全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 4 期
寡肽转运蛋白 PepT2 原核表达质粒的
构建及其表达初探
赵东欣1 朱其丛1 薛永亮1 卢奎1，2
(1河南工业大学化学化工学院，郑州 450001;2河南工程学院，郑州 451191)
收稿日期:2010-10-19
基金项目:国家自然科学基金项目(20772023) ，河南省创新型科技人才队伍建设工程项目(104200510022) ，郑州市创新型科技人才队伍建设
工程资助项目(10LJRC174)
作者简介:赵东欣，女，博士，副教授，研究方向:化学生物学;E-mail:dxzhao@ haut． edu． cn
通讯作者:卢奎，男，教授，研究方向:化学生物学;E-mail:luckyluke@ haut． edu． cn
摘 要: 寡肽转运蛋白(PepT2，peptide transporter，SLC15A2)是哺乳动物体内能够转运二肽、三肽的蛋白。研究表明，一
些类肽的小分子药物也是 PepT2 的底物，但 PepT2 的结构与生物学功能尚待研究。建立稳定表达 PepT2 的表达体系是研究
PepT2 的重要环节。根据 GenBank 中人 PepT2 基因序列，借助 Primer5. 0 设计了 1 对寡核苷酸引物，经 PCR 合成长达 2 190
bp 的目的序列，通过重组构建 pET30a(+)/PepT2 表达质粒，测序分析确认目的基因中的 3 个碱基发生突变。初步研究了
pET30a(+)/PepT2 在大肠杆菌 BL21(DE3)pLysS 中的表达，为 PepT2 原核表达的进一步科研和实际应用奠定了基础。
关键词: PepT2 原核表达 基因
Plasmid Constuction and Preliminary Prokaryotic Expression of PepT2
Zhao Dongxin1 Zhu Qicong1 Xue Yongliang1 Lu Kui1，2
(1School of Chemistry and Chemical Engineering，Henan University of Technology，
Zhengzhou 450001;2Henan Institute of Engineering，Zhengzhou 451191)
Abstract: PepT2 can transport dipeptide，tripeptide and some small molecule peptide-like drugs，but its structure and biological
function need to be investigated． It is important to constuct a stable prokaryotic expression system of PepT2 in investigation of PepT2． A
pair of primers was designed according to the hPepT2 gene with Primer5. 0 software． The gene sequence of hPepT2 was synthesied by
PCR and cloned into the expression vector pET30a(+)． The recombinant plasmid pET30a(+)/PepT2 was identified and analyzed，and
three bases mutations in PepT2 gene were found． The recombinant plasmid pET30a(+)/PepT2 was transformed into the BL21(DE3)
pLysS expression system for expression，which established the foundation for the further scientific research and the real application．
Key words: PepT2 Prokaryotic expression Gene
PepT2(Peptide Transporter，SLC15A2)是一种高
亲和力、低容量的肽载体，能够转运大部分的二肽和
三肽，研究发现一些类肽药物也是 PepT2 的底
物［1 － 3］。利用肽转运载体来促进药物或前体药物的
吸收已成为一种比较有前途的口服给药策略，也成
为生物药剂学的一个新研究领域［4］。目前，人们对
PepT2 的底物亲和力研究较多，但是对 PepT2 的转
运机制及其对底物的识别方式等还需深入研究。基
因突变和分子克隆技术是研究功能蛋白的热门手
段［5 － 7］。本试验拟构建 pET30a(+)/PepT2 重组原核
表达体系，期望建立稳定表达 PEPT2 的原核表达质
粒，为进一步研究寡肽转运蛋白的结构与功能奠定
基础。
1 材料与方法
1. 1 材料
Bio-Rad MyCyclerTM Thermal Cycler，USA;DYY-
8C型电泳仪，北京六一仪器厂;VORTEX-6 涡旋振
荡器，海门市其林贝尔仪器制造有限公司;紫外投射
分析仪，上海康华生化仪器制造有限公司;Eppen-
dorf移液器，德国;紫外凝胶成像仪，美国 BIO-RAD
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 4 期
公司;DYCZ-28C 型电泳槽、DYCP-31C 型电泳槽，北
京六一仪器厂。
含 PepT2基因的质粒购自 OriGene 公司;大肠杆
菌 DH5α、BL21(DE3)pLysS、pMD18-T、pET30a(+)、异
丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、X-gal、氨苄青霉素和卡那
霉素购自 TaKaRa 公司;限制性内切酶 Nde I、Hind
III、T4 DNA 连接酶、胶回收试剂盒购自 Promega 公
司，质粒提取盒购自 TIANGEN 公司;PCR 引物为上
海生工生物工程技术服务有限公司合成。SDS-聚丙
烯酰胺凝胶电泳所需试剂:丙烯酰胺(Acr)、甲叉双丙
烯酰胺(Bis)、TEMED(N，N，N’N’-四甲基乙二胺)为
超级纯，其他试剂均为分析纯。
1. 2 方法
1. 2. 1 PCR 扩增 PepT2 基因片段 根据 PepT2 全
基因序列设计引物，分别在引物的 5端加入 Nde I、
Hind III酶切位点和保护性碱基。上游引物:5-GG-
GAATTCCATATGAATCCTTTCAGAAAATGAT-3;下
游引物:5-CCCAAGCTTTCAGAGTTTTGT-3。以含
人源 PepT2 基因的质粒为模板进行 PCR 扩增，PCR
程序:95℃ 5 min;94℃ 1 min、55℃ 1 min、72℃ 1
min进行 30 个循环;72℃ 10 min;PCR产物以 1%琼
脂糖凝胶电泳进行鉴定，用胶回收试剂盒纯化。
1. 2. 2 pMD18-T /PepT2 重组克隆质粒的构建与鉴
定 按照 TaKaRa pMD18-T 试剂盒的操作步骤，
pMD18-T质粒片段与 DNA 目的片段连接 4 h，转化
至 DH5α 感受态细胞中，在含 X-gal、IPTG和氨苄青
霉素的平板培养基中培养过夜，挑白色菌落，于含氨
苄青霉素的 LB 培养基中培养，抽提质粒，用 1%的
琼脂糖凝胶电泳检测，并用 Nde I、Hind III 双酶切鉴
定连接结果。
1. 2. 3 pET30a(+)/PepT2 重组表达质粒的构建与
鉴定 将纯化的 pET30a(+)质粒和 pMD18-T /PepT2
重组克隆质粒用 Nde I和 Hind III 进行双酶切，得到
带有相同粘性末端的 pET30a(+)和目的基因片段。
将两者按 1∶ 3 物质的量比混合，用 T4连接酶在 16℃
下连接 18 h。再转化至大肠杆菌 DH5α 感受态细
胞，37℃平板培养 16 － 24 h。挑取 5 个较大的菌斑，
接种到 3 mL LB /Kan液体培养基中，37℃ 220 r /min
摇菌过夜，抽提质粒，用 1%的琼脂糖凝胶电泳检
测，并用 Nde I和 Hind III双酶切鉴定连接结果。初
步判定连接上的重组质粒由上海英骏公司测序。
1. 2. 4 重组质粒的诱导表达 将 pET30a(+)/
PepT2 转化至 BL21(DE3)pLysS 感受态细胞中，
37℃平板培养 16 － 24 h挑选菌落接种于 3 mL含卡
那霉素(50 μg /mL)的 LB培养基中，37℃培养过夜。
取 1 mL培养液加入 50 mL含卡那霉素的培养基中，
37℃培养 3 h左右。取出 1 mL作为 IPTG 诱导前的
样品，－ 20℃保存。其余样品中添加 200 μL 100
mmol /L 的 IPTG，37℃培养。分别在 1、2、3 和 4 h后
取出 1 mL样品作为 IPTG诱导后的样品，－ 20℃ 保
存。将诱导前、后的样品 10 000 r /min 离心 1 min，
回收菌体沉淀并保存上清液 1。沉淀样品用 200 μL
冰预冷的磷酸缓冲液(PBS)悬浮，10 000 r /min离心
1 min回收沉淀，加入 30 μL的 PBS 缓冲液和 10 μL
4 × SDS上样缓冲液，在涡旋振荡器中剧烈振荡 1
min，使菌体完全溶菌。将样品分别在 100℃ 沸水浴
中保持 5 min，立即放入冰浴中冷却。12 000 r /min
离心 1 min，回收上清液 2。取 10 μL 诱导前、后的
上清液 1 和 2 上样，进行 SDS-PAGE分析。
2 结果与讨论
2. 1 PepT2 目的基因的 PCR扩增
PCR扩增中，退火温度的设定对 PCR 扩增的结
果影响较大，温度过高会造成引物与模板不能结合，
出现无目的产物的现象;温度过低会导致非目的产物
条带的出现。根据引物合成报告的推荐并结合软件
预测的退火温度，设定 PCR反应的退火温度 54. 4℃。
2. 2 pMD18-T /PepT2 扩增质粒的构建
pMD18-T 载体由 pUC18 载体改建而成，在
pUC18 载体的多克隆位点处的 Xba I 和 Sal I 识
别位点之间插入了 EcoR V 识别位点，用 EcoR V
进行酶切反应后，在两侧的 3 端添加“T”而成。
因大部分耐热性 DNA 聚合酶进行 PCR 反应时都
有在 PCR 产物的 3末端添加一个“A”的特性，
所以使用 pMD18-T 可以大大提高 PCR 产物的连
接、克隆效率。重组质粒 pMD18-T /PepT2 电泳检
测结果(图 1，泳道 3)显示为两条亮带，下方条带
为超螺旋结构的质粒，上方条带为线性的重组质
粒，因为 pMD18-T 载体不能自连，所以可以初步
431
2011 年第 4 期 赵东欣等:寡肽转运蛋白 PepT2 原核表达质粒的构建及其表达初探
确定得到了重组质粒。
所得到的重组子中有可能不含有目的基因，或
得到的可能是污染质粒等，因此要对重组质粒做进
一步 PCR和酶切鉴定。结果(图 2)显示，PCR 产物
条带的大小与目的基因的大小一致。泳道 3 为 pM-
DT18 /PepT2 重组质粒双酶切电泳条带，其中泳动较
快条带与 PCR 产物条带一致，为 PepT2 目的基因，
另一条带为重组质粒双酶切成的 pMD18-T 片段。
与标准分子量对比可以看出目的基因和 T 载体克
隆质粒的大小与理论相符。综上可以判断目的基因
已被连接到 T 载体上。
1． DNA Marker;2． PCR产物;3． pMD18-T /PepT2 重组质粒
图 1 pMD18-T /PepT2 重组质粒的电泳图
1． DNA Marker;2． 以 pMD18-T /PepT2 为模板的 PCR 产
物;3． pMD18-T /PepT2 的 Nde I和 Hind III双酶切片段
图 2 pMD18-T /PepT2 重组质粒的
PCR及双酶切电泳图
2. 3 pET30a(+)/PepT2 重组表达质粒的构建及
PCR和酶切鉴定
pET30a(+)质粒中含有 N端组氨酸标签，为表
达寡肽转运蛋白的检测和纯化提供便利。为确定
目的基因是否重组到表达质粒 pET30a(+)中，对
重组表达质粒进行 Nde I和 Hind III双酶切及 Hind
III单酶切，PCR鉴定。产物经琼脂糖凝胶电泳检
测(图 3)显示，双酶切的重组表达质粒分为两条
带，与 DNA 标准分子量对比，与目的基因和
pET30a(+)大片段的理论分子量相符合;经过双酶
切后，表达质粒中大小为 2 190 bp 的目的基因被
切掉，所以电泳移动速度比 pET30a(+)/PepT2 重
组表达质粒快。共价闭环的重组质粒 DNA经单酶
切成为线性 DNA，电泳速度变慢，介于泳道 2中的超
螺旋 DNA 和开环 DNA 之间。以重组质粒为模板的
PCR条带与理论分子量条带相符。综上可以初步判
断出，已将寡肽转运蛋白 PepT2的基因重组到表达质
粒 pET30a(+)上。
1． DNA Marker;2． pET30a(+)/PepT2 组质粒;3． pET30a
(+)/PepT2 质粒的 Nde I 和 Hind III 双酶切片段;4．
pET30a(+)/PepT2 质粒的单酶切(Hind III)片段;5．
pET30a(+)/PepT2 重组质粒的 PCR片段
图 3 pET30a(+)/PepT2 重组质粒的酶切鉴定
2. 4 重组质粒的测序
重组质粒的测序结果显示，寡肽转运蛋白 PepT2
的基因重组到表达质粒 pET30a(+)上，但 672 位的 A
突变为 T，966 位的 A 突变为 T，1918 位的 G 突变为
A;其中 672 位碱基突变前后的密码子 CCA 与 CCU
都编码 Pro，966 位碱基突变前后的密码子 CGA 与
CGU都编码 Arg，但是 1918 位突变前 GGC编码 Gly，
而突变后 AGC编码 Ser，即蛋白第 640 位的氨基酸残
基由 Gly突变成 Ser。
2. 5 PepT2 的诱导表达
用 IPTG 对含有 pET30a(+)/PepT2 重组质粒
531
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 4 期
的 BL21(DE3)pLysS 菌诱导表达，分别对诱导前
后的菌体和上清液处理，进行 SDS-PAGE 分析，
PepT2 蛋白分子量在 81. 8 kD 左右，但在分子量
81. 8 kD附近并没有明显的蛋白条带出现。由于
多数氨基酸不只一个密码子，而不同的生物使用
这 61 种密码子的偏爱性不同。每种细胞里，tRNA
种类和数量直接反映了其 mRNA 使用密码子的种
类和数量的偏爱性。tRNA 不足会造成翻译停顿、
早期翻译停止、移码突变和氨基酸错掺等问题。
当外源目的基因 mRNA 在 E． coli 里表达，由于密
码子偏爱性不同，会因为缺乏某种或某几种 tR-
NA，直接导致翻译终止或错误。在用 ITPG诱导表
达 PepT2 蛋白的过程中发现，E． coli 几乎不表达
PepT2，对 PepT2 的 DNA 分析表明，其含稀有密码
子的量较高(11%) ，这是哺乳动物 DNA 在原核生
物中不好表达的重要原因。
3 结论
本试验采用 PCR 扩增了人体寡肽转运蛋白
PepT2 的编码区，并将 PepT2 基因重组到表达质粒
pET30a(+)上，得到 pET30a(+)-PepT2 重组质粒，但
目的基因中有 3 个碱基发生突变，其中 1 个碱基的
突变造成所翻译的氨基酸发生突变(G640S)。用
ITPG诱导表达蛋白的过程中发现，E． coli 几乎不表
达 PepT2，对 PepT2 的 DNA 分析表明，这可能是因
其 DNA序列中含稀有密码子的量较高(11%)。为
了进一步改善寡肽转运蛋白(PepT2)在 E． coli 中表
达，后续试验将 DNA进行优化及使用能补充稀有密
码子的菌株进行表达［8］。
参 考 文 献
［1］Shen H，Ocheltree SM，Hu YJ，et al． Impact of genetic knockout of
PepT2 on cefadroxil pharmacokinetics，renal tubular reabsorption，
and brain penetration in mice． Drug Metab Dispos，2007，35(7) :
1209-1216．
［2］Knutter I，Wollesky C，Kottra G，et al． Transport of angiotensin-con-
verting enzyme inhibitors by H + /peptide transporters revisited．
Pharmacol Exp Ther，2008，327(2) :432-441．
［3］赵东欣，薛永亮，卢奎，等．寡肽转运蛋白 PepT2 及其药物转运．
中国生物化学与分子生物学报，2010，26(1) :1-8．
［4］Alper J． Drug delivery breaching the membrane． Science，2002，296
(5569) :838-839．
［5］ Jiang HD，Hu YJ，Keep RF，et al． Enhanced antinociceptive response
to intracerebroventricular kyotorphin in Pept2 null mice． Journal of
Neurochemistry，2009，109(5) :1536-1543．
［6］ Sndergaard HB，Bravo SA，Nielsen CU，et al． Cloning of the pig
PEPT2(pPEPT2)and characterization of the effects of epidermal
growth factor(EGF)on pPEPT2-mediated peptide uptake in the re-
nal porcine cell line LLC-PK1． European Journal of Pharmaceutical
Sciences，2008，33(4-5) :332-342．
［7］江勇，蔡辉益，刘国华，等． 北京油鸡肠道肽转运蛋白 PEPT1 表
达载体的构建及在 293-T 细胞的表达． 东北农业大学学报，
2009，39(5) :71-76．
［8］王继雯，谢宝恩，周伏忠，等．抗菌肽 hepcidin融合蛋白在大肠杆
菌中表达条件的优化．生物技术通报，2009(10) :151-154．
(责任编辑 李楠)
631