全 文 ：脂复合物后,可改善药物的溶解性,本实验结果表明
淫羊藿苷元磷脂复合物, 更大程度地提高了药物的
水溶性。将淫羊藿苷元制成磷脂复合物后药物在水
中的平衡溶解度提高了 5 9倍, 在正辛醇中的平衡
溶解度提高了 1 6倍。
淫羊藿苷元为一种难溶性化合物, 本实验曾采
用水,人工胃液、人工肠液及它们的表面活性剂溶液
做为释放介质, 结果表明药物在这些介质中只能以
混悬液的形式存在,释放的药物不能被接受介质充
分溶解,表明药物在上述释放介质不能达到漏槽条
件,而在体内溶解的药物会不断地被带走,不断地被
吸收,因此所选择的溶出介质应模拟体内的漏槽状
态。为达到溶出所需要的漏槽状态,本实验采用了
含 30%乙醇的 pH 6 8的 PBS 溶液作为释放介质。
将淫羊藿苷元磷脂复合物与 PVP 制成共沉淀
物,既可降低黏性增加物料的流动性,以利于剂量的
准确性,又可加速药物的溶出。淫羊藿苷元磷脂复
合物是淫羊藿苷元与磷脂之间以弱键作用形成的一
种复合物,实验曾将淫羊藿苷元磷脂复合物用无水
乙醇复溶, 减压回收无水乙醇后所得固体经 IR、
DSC、PNMR鉴定,产物仍为复合物, 表明乙醇不会
破坏淫羊藿苷元与磷脂之间的弱键作用, 但高分子
材料 PVP 可能会破坏药物与磷脂之间的这种弱键
作用,因此, 形成共沉淀后,淫羊藿苷元与磷脂之间
是否以复合物的形式存在, 有待进一步确认。制备
淫羊藿苷元磷脂复合物旨在增加药物的渗透性, 以
提高其生物利用度, 而制备淫羊藿苷元磷脂复合物
与 PVP 共沉淀物目的是为增加复合物的溶出, 因此
复合物及其共沉淀物的渗透性差异有待进一步研
究,以确认制备共沉淀物的合理性。
参考文献:
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荧光猝灭法研究马钱子碱、士的宁与人血清白蛋白的相互作用
童 俊,韩凤梅,陈 勇*
(湖北大学 中药生物技术省重点实验室,湖北 武汉 430062)
摘 要:目的 研究马钱子碱、士的宁与人血清白蛋白( HSA )间非共价结合特性。方法 采用荧光猝灭法计算药
物与蛋白间的结合常数与结合位点数;根据不同作用温度时药物蛋白非共价结合复合物的热力学参数变化,分析
药物与蛋白间的主要作用力类型。结果 当作用温度分别为 25 和 35 时, 马钱子碱与 HSA 的结合常数( K )
分别为 2 12 104 L/ mol和 1 97 104 L / mo l, 结合位点数( n)分别为 1 07 和 1 07; 士的宁与 H SA 的 K 分别为
6 34 103 L / mol和 3 05 103 L/ mol, n 分别为 1 01、0 97。马钱子碱、士的宁与 HSA 间的作用力主要为氢键和
范德华力。结论 马钱子碱、士的宁与 HSA 能自发形成不发荧光的复合物, 这种药物蛋白结合可能对马钱子碱、
士的宁的药动学过程产生一定影响。
关键词:马钱子碱; 士的宁;人血清白蛋白; 荧光猝灭
中图分类号: R286 02 文献标识码: A 文章编号: 02532670( 2010) 09145304
Interactions between brucine, strychnine and human serum albumin
by using fluorescence quenching method
TONG Jun, HA N Fengmei, CHEN Yong
( Pr ovincial Key Labo rato ry of BioTechno lo gy of Chinese Mater ia Medica, H ubei Univ ersit y, Wuhan 430062, China)
Abstract: Objective T o invest igate the ef fects o f both brucine and st rychnine on human serum albu
min ( HSA) Methods T he binding constant K and the binding sites v alue ( n) betw een drug and pr otein
!1453!中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 9 期 2010 年 9 月
* 收稿日期: 20100317 基金项目:国家自然科学基金资助项目( 30630075)作者简介:童 俊( 1986 ∀ ) ,女,湖北钟祥人,湖北大学生命科学学院在读研究生,研究方向为药动学。
T el : 13036160724 Email: t j196318@ 163 com
* 通讯作者 陈 勇 T el/ Fax: ( 027) 88663590 Em ail: cy101610@ npc gov cn
were got ten by f luo rescence quenching method: and depending on the changes o f thermodynamic parame
ters about the drugpro tein complex under dif ferent temperatures, the main binding fo rces could be ob
tained betw een these tw o medicines and HSA Results When the temperatures w ere 25 and 35 , the
binding constant K betw een brucine and HSA were 2 12 104 and 1 97 104 L/ mo l w ith the binding sites
value ( n) o f 1 07 and 1 07, respect ively To st rychnine and HSA , the binding constant K at different
temperatures w ere 6 34 103 and 3 05 103 L/ mol The n were 1 01 and 0 97 Conclusion Brucine,
st rychnine and HSA can be combined compound which have no f luorescence, and the drugprotein binding
may have some impact on the pharmacokinetics of brucine and st ry chnine
Key words: brucine; st ry chnine; human serum albumin ( HSA) ; f luo rescence quenching
血清白蛋白( HSA)是生命体血浆中最丰富的
蛋白质,具有贮运内源代谢物和外源小分子药物等
重要生理功能, 研究 HSA 与药物的结合作用对阐
明药物动力学及药效学有重要意义 [ 1]。马钱子碱和
士的宁是马钱子 Str y chos nuxvomica L 的主要药
效与毒性成分, 属吲哚类生物碱,具有兴奋中枢神经
的作用,临床上主要用于治疗风寒湿痹、麻木瘫痪、
跌打损伤、类风湿关节炎等疾病[ 23]。但由于其有效
剂量与中毒剂量非常接近, 临床使用时易发生中毒
事件。因此, 阐明马钱子碱和士的宁与 HSA 间的
结合作用特性对马钱子及其复方的临床安全用药具
有十分积极的指导作用。笔者采用液相色谱质谱
法分析了东莨菪碱和山莨菪碱的代谢情况[ 46] ,并考
察了射干苷与血浆蛋白的结合 [ 7]。本实验应用荧光
猝灭法研究了马钱子碱和士的宁与 H SA 间的非共
价结合作用特性。
1 仪器和材料
RF ∀ 450型荧光光度计 (带恒温装置, 日本岛
津公司) ,马钱子碱( Fluka 公司) , 士的宁( Sigma 公
司) , 人血清白蛋白( H SA, 武汉生物制品所提供) ,
pH 7 4 T risHCl缓冲液, 二次重蒸水, 其他试剂为
国产分析纯; 3 0 mmo l/ L 马钱子碱、士的宁水溶液
储备液, 10 mol/ L H SA 水溶液储备液。
2 方法与结果
2 1 发射光谱的测定: 于 10 0 mL 刻度比色管中
依次加人 2 0 mL 0 5 mol/ L NaCl溶液, 2 0 mL
pH 7 4 TrisHCl 缓冲溶液, 2 0 mL 10 mol/ L
HSA 储备液,用水定容至 10 0 mL, 摇匀并在 37
恒温水浴预热 10 m in。取该溶液 3 0 mL 于 4 5
mL 荧光池中, 以 286 nm 为激发波长, 在 300~ 400
nm 扫描荧光发射光谱(波长狭缝宽度 10 nm )。用
移液枪分别加入 10 L 不同浓度马钱子碱溶液, 摇
匀并作用 3 min 后, 在上述条件下测量混合液的发
射光谱。同上法测定士的宁的荧光发射光谱。
2 2 HSA 的荧光猝灭光谱: 选用了 25、35 两个
蛋白药物作用温度。在本实验条件下,马钱子碱、士
的宁溶液荧光强度很弱, 对 HSA 的荧光发射光谱
无影响。作用温度为 25 时 HSA 与不同量马钱
子碱和士的宁相互作用时的荧光发射光谱图见图
1, 其发光特征是由于 H SA 的 214 位色氨酸残基的
发光所致[ 8] 。结果表明, 固定 HSA 的作用浓度 2
mo l/ L ,随着作用药物浓度的不断增加, 虽然 HSA
的荧光发射光谱的峰位和峰形不变, 但 HSA 的内
源荧光强度均呈现有规律的降低, 说明它们之间形
成了复合物。
A 10 210 mol/ L 320 mol/ L 430 mol/ L
540 m ol/ L 650 m ol / L 760 mol/ L
B 10 220 mol/ L 340 mol/ L 460 mol/ L
580 m ol / L 6100 mol/ L 7120 mol/ L
图 1 马钱子碱( A)和士的宁(B)对 HSA荧光发射光谱的
影响
Fig 1 Ef fect of brucine ( A) and strychnine (B)
on fluorescence emission spectra of HAS
2 3 马钱子碱、士的宁对 HSA 荧光的猝灭机制:
引起蛋白荧光猝灭的原因有动态和(或)静态猝灭。
动态猝灭是一种电子或能量的转移过程, 不影响蛋
白质的二级结构和生理活性;静态猝灭通常是生成
了不发荧光的配合物, 且对蛋白质的二级结构和生
理活性有影响。荧光动态猝灭符合 SternVo lmer
曲线方程[ 8]。
F0 / F= 1+ K q0 [Q] = 1+ K sv [ Q] ( 1)
式中, F0 是猝灭剂不存在时的荧光强度, F 为加入猝灭剂后
的荧光强度, K sv ( L / mo l)为动态猝灭过程速率常数, 它表示
!1454! 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 9 期 2010 年 9 月
生物大分子与荧光猝灭剂彼此扩散和碰撞达到动态平衡时
的量效关系; K q( mo l! L- 1 ! s- 1 )为双分子表观猝灭常数,
它反映了体系中分子的彼此扩散和相互碰撞对生物大分子
荧光寿命衰减速率的影响。[ Q]为猝灭剂浓度。0 为猝灭
剂不存在时荧光分子的平均寿命(约为 1 10- 8 s)
根据( 1)式, 把 F0 / F 分别对所加入的马钱子
碱、士的宁的总浓度[ Q ]作图, 得到它们对 HSA 荧
光的 SternVolmer 猝灭曲线,见图 2。
图 2 马钱子碱( A)和士的宁( B)对 HSA荧光猝灭
StermVolmer图
Fig 2 StermVolmer curves of fluoresence quenching
HSA by brucine (A) and strychnine ( B)
可见 F0 / F随马钱子碱、士的宁浓度[ Q]的增加
呈线性增大。通过计算可知, 作用温度为 25、35
时,马钱子碱的荧光猝灭 K sv分别为 11 480、10 310
L/ mol, 士的宁的荧光猝灭 K sv分别为6 130、4 140
L/ mol 。由于生物大分子的最大动态 K sv < 100
L/ mol[ 9] ,而通过 SternV olmer 曲线方程求得的
HSA 分别与马钱子碱和士的宁非共价结合的猝灭
过程速率常数比最大动态猝灭过程速率常数大几个
数量级,说明马钱子碱和士的宁对 HSA 内源性荧
光的猝灭过程不是由扩散控的动态猝灭过程, 而可
能是静态猝灭过程。另外, 动态猝灭和静态猝灭可
依据不同温度条件下的结果加以区别。对于动态猝
灭,温度的升高将增加有效碰撞和加剧电子转移过
程,使猝灭常数随温度的升高而增大; 若是静态猝
灭,温度的升高将降低配合物的稳定性,使猝灭常数
减小[ 10] 。马钱子碱、士的宁的荧光猝灭 K sv随着温
度的升高而降低,说明动态碰撞不是马钱子碱、士的
宁引起 HSA 荧光猝灭的主要原因。
2 4 荧光给体受体间平衡常数和结合位点数: 对
于静态猝灭过程, 荧光强度与猝灭剂的关系可由荧
光分子与猝灭剂分子间的结合常数表达式推导求
出。设生物大分子有 n个相同且独立的结合位点,
则其与小分子间的猝灭反应可表示为 [ 11] : n[ Q] +
B QnB ,结合常数 K 可表示为:
K = [ Q nB ] / [ Q] n [ B] (2)
式中[ B ]是游离荧光体浓度, [ Q]是猝灭剂浓
度, [ QnB ]是配合物浓度。
若荧光体总浓度为 [ B 0 ] , 则 [ B0 ] = [ Q nB ] +
[ B ] ,当[ Q] #[ B 0 ]时, 可以猝灭剂的起始浓度代替
其平衡浓度,则:
K = ( [ B0 ] - [ B] ) / [ Q] n [ B ] (3)
[ B ] / [ B0 ] = F / F0 (4)
在静态猝灭中,体系的荧光强度 F 与其游离浓
度成正比(所生成的配合物是非荧光性的)。
由(3)和(4)式得
lg [ ( F0- F) / F] = lgK + nlg[ Q] (5)
根据( 5)式处理图2数据作图 3,得到线性回归方程:
作用温度为 25 时, lg [ ( F0 - F) / F] = 1067 5
lg [ Q] + 4 327 1, r 2= 0 999 2 ( 6)
作用温度为 35 时, lg [ ( F0 - F) / F] = 1 071 4
lg [ Q] + 4 295 1, r 2= 0 998 7 ( 7)
根据( 6)和( 7)式可计算出作用温度为 25、35
时,马钱子碱与 HSA的结合常数( K )和结合位点数
( n) 分别为 2 12 104 L/ mol、1 07 和 1 97 104
L/ mol、1 07。根据( 5)式处理图 2数据作图 3, 得到
线性回归方程:
作用温度为 25 时, lg [ ( F0 - F) / F] = 1 011 2
lg [ Q] + 3 802 3 r 2= 0 990 8 ( 8)
作用温度为 35 时, lg [ ( F0 - F) / F] = 0 967 5
lg[ Q] + 3 483 6 r2= 0 997 2 ( 9)
根据( 8)和( 9)式可计算出作用温度为 25、35
时,士的宁与HSA的结合常数K 和结合位点数n分别
为 6 34 103 L/ mol、101和 3 05 103 L/ mol、097。
2 5 荧光给体受体间作用力的确定:有机小分子与
蛋白质相互结合的主要部位是蛋白质上的碱性氨基
酸残基,如精氨酸、赖氨酸、组氨酸残基和 N 端氨基
等。相互作用力有氢键作用力、静电作用力、疏水作
用和范德华力等。Otagiri 总结出判断生物大分子与
小分子结合性质的热力学规律[ 12] ,即 S> 0为疏水
和静电作用力; S < 0为氢键和范德华力; H > 0、
S> 0为典型的疏水作用力; H < 0、 S< 0为氢键
和范德华力; H < 0、 S > 0为静电作用力。通过改
!1455!中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 9 期 2010 年 9 月
图 3 不同温度下马钱子碱( A)和士的宁( B)对 HSA荧
光猝灭作用的双对数图
Fig 3 Doublelg plot of brucine ( A) and strychnine ( B)
quenching effect on HSA fluorescence
at different temperatures
变反应作用温度,经(10)和( 11)式:
lnK 2 / K 1= ∃H (1/ T 1- 1/ T 2) / R (10)
∃G= ∃H - T ∃S = - RT lnK (11)
可计算温度变化时药物蛋白结合的 ∃H 和
∃S。式中, T 1 和 T 2 分别为 25 和 35 的绝对
温度, K 1和 K 2 为与之对应的结合常数。对于马钱
子碱计算结果为: ∃H = - 5 630 15 J/ mol,
∃S= - 1 91 104 J/ ( mo l ! K ) ; 士的宁计算结果
为: ∃H = - 5 60 105 J/ mol, ∃S = - 115 20
J/ ( mol ! K)。可见马钱子碱和士的宁与 HSA 之间
的作用力主要为氢键和范德华力。从热力学角度来
看,在一定温度和压力下,药物与蛋白的结合反应能
否自发进行取决于∃G, ∃G< 0时有利于反应自发进
行。马钱子碱、士的宁与HSA结合反应的 ∃G分别
为- 24 68533、- 21 696 4 J/ mol,因此马钱子碱和士
的宁与 HSA之间的结合反应是自发进行的。
3 讨论
HSA中由于色氨酸、酪氨酸等氨基酸残基的存
在而具有内源荧光, 马钱子碱和士的宁本身在扫描
范围内无荧光, 但在与 H SA 相互作用的过程中能
不同程度地猝灭 HSA 的荧光。本研究表明, 马钱
子碱和士的宁对 HSA 的荧光猝灭机制均属于静态
猝灭,即马钱子碱和士的宁与 HSA 之间自发形成
不发荧光复合物时,出现了无辐射能量转移,产生了
荧光体的静态猝灭, 且它们之间的作用力主要为氢
键和范德华力。
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