30min后,倒掉染液。用 1%乙酸洗去未结合的染料,室温干燥后加入 pH10.5 Tris碱液 150μl,平板振
荡器上振荡 5min,酶标仪上测定各孔在 540nm处的吸光值。
2 结果
2.1 HSA-CP融合蛋白基因的构建及鉴定
CP基因的 PCR产物约 100bp用 SaulⅠ和 NotⅠ酶切后,同用 SaulI和 NotI酶切的 pBlue-HSA质粒
(HSA约 1.8kb)连接,得到含 HSA-CP融合基因的 pBlue-HSA-CP载体。载体经酶切和 PCR鉴定后,都在
1.9kb处有很亮条带。测序表明该条带即为 HSA基因和 CP基因的融合基因,且 HSA基因在融合基因的 5′
端,CP基因在融合基因的 3′端,与设计相一致,重组质粒 pBlue-HSA-CP的鉴定,如图 1和图 2。
图 1 重组质粒 pBlue-HSA-CP的 PCR鉴定
图 2 重组质粒 pBlue-HSA-CP的酶切鉴定1:DNA Marker 2000 2:用 Ph1和 Pc2从重组质粒 pBlue-HSA-CP中扩增的
HSA-CP基因 3:用 Pc1和 Pc2从 pBlue-HSA-CP扩增 CP基因 4:用 Ph1和
CP2从 pBlue-HSA中无扩增条带 5:用 Pc1和 Pc2从 pBlue-HSA中无扩增条带
1:DNA Marker (λDNA/HindIII/EcoRI)
2:EcoRI NotI消化的重组质粒 pBlue-HSA-CP
周利苹等:人血清白蛋白-C肽融合蛋白在毕赤酵母中的分泌表达 73
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第3期
2.2 表达载体的构建
重组表达载体 pPIC9K-HSA-CP物理图谱(图 3)。融合基
因利用 EcoRI和 NotI位点插入 pPIC9k载体,在序列上位于
AOX1启动子和 α交配因子的下游且与 α交配因子的开放阅
读框相同。构建的重组质粒 pPIC9K-HSA-CP鉴定如图 4,重
组质粒经 EcoRⅠ和 NotⅠ双酶切得到约 1.9kb左右的产物;
EcoRI、NotI单切均能得到约 11kbp的产物,表明融合基因已
成功插入表达载体 pPIC9k中。
2.3 毕赤酵母 GS115的电激转化及筛选
将 SalI线性化处理的重组质粒 pPIC9K/HSA-CP电激法转化毕赤酵母 GS115。转化条件为 1.5kV、
25μF、200Ω、时间常数 5ms。通过 MD平板和 MM平板筛选得到 Mut+型重组子,接种摇瓶培养,经尿微量白
蛋白检测试剂盒检测融合蛋白的最高表达量为 140mg/L,将此重组子命名为 rHC1。
2.4 重组毕赤酵母的 PCR鉴定
提取 MD平板上表达量较高的 3株重组子的基因组 DNA,以 Ph1和 Pc2为上下游引物扩增得到 1.9kb
的条带,如图 5,表明重组表达载体已成功整合入毕赤酵母基因组 DNA中。
图 3 重组质粒 pPIC9K-HSA-CP的物理图谱
图 4 重组质粒 pPIC9k-HSA-CP的限制性酶切分析
1:DNA Marker (λDNA/HindII/EcoRI) 2:EcoRI和 NotI双 酶 切 的
pPIC9k-HSA-CP 3:EcoRI酶 切 的 pPIC9k-HSA-CP 4:NotI酶 切 的
pPIC9k-HSA-CP 5:EcoRI和 NotI酶切的 pPIC9k
图 5 PCR验证 pPIC9K/HSA-CP转化 GS115
1:DNA Marker(λDNA/HindII/EcoRI)
2~5:挑取转化子的 PCR产物
2.5 融合蛋白 HSA-CP的诱导表达和 Westernblot鉴定
SDS-PAGE分析 rHC1菌不同诱导时间的发酵液,观察融合蛋白随时间的变化情况,如图 6。电泳条带
显示表达的融合蛋白的分子量为 70kD,与理论计算相符。从图中也看出随着时间的增加融合蛋白的表达量
略有增加,但诱导 24h后在 45000kD的地方有降解产物出现,降解情况随时间的延长逐渐增加。Western
blot分析结果如图 7显示,在 70kD的地方出现与 HSA和 CP抗体发生特异性反应的条带,表明表达的融合
蛋白具有 HSA和 CP的抗原性,为 HSA和 CP的杂合分子,与理论计算相符。发酵液经尿微量白蛋白检测试
剂盒检测融合蛋白的浓度为 140mg/L,表明融合蛋白在毕赤酵母中成功得到表达。
2.6 CP对 293细胞生长的影响
细胞同步化生长后,给予等摩尔的 CP和 HSA-CP样品在不同浓度(0.3,1,3,10,15,30,50,100,300nM)
下进行干预培养。与对照(不加 CP)相比,实验浓度的 CP和 HSA-CP均能刺激 293细胞的生长,CP标品在
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2008年第3期
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3nM浓度下能够最大程度的刺激 293细胞的生长,HSA-CP在 15nM浓度下能够最大程度的刺激 293细胞
的生长,结果如图 8所示。
图 6 rHC1菌不同诱导时间的表达情况 图 7 融合蛋白 HSA-CP的 Westernblot鉴定
1:低分子量蛋白质标准 2~6:诱导 24h,48h,72h,
96h,120h上清液
1:低分子量蛋白质标准 2,3:用 HSA抗体和 CP
抗体分析发酵液上清
图 8 CP对 293细胞生长的影响
3 讨论
CP在治疗糖尿病慢性并发症方面的作用已受到药
学界的关注。已有报道认为 CP的作用机制可能是与相
关细胞膜上 G蛋白耦联受体结合,使 Ca2+通道开放,激
活 Na+-K+-ATP酶活性和一氧化氮合酶的活性,促进排
钠保钾作用和改善细胞变形能力,扩展血管,增加血流
量,维持细胞正常形态及行使相应功能[7]。CP的体外药
效学活性显示,CP能够促进母神经瘤细胞 SH-SY5Y和
人胚肾 293细胞的生长,这可能与与 CP能够改善糖尿
病患者的神经及肾脏病变有关[8,9]。
CP的药物化研究的关键是之一是 CP大规模制备工艺的建立。目前针对基因工程菌 CP低表达量的问
题,多采用多聚体串联融合基因的构建形式。LIUHai-feng等合成 C肽三聚体基因,在大肠杆菌中融合蛋白
的表达量为 37.5mg/L,经蛋白酶处理后得到重组 CP单体[10]。采用白蛋白融合技术,实现了 HSA-CP融合蛋
白在毕赤酵母系统中的表达。巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)表达系统除了有原核细胞的生长快、操作简
单等特点和真核细胞的翻译后修饰加工系统外,还具有许多其它特性,如自身分泌的蛋白少、糖基化程度
适中、易进行高密度发酵和工业放大,因而被广泛地运用于外源基因的表达。迄今为止,已有数以百计的蛋
白在该系统中得到成功的表达,产量最高达 12g/L之多[11,12]。根据毕赤酵母的密码子偏好性对 CP基因进行
优化后直接与 HSA融合,表达产物的分子量与目标蛋白理论值相符,免疫化学分析其具有 CP和 HSA的
抗原性,说明产物是 HSA-CP融合蛋白。细胞活性显示,CP标准品和 HSA-CP样品均能在相对较低的浓度
范围内促进人胚肾 293细胞的生长,这可能与 CP能够改善糖尿病病人肾脏病变有一定的关系。HSA和 CP
定量分析摇瓶培养产物的表达量达到 140mg/L,但也存在目的蛋白的部分降解,且降解随诱导时间的增加
逐渐增加。有理由相信随着 HSA-CP融合蛋白发酵工艺和过程优化研究工作的深入,有望进一步大幅度提
高产率,解决 CP规模化制备的问题。
重组 CP和天然的 CP一样,由于不经过肝脏代谢而直接通过肾脏清除,半衰期仅为 30min,这也是 CP
药物化研究的瓶颈问题之一。如何提高产品的稳定性和生物利用度既是改善是 CP药学品质的关键,是目
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前重组蛋白类药物二次开发的共同内容。有报道采用白蛋白融合技术构建的 HSA和 hIFNα2b融合蛋白,
在猕猴血浆中的半衰期达 101h,约为普通 IFNα2b的 20倍[13]。而实验室构建的 GLP1-HSA融合蛋白,小鼠
体内药代动力学显示,其半衰期比单体提高了 660倍(数据尚未发表)。构建 HSA与药物蛋白的融合蛋白,
理论上既可提高药物蛋白的分子量防止 CP从肾脏快速清除,又可利用载体 HSA良好的组织相容性和融
合蛋白稳定性提高 CP的生物利用度。在 HSA和 CP之间不加任何连接肽,是为了避免连接肽易被水解和
免去尚存在争议的毒理学问题。有关 HSA-CP融合蛋白的生物利用度内容尚待今后的药代动力学试验来
证明。
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明,在 HBV感染过程中,前 S2可能起着非常重要的作用,阻断前 S2的作用将可能阻止 HBV的感染[10]。本
次试验研制出稳定分泌 HBV前 S2单克隆抗体细胞一株,这有利于进一步研究 HBV前 S2蛋白在乙肝病
毒入侵肝细胞中的作用以及慢性乙肝以及肝癌免疫治疗药物的研制。此外,研究证明,HBV前 S2蛋白在
机体内的存在是病毒复制及其具有传染性的新标志[11],其抗体的存在是急性患者病毒彻底清除、不具传染
性的标志[12]。目前检测 HBV前 S2的方法主要为酶联免疫吸附法(ELISA),此次研制的 HBV前 S2单克隆
抗体也可用于研发更加便捷的检测方法如金标试纸条法,使临床检测更加简便。
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