全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·技术与方法· 2008年第5期
收稿日期:2008-07-03
基金项目:国家自然科学基金(30270877)和天津市科委科技攻关重点项目(05YFGZGX04400)
作者简介:王高峰(1984-),男,在读研究生,从事植物寄生线虫致病基因研究;E-mail:jksgo@126.com
通讯作者:孙建华,E-mail:jianhuasun55@yahoo.com.cn
RNAi是指内源或外源双链 RNA(double-strand
RNA,dsRNA)导入细胞后导致其同源基因沉默的
现象,可发生在转录后、转录及翻译三个水平上[1~3]。
它是一种能够高效地导致基因沉默的技术,并具有
遗传性。因此,RNAi在基因调节、遗传育种、基因功
能研究、药物研发等各方面具有广泛的运用前景[4],
也使得运用其对生物基因进行大规模功能研究成
为可能。农业因植物线虫病害每年遭受严重损失,
遭受的损失又主要由植物寄生线虫引起。据报道,
全球因植物寄生线虫而带来的年损失约 1250亿
美金[5]。对植物寄生线虫进行有效的防治迫在眉睫,
因此,对植物线虫特性及其防治的研究一直以来都
是学者们的研究热点。近年来,RNAi技术已广泛应
用于植物线虫基因功能的研究,随着对植物线虫基
因组及其功能能研究的不断深入,RNAi技术将会
为植物寄生线虫的防治提供大量的药靶及疫苗靶,
包括基因及其编码物质—多肽和蛋白质。同时,基
于 RNAi干扰技术还培育出具抗植物寄生线虫的
转基因植株。因而,RNAi技术在植物线虫防治中具
有广阔的应用前景。
RNA干扰技术在植物线虫基因功能研究及虫害
防治方面的应用
王高峰 1 冯欣 1 彭德良 2 孙建华 1
(1天津师范大学化学与生命科学院,天津 300387;2中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室,北京 100094)
摘 要: RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是双链RNA(double-strandedRNA,dsRNA)介导的同源mRNA特
异降解的过程,具有高效性、非绝对特异性和表型可遗传性。其在遗传育种、基因功能研究、药物研发等各方面具有广泛
的运用前景。近年已应用到植物线虫基因功能的研究中。随着对植物线虫基因组及基因功能研究的不断深入,RNAi技术
在植物线虫防治方面的研究也取得了很大进展。
关键词: RNA干扰 植物寄生线虫 取食位点 基因功能 线虫防治
StudyontheApplicationofRNAInterference(RNAi)Technique
totheControlofPlantNematodes
WangGaofeng1 FengXin1 PengDeliang2 SunJianhua1
(1ChemistryandLifeScienceColege,TianjinNormalUniversity,Tianjin300387;2TheStateKeyLaboratoryforBiologyof
PlantDiseaseandInsectPests,InstituteofPlantProtection,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100094)
Abstract: RNA interference(RNAi) istheproces ofsequence-specificdegradationofhomologousmRNA
triggeredbydouble-strandedRNA,andhaspropertiesofhighactivity,non-absolutespecificityandgeneticphenotype
inducedbyRNAi.Itmaintainswidepracticalapplicationinvariousfields,includinggeneticsandbreeding,researchand
developmentofnew drugs,andgenefunctions.ThetechniqueofRNAihasbeenbeingapplicatedtothestudiesof
genefunctionsofplantnematodes.Withstudiesongenomeandgenefunctionsofplantnematodesprolonging,the
applicationofthistechniquetocontrolofplantnematodeshasmadegreatprogres.Inthisarticle,review onpractical
applicationofthetechniqueofRNAitothegenefunctionsandcontrolofplantnematodes,wasgiven.
Keywords: RNAiPlantparasiticnematodesFeedingsite Genefunction Controlofplantnematodes
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第5期
1 RNAi的特性
1.1 RNAi的高效性
RNAi能够高效地导致靶基因沉默。研究发现
将微量的 dsRNA注入细胞后,就能够高效的抑制
靶基因的表达,而且细胞内 1～100mmol/L的 dsRNA
对靶基因的沉默效果是一样的[6],在活体线虫的每
个细胞中只要 2个 dsRNA分子就可以使大量的
unc-22RNAs丧失活力[7]。对此有以下几种解释。
第一,RNA指导的 RNA聚合酶(RNA-directed
RNApolymerase,RdRP)以靶 mRNA为模板,以小干
扰性 RNA(smalinterferingRNA,siRNA)中的一条
链为引物合成新的 dsRNA,然后 Dicer酶再对新合
成的 dsRNA进行剪切以形成次级 siRNA,从而引发
新一轮 dsRNA的合成和剪切,使 RNAi作用效应放
大[8]。siRNA为导入的 dsRNA在 Dicer酶的切割作
用下形成的一种短片断双链 RNA分子,能够以同
源互补序列的 mRNA为靶目标降解特定的 mRNA。
第二,以靶 mRNA被剪切产物为模板,在 RdRP
作用下进行无引物合成 dsRNA,dsRNA再被 Dicer
酶剪切成次级 siRNA,进行下一轮的循环反应[8]。
第三,进入细胞的 siRNA在 RdRP作用下以类
似 PCR反应的方式进行扩增从而放大 RNAi的抑
基因表达效应[9]。
第四,siRNA能行使类似于催化剂的功能,可
对很多类似于反应底物的 mRNA分子进行切割。其
主要是由于被 siRNA激活的 RNA诱导的沉默复合
物(RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)中的 Dicer
酶具螺旋酶结构域,能够使 siRNA从结合的靶
mRNA上分离,释放被切割的 mRNA,而 siRNA仍
然与 RISC结合并另个靶 mRNA分子进行切割[10]。
第五,siRNA诱导转录水平的基因沉默,使
DNA甲基化,从而使微量的 dsRNA能够显著降低
基因的表达量[10]。
1.2 RNAi的非绝对特异性
RNAi是一种能够导致靶基因沉默的现象。在
siRNA中 1～2个碱基错配会大大降低对靶 mRNA
的降解效果[11]。然而这种特异性又是相对的,用能
够表达发卡 RNA的载体导入线虫体内表达获得的
dsRNA能够在细胞内存在更长的时间,但其在细胞
内表达的量很难控制,高浓度的dsRNA有可能导致
脱靶和非特异性效应(包括激活激素应答基因)[12~14]。
RNA依赖的蛋白激酶(RNA-dependentproteinkinase,
PKR)与 dsRNA结合后能够被激活,这是在一些
RNAi试验中导致脱靶的原因[15]。同时,RNAi干扰
还会导致次级干扰,即在 RNA指导的 RNA聚合酶
的作用下以靶 mRNA为模板,以 siRNA中的一条
链为引物合成新的 dsRNA,然后 Dicer酶再对新合
成的 dsRNA进行剪切以形成次级 siRNA。而新合成
的 dsRNA中含有与导入的 dsRNA非同源的双链,
由该序列新产生的 siRNA可能导致非靶基因的沉
默[8]。
1.3 RNAi诱导表型的遗传性
有研究表明直接注入 dsRNA达到的基因沉默
不能稳定遗传[16~19]。RNAi引起的表型在秀丽隐杆
线虫(Caenorhabditiselegans)中只能遗传 2~3代[20]。
注入线虫细胞中的 dsRNA大部分能够在细胞间进
行传递,使得 dsRNA能够传给下一代并表现出
RNAi性状。同时,子代的 RNAi效果比亲代中的要
明显,但在后代中因 RNAi诱导的性状很少会继续
遗传,所以子代中的 RNAi效用传递不及亲代,可
当种系中表达的基因为 RNAi靶向的基因时,因在
C.elegans的整个 RNAi过程中有依赖于该 mRNA
的信号扩大作用,使得 siRNA在这些靶基因的组织
中积累,RNAi表型可以进行第一代以后的遗传[21]。
Vastenhouw等[2]人也发现 RNAi能够导致可遗传但
不完全的基因沉默,且这一现象非常普遍。这制约
了 RNAi对基因功能的研究。为了得到能够稳定遗
传的 RNAi表型,Kennerdel和 Tavernarakis研究小
组[22,23]分别成功构建了能够在果蝇(Drosophila)和
C.elegans中表达发夹 dsRNA分子且能够稳定遗传
的转基因子(transgene),这种可遗传性估计是转基
因子能够复制到子代细胞中,在子代细胞中转录出
发夹 dsRNA的结果。这一技术使得运用 RNAi研究
各种生物生命周期中各期表达基因的功能成为可
能。
2 RNAi在植物线虫研究中的特点
同其它的技术一样,同一技术在不同的研究领
域有着不同的特点。各领域应用的 RNAi技术有着
共同的原理,但对不同的研究对象又有其特殊之
处。在植物线虫研究中的 RNAi技术有以下特点。
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2.1 dsRNA的设计
在构建能够在细胞内表达发卡 dsRNA的转基
因子时,在基因片段反向连接或反向重复序列方法
中的基因片段间连接一段非编码序列(可以是同源
基因某一片断或无关序列或则内含子)[24]。在植物
内导致基因沉默的效果与没有该非编码序列的相
比可以从 58%提高到 90%[6]。
2.2 dsRNA的导入
目前向线虫离体细胞或体内导入 dsRNA主要
有以下几种方法:
显微注射(microinjection):在 C.elegans中,导
入 dsRNA最常用的方法是通过显微注射方法向种
系包含体中注入 dsRNA[25]。而 dsRNA干扰能够通过
细胞间隔从注射位点进行扩散,且注入细胞外液中
的 dsRNA其 RNAi效果更好[26]。
虫体侵泡 (soaking)法:可使线虫浸泡在含
dsRNA的溶液中使 dsRNA摄入线虫体内。如用真
蛸胺(octopamine)刺激大豆根结线虫(Meloidogyne
incognita)使其吸取溶液中的 dsRNA,从而将 dsRNA
导入体内进行 RNAi[27]。
用能表达发卡 dsRNA的大肠埃希氏菌 HT115
(DE3)喂养线虫。相比于直接导入 dsRNA,用能够
表达发卡 RNA的载体导入线虫体内表达获得的
dsRNA能够在细胞内存在更长的时间,但如 RNAi
的非绝对特异性中所述,其有可能导致脱靶和非特
异性效应。
此外,还有电穿孔(electroporation)法[28]。总之,
dsRNA导入线虫体内的方法很多,可依据不同线虫
或不同线虫的不同细胞特性选择不同的方法,而且
还可对选择的试验方法依据不同线虫的不同特性
进一步优化。
3 RNAi在植物线虫基因功能研究中的应用
RNAi技术是一种能够导致靶基因沉默的技
术,其操作相对简单、具高效性和成本低等特点使
得其有望成为对各生物基因组进行大规模研究的
技术。此技术也已经应用于植物线虫基因功能的研
究上。
3.1 对线虫基因功能研究
RNAi技术对植物线虫基因功能进行了大量的
研究工作,主要集中在对 C.elegans的研究上。
Fraser等[35]用可表达 dsRNA的细菌文库对 C.elegans
Ⅰ号染色体近 90%基因进行系统的研究,经 RNAi
分析使已知功能基因从 70个增加到 378个。这一
研究具有重大意义。首先,通过对 C.elegans基因组
进行系统分析,能够使人们认识各基因编码蛋白的
功能,进而筛选出抗线虫药物靶基因,为线虫防治
开辟广阔空间。其次,发现在已预测的 C.elegans基
因中有 36%与人类基因同源,包括那些致病基因,
这将推动着对人类基因功能的研究[29]。Zipperlen等[30]
利用 RNAi与缩时视频显微术确定了 C.elegansⅠ
号染色体上 147个胚胎致死基因的功能,为在分子
水平认识早期胚胎发育过程及其调控开辟了道路。
另外,Hyman研究小组构建了针对 C.elegansII号
染色体上 2232个基因的 dsRNA文库,约占该染色
体所有编码基因的 96%,并利用该 dsRNA文库通
过 RNAi对 C.elegansII号染色体上这些基因进行
了功能分析[31]。Lee等[32]用系统性 RNAi对 C.elegans
5690个基因进行功能分析,发现了大量对线粒体
功能重要的基因与延长线虫寿命相关。这些基因的
发现对于了解线虫生长特性有着重要意义,并能为
线虫病害的防治提供理论依据。
3.2 对基因间相互作用研究
RNAi技术不但可以帮助认识基因的功能,而
且有助于认识基因间的相互作用。Ben等[33]用系统
性 RNAi技术对 C.elegans约 6500对基因间的相
互作用进行了研究,建立了基因间相互作用的系统
性图谱,以确定不同信号途径中的共同修饰基因。
这是在继酵母之后的第一张针对动物的系统性基
因相互作用图谱,为洞察动物基因间相互作用提供
了重要信息。
3.3 对基因进行组织特异敲除
由于 dsRNA的扩散性,使在线虫体内进行的
RNAi为全身性的[1]。现在已建立了组织特异 RNAi
技术。rde-1基因突变体能够抵抗 RNAi,但在特异
组织中若表达野生型 rde-1基因,在该组织中则能
进行 RNAi。因此,通过构建受 lin-26和 hlh-1启动
子 (分别为皮下和肌肉细胞中的特意表达启动子)
控制表达 red-1基因的表达载体,以分别建立皮下
特异 RNAi系统和肌肉特异 RNAi系统。由于在 C.
elegans中有很多的组织特异启动子,该系统能够运
王高峰等:RNA干扰技术在植物线虫基因功能研究及虫害防治方面的应用 77
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第5期
用在很多的组织和特定细胞中。该技术能够进行组
织特异基因的敲除,和通过抑制某一特异组织中功
能已知且必需的基因表达,以构建该基因突变的拟
表型[34]。
3.4 对基因进行聚类分析
RNAi技术还用于线虫基因聚类分析。通过观
察 C.elegans161个胚胎早期基因特性并用缩时显
微镜以 47种 RNAi相关表型对各个基因缺失表型
进行系统分析,即对该 47种相关表型用阴性、阳性
和不考虑 3种评判标准进行评判。用离散型表型特
征对所有进行 RNAi后的胚胎早期基因表型进行
分类,这一序列的表型评判即为各个基因的表型注
标(phenotypicsignature)。可通过这些数据把这些基
因归类为不同的phenocluster,发现这些phenoclusters
与基于基因碱基序列而预测出的功能能很好的吻
合。因此,可以用其来预测尚未进行功能分析的基
因的功能[35]。
4 RNAi在植物线虫基因功能研究中的局限性
RNAi技术在对基因功能方面的研究主要是通
过抑制相关基因的表达从而改变试验对象的形态,
进而观察其形态差异来确定该基因的功能。RNAi
不能对无表型效应的基因功能进行分析,从而限制
了 RNAi技术在基因功能分析方面的运用[30]。
相邻基因的干扰。如果在已确定序列的核酸区
域或其周围有几个基因,RNAi可能会影响这些相
邻基因的表达,导致表型与基因无一一对应关系[30]。
特定条件下才表达的基因的限制。RNAi无法
检测那些敏感或条件表达基因的功能,因这些基因
需在特定条件下表达,比如,压力感受蛋白、渗透压
感受蛋白等[30]。
遗传特性的限制。一些基因只在胚胎或胚胎后
期表达[30]。要检测这些基因功能,就必须使得 RNAi
能够持久存在于试验对象细胞中。并且能够控制在
某个特定时期进行 RNAi,在特定时期沉默或抑制
靶基因,这方面研究已在果蝇中有报道。为分析第
三龄幼虫蛹化前参与的基因受合成的发卡 RNA的
影响。Sijen等[36]人构建了携带受热激诱导启动子
hsp70控制表达的 GAL4基因和 UAS-IrlacZ转基因
子以及报告基因 UAS-LacZ这 3个基因的幼虫。通
过在幼虫第三龄后期进行热激诱导,使基因在该特
定时期表达,以进行 RNAi。这为在线虫中建立相似
的 RNAi系统提供了可能的途径。
脱靶的限制。RNA依赖的蛋白激酶(RNA-depe
ndentproteinkinase,PKR)与双链 RNA(dsRNA)结
合后能够被激活,这是在一些 RNAi试验中导致脱
靶的原因[15]。同时,用能够表达发卡 RNA的载体导
入线虫体内表达获得的 dsRNA有可能导致脱靶和
非特异性效应(包括激活激素应答基因)[18~20]。
此外,表型检测方法的灵敏度决定细胞中蛋白
质含量的最低极限值。这限制了对基因功能进行有
效的分析[37]。
最后是检测技术的限制。即使最优化的 RNAi
也不可能 100%的静息基因,可能低量表达的蛋白
依旧能够表现野生型。且蛋白质之间的差异使得这
种能够检测到功能丧失的相应蛋白质的最低含量
不同[38]。
5 基于 RNAi技术的植物寄生线虫防治策略
植物寄生线虫是目前造成农作物损失极大的
虫害,对其进行有效防治是减少农业损失的关键环
节。应根据线虫生长特性,来制订防治策略。从生物
防治的角度来讲,一方面可以提高植物的抗线虫能
力;另一方面,可以针对线虫的功能基因抑制其生
长发育。目前采用的植物抗寄生线虫策略是阻止线
虫取食位点的形成和使线虫不能发育为具生殖能
力的雌性线虫[38]。基于 RNAi技术的植物寄生线虫
防治主要可以从以下 2个方面进行。
5.1 对植物寄生线虫寄主进行 RNAi的防治策略
绝大多数植物病害线虫是专性寄生线虫,即某
种寄生线虫常寄生于特定的植物上,其生活史包括
线虫的入侵、取食和繁殖等几个阶段。打断每个阶
段都将达到防治线虫的目的。线虫在入侵植物后口
针分泌的分泌物质影响植物基因表达,使其形成取
食结构[39]。推测在形成取食结构的部位可能有特
异启动子存在,因为,只在该部位有的基因才表达
或使基因表达明显增强,在其它部位的细胞中不
启动这些基因表达或使这些基因微量表达[40]。之
后,Thurau等[41]发现甜菜胞囊线虫侵染甜菜的过程
中,甜菜中 HS1pro-1启动子受甜菜胞囊线虫特异
诱导启动。与植物寄生线虫取食位点细胞壁修饰相
关的 β-1,4-内切葡聚糖酶的启动子在根结线虫和
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胞囊线虫的特异诱导下启动表达[42]。这些基因可能
与取食结构的形成相关,也可解释其专性寄生的特
点。
随着对这些特异启动子和基因的深入研究,可
以通过构建包含受这些启动子控制的能表达靶向
这些特异基因的 dsRNA的植株,就可以通过 RNAi
抑制这些为形成取食结构所必需的基因的表达来
阻止取食结构的形成,从而培育出抗线虫植株。这
一通过抑制形成取食结构的必需基因的表达而达到
防治线虫的构想已用反义 RNA技术得到证实[43]。在
烟草(Nicotianatabacum)中发现 2同源基因 NtTOM1
和 NtTOM3编码的氨基酸序列与拟南芥中 2个为
番茄病毒复制所需的基因:TOM1、TOM3编码的氨
基酸序列相似,Momoko等[44]培育出能针对 NtTOM1
和 NtTOM3这 2个基因进行 RNAi的烟草,结果发
现该烟草几乎能够抑制番茄花叶病毒 (tomatomosaic
virus,ToMV)和其它的烟草花叶病毒(tobamoviruses)
的复制。这又一次证明通过 RNAi抑制植物寄主中
寄生生物寄生所必需基因的表达,可以培育出相应
抗性植株。
5.2 对植物寄生线虫进行 RNAi的防治策略
运用 RNAi技术成功培育抗病毒植株已有大
量报道[44~46]。借鉴运用 RNAi技术已构建抗病毒植
株的成功应用,可以设想通过以线虫病毒为基础构
建能够表达靶向线虫功能基因的 siRNA的病毒制
剂,以达到防治线虫的目的。此外,在线虫取食的同
时,如果在寄主细胞质中有一种 dsRNA或其
siRNA,使靶向线虫产生致死效应基因,而该
dsRNA或其 siRNA可由于线虫的取食进入线虫体
内产生 RNAi,导致线虫致死,那么可以通过构建能
表达这些 dsRNA的植株来获得抗寄生线虫植株。
目前已有报道应用 RNAi技术培育出能够产生针
对根结线虫(root-knotnematode)基因进行 RNAi的
dsRNA的转基因马铃薯。结果发现,该转基因马铃
薯对根结线虫产生完全抗性[47]。同时,另一个研究
小组也以同样的方法培育出对根结线虫有一定抗
性的拟南芥 (Arabidopsisthaliana)[48]。虽然,基于
RNAi技术的抗植物寄生线虫的抗性植株培育已有
所报道,但该技术在这方面的运用依旧面临着很多
挑战。比如,dsRNA能否从植物细胞质中有效进入
线虫体内并发挥 RNAi作用并产生致死表型[33],培育
出的抗性植株能否表现出完全抗性等[37,48]。
另外,可以通过类似于“鸡尾酒疗法”的策略。
基于 RNAi技术培育出对植物寄生线虫表现出强
抗性的抗性植株,即可以通过培育能够表达出靶向
该植物寄生线虫多个功能基因的 dsRNA的植株以
增强其对该寄生线虫的抗性,这一设想在果蝇中已
得到证实[49]。还可以将传统的抗植物寄生线虫转基
因植株培育方法与 RNAi技术相结合,培育出既能
够在体内表达出针对该植物寄生线虫的具杀虫活
性的物质,又能表达出针对该寄生线虫功能基因进
行 RNAi的 dsRNA的转基因抗性植株。甚至随着寄
生线虫与植物寄主间的信号作用的深入研究,培育
出能针对该植物寄生线虫功能基因进行 RNAi、产
生使其致死的活性物质和抑制取食结构形成的高
效而广泛的抗植物寄生线虫的转基因植株[1,48]。
6 结语
RNAi技术研究与运用已成为分子生物学的热
点。然而在看到其在植物线虫基因功能研究上成功
运用的同时,也应看到其仍有局限性。但随着对
RNAi认识的不断深入,RNAi技术在基因功能研究
中的运用将更加广泛。
同时,随着对植物线虫基因组及基因功能持续
而全面的研究,使得对植物线虫的生理特性以及导
致植物病害的机制等将有更多的了解,也将为植物
线虫的防治筛选出大量而高效的治疗靶点,从而生
产出效用更加可靠,更加环保的生物杀线虫制剂。
应用 RNAi技术培育出的对根结线虫具完全抗性
的转基因马铃薯,进一步昭示着 RNAi技术有望成
为植物寄生线虫防治的一种环保、高效而可靠的手
段。
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