全 文 ：中革喃ChlDeSeTraditionalandHerbalDrugs第38卷第lo期2,007年10月·1473·
·制剂与质量·
电喷雾离子阱质谱法研究射干苷与血浆蛋白的非共价结合
营 娃，韩风梅，阵 勇。
(湖北大学中药生物技术省重点实验室，潮北武汉430062)
捕要；目的研究射干苷与血浆蛋白的非共价结合特性。方法采用电喷雾离子阱质谱分别测定射干苷、人血清
白蛋白问一酸性糖蛋白及其所形成复合物的相对分子质量。通过结合前后的相对分子质量的变化计算复合物最大
化学计量比；通过Scatchard方程拟合计算复台物结合常数K，根据反应温度和热力学常数△Ⅳ、AS推测复合物
问的作用力类型。结果射干苷与人血清白蛋白A一酸性糖蛋白形成的非共价复合物K分别为1．914×104mol／L
和5．893X10‘mol／L，结台倍数分别为7．8和3．3复合物问的作用力主要为静电引力。结论电喷雾离子阱质谱法
应用于射干苷与蛋白质结合的研究具有灵镀度高，特异性强、分析迅速等优点。
关键词；射干苷}人血清白蛋白}a，一酸性糖蛋白；电喷雾离子阱质谱
中图分类号：R285．6fR286．02 文赫标识码：A 文章编号：0253—2670(2007)10—1473—04
Non—covalentbindingbetweentectoridinandplasmaproteinsbyelectrospray
iontrapmassspectrometry
CAoYi，HANFeng—mei，CHENYong
(HuheiProvinclalKeyLaboratoryfBio—TechnologyofTrad：tionalChineseMedicine·
HubeiUniversity，Wuhan430062，China)
Abstract：ObjectiveTostudythnon—covalentbindingbetweenthetectoridln(TE)andplasmapro—
teins．MethodsThemolecularweightsofTE．humanserumalbumin(HSA)，a1-acidglycoprotein
(AAG)andtheprotein—drugcomplexesweremeasuredbythelectrosprayiontrapmassspectrometry
(ESI—MS)．Themaximumstoiehiometrieratioswereobtainedaccordingtothemolecularweightchangeof
thecomplexesbeforeandafterbindingreaction．Thebindingconstants(K)ofthecomplexeswereealcu-
latedbytheScatehardequation．Themainsortsofbindingforceofthecomplexeswerededucedaccording
totherelationshipbetweenthereactiontemperaturendththermodynamicparameters(△Hand△5)．
ResultsTheKofthecomplexeswere1．914×10‘mol／LforTE—HSAand5，893×10‘mol／LforTE—
AAG，andthenumberofbindingsiteswere7．8and3．3，respectively．Themainsortsofbindingforcebe—
tweenTE—HSAorTE—AAGwerestatic—electricitygrav ation．ConclusionESI—MSissg odmethodf r
studyingoftheTE—proteinnon—Covalentbindingwithsomeadvantagesins nsitivity，high—speed，and
accuracy·
Keywords：tectoridin(TE)；humanserumalbumin(HSA)；a1-acidglycoprotein(AAG)；electro—
sprayiontrapmassspectrometry(ESI—MS)
许多药物可与血浆蛋白可逆结合形成非共价结
合复合物，这种结合态药物不容易通过细胞膜进入
血液，因此，对药物的体内过程、作用强度和持续时
间有重要影响“J。人血清白蛋白(humanserumal—
bumin，HSA)和G1-酸性糖蛋白(吨一acidglycopro—
rein，AAG)是人血浆中与药物结合的两种主要蛋白
组分。目前，研究药物与蛋白结合的方法有光谱法、
色谱法、NMR法、x射线晶体衍射法和质谱法等。
与这些方法相比，电喷雾质谱(ESI—MS)具有样品用
量少、灵敏度高、特异性强、分析快速和复合物化学
计量比准确等优点睁“。因此，本实验采用该技术研
究了射干苷(teelorldin，TE)与HSA和AAG问之
问的非共价结合特性，如稳定常数、最大化学结合计
量比和主要作用力类型等，这对阐明TE在血液中
的存在状态和转运过程等有十分积极的作用。
1仪器与材料
警鐾是萏：嚣；：；禁釜青年基金资助项目(2002Ac004)，中药生物技术省重点实验室开放基金项目(。40l。6)
_通讯作者胨勇Tel／Faxl(027)88663590E-mailIcyl0161 @npc．gov—cn
万方数据
·1474· 干革菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38尝第10期2007年10月
美国Finnigan公司LCQ”o型质谱仪，包括电喷
雾电离源，TSPAS3000自动进样器，样品相对分子质
量分析使用仪器自带的Xcalibur软件lTE为本实验
室制备，质量分数在98％以上IAAG(Sigma公司，
G9885—25MG，99％)。HSA水溶液(电泳纯，武汉生
物制品研究所)·色谱纯甲醇，TE储备液(o．4mmol／
L的50％乙醇液)，HSA储备液(3mmol／L水溶液)，
AAG储备液(0．1mmol／L水溶液)。
2方法与结果
2．1 样品的制备：称取TE对照品1．85mg置于
10mL量瓶内，加人5mL乙醇和5mL水，适当超
声助溶配成0．4mmol／L的50％乙醇液储备液。另
在无菌工作台下取适量AAG和水配成0．1mmol／
LAAG水溶液，HSA液适当稀释成3mmol／L水
溶液供储备液使用。分别取不同量TE储备液置于
Ep管中，于氮气吹干仪上吹干，每管加入pH6．810
mmol／L乙酸铵缓冲液450pL，再加人50pL0．030
mmol／LHSA(或50吐O．050retool／LAAG)，配
制不同量比的TE／HsA(或TE／AAG)混合液，在
微型旋涡混合仪上充分混合后于37℃作用60
rain，最后用pH6．810mmol／L乙酸铵缓冲液稀释
10倍后经自动进样器进质谱分析。
2．2质谱条件：ESI离子源；扫描范围m／z500
2000；离子源喷射电压5．0kV；毛细管温度190℃
(HsA，TE)、185℃(AAG—TE)；Cone电压35Vi鞘
气(N。)流量0．60L／rain。流动相分别为甲醇一水
(1t 1)(对HSA和AAG)、100％甲醇(对TE)、
10mmol／L乙酸铵(对TE—HSA和TE—AAG)，进样
量10L，体积流量0．2mL／min；自动进样，一级正
离子全扫描10mln。
2．3 TE、HSA和AAG相对分子质量的测定：根据
TE的一级正离子全扫描质谱，测得TE的相对分子质
量为461．9，与TE的理论相对分子质量462．4基本
相符。HSA和AAG一级正离子全扫描质谱图见图l，
经Xcalibur软件分析测得的HSA和AAG的平均相
对分子质量分别为66428和44106，与HSA和AAG
的理论相对分子质量66438和44100基本相符。
一i n
洲 隔
一．；
f利
t
确
650 670m／z㈣ 710 375 3”m395 Ⅻ
围l 1．0×l。-lmol／LHSA和AAG一缎正离子质谱围
Fig．1ESI—MSSpectraof1．0×10一‘tool／LHSA
andAAG
2．4实验条件对复合物形成的影响：采用ESI—MS
技术研究非共价结合大分子复合物，既要保证分析
液去溶剂化完全便于质谱分析，又要保证非共价复
合物的结构不被破坏[“。因此，实验选取射干苷与
HSA、AAG浓度比分别为240：3、280；3时的反
应液．以复合物相对分子质量为指标．考察了作用液
pH值、毛细管温度和锥孔电压对蛋白药物复合物
形成的影响，见表l。
考察pH影响时，TE—HSA选用Tcapl90℃．
裹1不同pH条件下药物蛋白复台翱的相对分子质量
TableMolecularightofdl’u —proteincomplexesindifferentpffvalu8
Vcone35V，TE—AAG选用Tcap185℃、Vcone35
v；考察Tcap影响时，选用pH6．8，Vcone35V；考
察Vcone影响时，TE—HSA选用Tcap190℃，pH
6．8，TE—AAG选用Tcap185℃、pH6．8。结果表
明，在生理pH条件下血浆蛋白结合的TE较多，pH
值、毛细管温度、锥孔电压的改变对TE与血浆蛋白
的结合均有不同程度的影响。当毛细管温度过高或
锥孔电压过大时能导致复合物解离，而过低的毛细
管温度或锥孔电压又会影响复合物的电离。因此
TE—HSA和TE-AAG复合物较为理想的分析条件
分别为pH6．8、毛细管温度190℃、锥孔电压35V
和pH6．8、毛细管温度185℃、锥孔电压35V。
2．5复合物的结合特性
2，5。1复合物表观结合化学计量比：通过分别测定
万方数据
十革菊ChineseTraditio硼l_ndHerba I)rtlgs第38卷第10期2007年10月·1475·
不同浓度的TE与固定浓度HSA、AAG作用后复
合钫的相对分子质量的变化，计算TE与HSA、
AAG的化学结合的表观计量比NEN一(MI口*一
mllE1)／M*#，式中肘代表分析物相对分子质量]，
见图2。
5393
TE—HSA
531．3
5刊 h。
520530540550560
4545
’rEAAG
劓m。
45
．刊
4054
h：
440 450 460 470
圈2IrE与lISA和从G物质的■比分别为3·4∞
秘1 t360形成的复台勒的一级质谱国
Fig．2ESI—MSSl*etraof3 I4帅IrE-lISA
and1 I360TE—AAGmolarr1,30
2，5．2复合物作用力类型分析：判断生物大分子与
小分子结合性质的热力学规律，即：z1S>0为疏水和
静电作用力，△S<0为氢键和范德华力，△H>0、
△s>0为典型的疏水作用力，△日
可以通过改变质谱毛细管温度，计算温度变化时药
物蛋白结合的△日、△5。
InK2／K1=△H(1／丁l一1／了1z)／R
△G=4H一丁A，一一RTlnK
式中Tl、r2分别为185℃、195℃(对TE—HSA)和180
C、190℃(对rE—AAG)的绝对温度，xt、Kz为与之对应的
结舍常数。
通过计算。在185℃和195℃的不同毛细管温度
作用下，TE与两种血浆蛋白结合的稳定常数K值分
别为TE—HSA：1．814×10‘、1．743×104，TE—AAG：
4．380)<104和4．124×104。根据绝对温度值和对应的
稳定常数分别计算出TE—HSA和TE—AAG复合物在
上述温度变化时的△H和△s值。TE—HSA：△日=
一7．118kJ，△S=65．952J／tooL·K；TE—AAG：
△日；一10．506kJ，△S一65．630J／tooL·K。可
见，TE与HSA和AAG之间的作用力都主要为静
电引力。
2．6复合物稳定性分析：药物与血清中蛋白质分子
存在非共价键作用，这种作用多采用位点结合模型
解释，这是一种纯经验模型。在这种模型下蛋自质分
子存在多类结合位点且各类结合作用是等同和独立
的，可采用多级结合方程来说明04]。
r—cb／[P]一厶niKiCI／(1+K心f)
式中cb，cf分别为药物的结合浓度和游离浓度，[P]为
结合蛋白质浓度，r是药物与蛋白结合的化学计量比．m表
示蛋白质共有卅类结合位点，ni，Ki分别表示一个蛋白质分
子上第i类结合位点的位点数目和结台常数。
这个方程从形式上来说类似于Langmuir吸附
方程，当蛋白质分子仅有一类结合位点时，此方程可
转化为Scatchard方程‘”]。
。
r／Ct—nK—K，
式中r为药物与蛋白的结台比即化学计量比，cl为游离
药物浓度(cr=CL—r[P])，cL是药物总浓度．x为结舍常
数，n为结合位点数。
实验固定HSA和AAG作用浓度不变，用不同
浓度TE与之作用并测定复合物相对分子质量。依
据相对分子质量的变化求得其不同浓度条件时的化
学计量比，再根据Scatchard方程对r／G与r进行
线性拟台，见图3。由该曲线的斜率和截距可计算出
TE与HAS、AAG形成复合物的稳定常数(量)和结
合位点数(”)分别为1．914×104mol／L，n一7．8和
5．893×104mol／L，n=3．3。
刍
§
t
盈3 TE与HSA、AAG结合的Seatehard曲线
Fig．3$eatchnrd0lotforbi们jⅡgTEIolISA蛐dAAG
3讨论
采用ESI—MS研究小分子与蛋白质的作用主要
是基于当作用的小分子药物量相对作用的蛋白过量
时，蛋白复合物总浓度与作用的蛋白总浓度近似相
等，当药物对蛋白的过量程度较小或较大时，
Scatchard滴定分析曲线不呈线性，只有当作用浓度
比合适时，Scatchard滴定分析曲线才呈线性。本实
验经过优化实验条件以尽可能排除非特异结合，通
过对HSA、AAG与TE结合的ESI—MS研究，得到
了稳定常数、结合常数和主要作用力类型等值，但该
方法可能不适用于亲合力较弱的体系，这是因为如
果蛋白与小分子配体间亲合力太弱而配体相对作用
蛋自大大过量时，蛋白与配体间的非特异性结合会
影响方法的测定结果，因此采用ESI—Ms技术研究
蛋白与小分子的非共价结合作用在亲和力较强的体
万方数据
·1476· 中草焉ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第10期2007年10月
系具有较强的适用性。
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盐酸小檗碱纳米乳的制备及其理化性质研究
孙红武“2，欧阳五庆”
(1．西北农林科技大学动物科技学院，陕西杨凌，712100；2．第三军医大学药学院微生物及免疫学教研室t重庆400038)
摘要：目的制备出盐酸小集碱纳米乳并对其理化性质进行研究。方法选择油相肉豆蔻酸异丙酯、表面活性剂
聚氧乙烯蓖麻油和助表面活性剂甘油，利用伪三元相围制备出盐酸小檗碱纳米乳。用13000r／rain·30rain离心稳
定性和粒径为纳米乳的评价指标，采用HPLC测定纳米乳中盐酸小集碱的量，同时对该纳米乳的黏度、电导宰、折
光率、Zeta电位、粒径的基车理化性质和高湿(92．5％)、高温(40℃，60℃)、25℃及强光[(4500土500)Ix]的条件
下的稳定性进行研究。结果制备出的盐酸小檗碱纳米乳为澄清透明的液体，透射电镜下观察为球状液滴，平均粒
径为56．8nmf离心稳定，在上述高湿、高温、强光条件下考察10d，其古药量和粒径均未发生明显变化。结论盐酸
小檗碱纳米乳是一种质量稳定的良好药物传递系统。
关键词：盐酸小檗碱；纳米乳，理化性质；稳定性
中围分类号：R283．1IR286．02 文献标识码tA 文章缩号：0253—2670(2007)10—1476—05
Preparationndphysicochemicalcharacteristicsofberberinehydrochloricnanoemulsion
SUNHong—wul～，OUYANGWu—qin91
(1．CollegeofAnimalScienceandTechnology，NorthwestUniversityofA8LFScienceandTechnology，
Yangling712100，China‘2．DepartmentofClinzcalMicrobioloyandImmunology·CollegeofPharmacy，
‘
ThirdMilitaryMedicalUniversityofPLA，Chongqing400038，China)
Abstract：ObjectiveToprepareberberinehydrochloricnanoemulsionandstudyitsphysicochemical
characteristicsofnanoemulsion．MethodsThnanocmulsioncomponentsofisopropylmyristate(IPM)，
EL40，andglycerinwereselected．Berberinehydrochloricnanoemulsionwaspreparedwithpseudoternary
phasediagrams．Takingcentrifugetests(13000r／rain，30min)andtheaveragediameteras valuationin-
dexesofnanoemulsion，thec tentofb rberinehydrochlorieinnanoemulsionwasdeterminedthrough
HPLC．Thebasic口hvsicochemicalcharacteristicsincludingv scosity，electricconductivity，refraction，ze—
ta—potentral，andparticlediameterwe estudied．Andalsothestabilityofnanoemulsionwastudiedun er
theconditionsofhighhumid(92．5％)，hightemperature(40℃and60℃)，andstronglight[(4500+
500)Ix]．ResultsPreparednanoemulslonwflsaki dofclarityandtransparentsolutionanditpresented
assmallsphericaldropsunderlectionmicroscopy，withtheaveragediameterofabout56．8am．Itsna一
收藕日期：2006—12-19
荐妻嚣异：器差盔麓害；誉銮差关量差耋鋈5窖鬻￡蛩韶车毕业于西南大学药学院．z。。，年获西北农林科技大学博士学位．理从事纳米
药物制刺的开发。E—mail：sunhongwu2001@153·com
-通讯作者欧阳五庆E—mailIoywq506@sina．com
万方数据
电喷雾离子阱质谱法研究射干苷与血浆蛋白的非共价结合
作者： 曹燚， 韩凤梅， 陈勇， CAO Yi， HAN Feng-mei， CHEN Yong
作者单位： 湖北大学,中药生物技术省重点实验室,湖北,武汉,430062
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2007,38(10)
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报 2010(3)
本文链接：http://d.wanfangdata.com.cn/Periodical_zcy200710014.aspx