全 文 ：网络出版时间:2012 － 10 － 29 16:58 网络出版地址:http:/ /www． cnki． net /kcms /detail /34． 1086． R． 20121029． 1658． 033． html
◇实验方法学◇
光谱法研究野漆树苷与人血清蛋白的结合作用
邓少东，帅 欧，林 励，肖凤霞，卓嘉琳
(广州中医药大学中药学院，广东 广州 510006)
收稿日期:2012 － 06 － 29 修回日期:2012 － 08 － 07
基金项目:国家科技支撑计划项目(No 2011BAI01B02)
作者简介:邓少东(1986 －) ，男，博士生，研究方向:中药资源开发利
用与新药研究，E-mail:59543177@ qq． com;
林 励(1954 －) ，男，研究员，博士生导师，研究方向:中
药资源开发利用与新药研究，通讯作者，Tel:020-
39358270，E-mail:LL76611@ yahoo． com． cn
doi:10． 3969 / j． issn． 1001 － 1978． 2012． 11． 033
文献标志码:A 文章编号:1001 － 1978(2012)11 － 1620 － 04
中国图书分类号:R284. 1;R341. 21;R977. 6
摘要:目的 研究野漆树苷与人血清蛋白(HSA)的结合作用
及机制。方法 通过光谱法研究野漆树苷与 HSA 的作用机
制。以能量传递原理及 Lineweaver-Burk 双倒数方程计算野
漆树苷与 HSA 反应的结合常数和结合距离;以热力学参数
判断其与 HSA 间的作用力类型;以同步荧光光谱考察野漆
树苷对 HSA 构象的影响。结果 野漆树苷与 HSA 反应的
结合常数随温度的升高而降低;野漆树苷与 HSA 之间的结
合距离为 4. 16 nm;野漆树苷与 HSA的互相作用以氢键和范
德华力结合为主;酪氨酸残基和色氨酸残基的特征荧光光谱
峰随野漆树苷浓度的增加而产生猝灭。结论 野漆树苷能
与 HSA结合，其荧光猝灭以静态猝灭为主。
关键词:野漆树苷;人血清白蛋白;结合作用;荧光猝灭;热力
学参数;同步荧光光谱
血清蛋白(SA)是血液中重要的运输蛋白，药物进入机
体后首先与血清蛋白结合，通过血浆的存储和运输，到达受
体部位产生药理作用，是药物发挥药效的重要载体和靶分
子。SA在紫外光激发下，分子具有较强的内源荧光发射，也
可与多种内源和外源性物质结合而使其荧光光谱有所变
化［1］。探讨具有药理活性的小分子与 SA 的作用机制，对阐
明药物在体内的分布与代谢过程以及了解药物发挥药效的
作用机制有重要意义［2 － 3］。
野漆树苷为化橘红、山香圆叶等中药中的黄酮类活性成
分，具有抗炎、抗氧化、抗登革热及促进胰岛素受体磷酸化等
作用［4 － 6］。近年，关于野漆树苷的研究越来越多，已被收录
为 2010 年版中国药典一部山香圆叶及其制剂山香圆片的含
量测定用对照品［7］，但迄今未见野漆树苷与人血清蛋白
(HSA)之间相互作用的报道，为此作者开展了本项研究，以
期为野漆树苷在临床上合理应用提供理论参考。
1 材料
1． 1 仪器 F-2500 型荧光分光光度计(日本 HITACHI) ;
CARY-50 型紫外 － 可见分光光度计(美国 VARIAN) ;
BP211D型电子天平(德国 Sartorius 公司) ;DKB-501A 型超
级恒温水槽(上海森信实验仪器有限公司) ;Genpure 超纯水
系统(德国 TKA公司) ;PHB-3 型 PH计(上海三信仪表厂)。
1． 2 试药 野漆树苷(自制，纯度 99. 32%) ，精密称取适
量溶于 50%甲醇 /水中，配制成浓度为 2. 576 mmol·L －1的
溶液;Tris-盐酸缓冲液 (上海双螺旋生物科技，批号
K0810A) ，精密量取适量加入超纯水，稀释成 50 mmol·L －1
(pH 7. 4)的缓冲液;HSA(广州威佳科技，纯度 95%，批号
70024-90-7) ，精密称取适量用上述缓冲液配制成 0． 01036
mmol·L －1的溶液;实验用水均为超纯水。
2 方法
2． 1 光谱扫描 在 220 ～ 800 nm范围内，测定 HSA 溶液的
激发光谱和发射光谱，得 Ex = 280 nm，Em = 336 nm。在 5
ml具塞试管中，各加入 1． 9ml HSA 溶液，分别加入 0. 0、8. 0、
16. 0、24. 0、32. 0、40. 0、48. 0、56. 0、64. 0、72. 0、80. 0、88. 0、
96. 0 μl 的野漆树苷溶液，用移液枪加 Tris-盐酸缓冲液至
2. 00 ml，将温度分别调至 25℃、37℃，激发和发射光谱狭缝
宽度均为 5. 0 nm，进行荧光光谱扫描，记录野漆树苷对 HSA
的荧光猝灭光谱图，同时记录 Δλ = 15 nm 与 Δλ = 60 nm 的
同步荧光光谱;紫外 －可见分光光度计测定与 HSA 相同浓
度的野漆树苷在 290 ～ 500 nm范围内的紫外吸收光谱。
2． 2 猝灭机制确定及猝灭常数的计算 根据 Stern-Volmer
方程和 Lineweaver-Burk双倒数方程判断野漆树苷的荧光猝
灭机制［8］。
Stern-Volmer方程:
F0 /F = 1 + Kqτ0［Q］ = 1 + KSV［Q］ (1)
Lineweaver-Burk双倒数方程:
lg［(F0 － F)/F］ = lg Ka + n lg［Q］ (2)
式中 F0、F分别为未加和加入猝灭剂时 HSA 的荧光强
度。Kq 为双分子猝灭速率常数，［Q］为猝灭剂的浓度，τ0 为
不存在猝灭剂时荧光分子平均寿命(约为 10 －8 s) ，KSV为动
态猝灭常数，Ka 为静态猝灭常数，n为结合位点数。
2． 3 结合距离的测定 根据 Foster 能量转移原理［9］，当化
合物满足以下条件时会发生非辐射能量转移:供能体发射荧
光;供能体荧光发射光谱与受能体吸收光谱有足够的重叠;
供能体与受能体之间的结合距离不超过 7 nm。
能量转移效率 E 与结合距离 r 之间的关系:
·0261· 中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2012 Nov;28(11) :1620 ～ 3
E = R60 /(R
6
0 + r
6)= 1 － F /F0 (3)
R60 = 8. 8 × 10
－25K2N －4ΦJ (4)
E为能量转移效率，R0 为能量转移效率为 50%时的临
界距离，r 为供能体与受能体之间的距离，F 为 HSA 浓度与
药物浓度为 1 ∶ 1 时 HSA 的荧光强度，K2 为供能体 －受能
体偶极空间取向因子，N为介质的折射指数，Φ为 HSA的荧
光量子产率，J 为供能体的发射光谱与受能体的吸收光谱的
重叠积分。
J =(∑Fλελλ
4Δλ)/∑FλΔλ (5)
其中，Fλ 是供能体在波长 λ 处的荧光强度，ελ 是受能体
在波长 λ 处的摩尔吸光系数，Δλ 为计算时分割的波长跨
度。根据 HSA 荧光发射光谱与野漆树苷吸收光谱的叠加
图，把光谱重叠部分分割成很小的矩形，依据式(5)求得野
漆树苷与 HSA 的重叠积分，将 J 值及 K2、n、Ф 值代入式
(4) ，即可求出临界距离 R0，计算中 K
2、n、Ф 分别取 2 /3、
1. 336、0. 118。能量转移效率 E可由 E = 1 － F /F0 求出，最后
得出 HSA 与野漆树苷之间的结合距离。
2． 4 作用力类型的确定 有机小分子和 HSA 之间的结合
力主要包括氢键、范德华力、静电引力、疏水作用力等［10］。
根据反应前后热力学参数焓变(ΔH)和熵变(ΔS)的相对大
小，可以判断小分子与蛋白质间的主要作用力类型，ΔH ＞ 0、
ΔS ＞ 0 为典型的疏水作用力;ΔH ＜ 0、ΔS ＜ 0 为氢键和范德
华力;ΔH ＜0、ΔS ＞ 0 为静电作用力。根据热力学关系式，计
算野漆树苷与 HSA相互作用的热力学参数，从而判断作用
力类型。K1、K2 分别为在 T1、T2 温度下野漆树苷与 HSA 的
结合常数，R为气体常数约等于 8. 314。
lnK2 /K1 =(1 /T1 － 1 /T2)ΔH/R (6)
ΔG = ΔH － TΔS (7)
ΔG = － RT lnK (8)
2． 5 同步荧光光谱的测定 固定 HSA浓度为 1 × 10 －5 mol
· L －1，改变野漆树苷浓度测定△λ 分别为 15 nm 和 60 nm
的同步荧光光谱。
3 结果
3． 1 野漆树苷对 HSA 荧光光谱的影响 HSA 的荧光光谱
能反映 HSA 分子中氨基酸残基所处微环境及其分布情况、
蛋白质高级结构［11］。Fig 1 显示:随着加入野漆树苷浓度的
增加，336 nm 处 HSA的最大荧光发射峰逐渐降低。野漆树
苷仅引起 HSA 内在荧光有规律的猝灭，并未出现明显的发
射波长红移、蓝移或峰形改变。
3． 2 野漆树苷对 HSA 内在荧光猝灭的机制探讨 以 F0 /F
对［Q］作图(Fig 2)得 KSV与 Kq，以 lg［(F0 － F)/F］对 lg［Q］
作图(Fig 3) ，得出药物与 HSA的结合常数 Ka 和结合位点数
n。根据 KSV与 Ka 随温度的变化可以对猝灭机制进行判
断［12］。对于动态猝灭，温度升高有利于猝灭过程进行，KSV
随温度的升高而增大;而静态猝灭，温度升高形成的复合物
稳定性降低，Ka 随温度的升高而减小。由 Tab 1 发现，野漆
树苷的 Ka 都随温度升高而降低，Kq 值均远大于各类猝灭剂
对生物大分子的最大动态猝灭速率常数 2. 0 × 1010 L·mol －1
·s － 1［13］，表明野漆树苷对 HSA 的荧光猝灭作用主要是其
分子与 HSA的 Trp残基结合形成了某种特定结构的超分子
复合物所引起的静态猝灭。
Fig 1 Effect of rhoifolin on fluorescence spectra
of HSA at 37℃
CHSA≈1 × 10 －5 mol ·L －1 in all cases． Peak from up to down
Crhoifolin≈(0，1. 0，2. 0，3. 0，4. 0，5. 0，6. 0，7. 0，8. 0，9. 0，10. 0，11. 0，
12. 0)× 10 －5 mol·L －1
3． 3 野漆树苷与 HSA 的结合距离 根据 HSA 荧光发射光
谱与野漆树苷吸收光谱的叠加图(Fig 4) ，计算得出 HSA 与
野漆树苷之间的结合距离为 4. 16 nm，小于 7 nm。说明 HSA
(供能体)与野漆树苷(受能体)之间发生非辐射能量转移，
推测其对 HSA内在荧光的猝灭可能是通过分子间的能量转
移而引起的。
3． 4 野漆树苷与 HSA的作用力类型 根据热力学公式，计
算野漆树苷与 HSA 相互作用的热力学参数，见 Tab 2。由
Tab 2 可知，野漆树苷与 HSA的互相作用是氢键和范德华力
结合为主的自发过程。
3． 5 野漆树苷对 HSA 同步荧光光谱的影响 △λ = 15
nm 和 △λ = 60 nm 的同步荧光光谱分别显示酪氨酸残基和
色氨酸残基特征［14］。芳香氨基酸残基的最大发射波长与其
所处环境极性有关，由发射波长的改变可判断 HSA 中芳香
氨基酸残基所处微环境的变化。最大发射波长红移，表明芳
香氨基酸残基所处微环境的疏水性降低，极性增强;蓝移则
表明微环境的疏水性增强，极性降低。
Tab 1 Fitting parameters of the interaction between HSA and rhoifolin at different temperature
T /℃
Stern-Volmer
Kq /(L·mol － 1·s － 1) Ksv /(L·mol － 1) R
Lineweaver-Burk
Ka /(L·mol － 1) R n
rhoifolin
25 6． 14 × 1011 6． 14 × 103 0． 9904 1． 31 × 105 0． 9886 1． 33
37 4． 44 × 1011 4． 44 × 103 0． 9882 7． 41 × 104 0． 9900 0． 52
·1261·中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2012 Nov;28(11)
同步荧光光谱(Fig 5)测定结果表明酪氨酸残基和色氨
酸残基的特征荧光光谱峰均随野漆树苷浓度的增加而产生
猝灭，野漆树苷的色氨酸残基和酪氨酸残基光谱最大发射波
长基本没变，表明对应的 HSA 中色氨酸残基和酪氨酸残基
附近的微环境并未改变。
Fig 2 Stern-Volmer plots of the interaction between
HSA and rhoifolin
Fig 3 Lineweaver-Burk plots of the interaction between
HSA and rhoifolin
Fig 4 Overlap of absorption of rhoifolin with HSA
fluorescence spectra
CHSA≈Crhoifolin≈1 × 10 －5 mol ·L －1
Tab 2 Thermodynamic parameters of interaction
between HSA and rhoifolin
T /℃
△H/(KJ·
mol － 1)
△S /(KJ·
mol － 1·K －1)
△G /(KJ·
mol － 1)
rhoifolin
25
－ 478． 60
－ 1． 51 － 29． 19
37 － 1． 51 － 11． 10
Fig 5 Synchronous fluorescence spectra of
interaction between HSA and rhoifolin
4 讨论
本实验采用光谱法研究了模拟生理条件下野漆树苷与
HSA 的相互作用。结果表明，静态猝灭是导致野漆树苷对
HSA荧光猝灭的主要原因，两者互相作用以氢键和范德华力
结合为主。与 HSA 的结合距离表明了 HSA(供能体)与野漆
树苷(受能体)之间可发生非辐射能量转移，它们对 HSA 内
在荧光的猝灭可能是通过分子间的能量转移而引起的。
野漆树苷与 HSA 的同步荧光实验表明:野漆树苷的色
氨酸残基和酪氨酸残基光谱最大发射波长基本没变，推测是
由于它们的结合常数较小，不利于与ⅡA 区域结合，从而未
使蛋白质中色氨酸残基和酪氨酸残基的构象发生变化。随
着野漆树苷的加入发现色氨酸残基荧光猝灭程度比酪氨酸
残基荧光猝灭程度更为明显，表明 HSA 的荧光主要由色氨
酸残基所贡献，野漆树苷与 HSA 结合位点更接近于色氨酸
残基。
·2261· 中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2012 Nov;28(11)
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Study on the interaction of rhoifolin with human serum
albumin by spectroscopy
DENG Shao-dong，SHUAI Ou，LIN Li，XIAO Feng-xia，ZHUO Jia-lin
(School of Chinese Herbal Medicine，Guangzhou University of TCM，Guangzhou 510006，China)
Abstract:Aim To study the interaction of rhoifolin with human
serum albumin (HSA) and its mechanism． Methods The
binding reactions of rhoifolin with HSA were studied by spectros-
copy． The binding constants and binding distances were calcu-
lated according to Lineweaver-Burk equation and Fster’energy
transfer theory． Thermodynamic parameters were used to calcu-
late the types of interaction force between HSA with rhoifolin and
the technique of synchronous fluorescence spectra was used to
observe the effects of rhoifolin on the conformation of HSA． Re-
sults The binding constants of rhoifolin decreased with the in-
creasing of temperature． The binding distances of rhoifolin with
HSA were 4. 16 nm． Rhoifolin could interact with HSA through
hydrogen bond and Vander Waals’force． Fluorescence spectra of
tyrosine residue and tryptophan residue decreased with the in-
creasing concentration of rhoifolin． Conclusions Rhoifolin can
combine with HSA． It is proved that the mechanism of fluores-
cence quenching of HSA by rhoifolin mainly lies in static
quenching．
Key words:rhoifolin;human serum albumin;binding reaction;
fluorescence quenching;thermodynamic parameters;synchronous
fluorescence spectra
·3261·中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2012 Nov;28(11)