全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2009年第 3期·研究报告·
收稿日期：2008-09-16
基金项目：江苏省自然科学基金（BK200505）
作者简介：潘孝青（1983-），男，江苏句容人，在读硕士研究生，研究方向：动物生殖调控研究与应用；E-mail：pxq1611@yahoo.cn
通讯作者：丁家桐，教授，博导；E-mail：jtding@yzu.edu.cn
下丘脑是调控动物繁殖的最高中枢，下丘脑某
些神经元分泌的 GnRH 是主要的调控激素。动物出
生后至初情期前，由于发育因素和性腺激素的反馈
作用，GnRH 的分泌量和分泌方式都受到抑制性的
调节 [1~3]，动物正常生殖生理活动的维持完全依赖
于下丘脑内 LH、FSH、Leptin、NPY 等 [4~6]已知基因及
一些未知基因在不同发育时期的正确表达。选择我
国地方优良品种小梅山猪下丘脑为实验素材，采用
DDRT-PCR、Reverse Northern Blot 等技术对下丘脑
发育相关调控基因进行分离与鉴定，在丰富哺乳动
物下丘脑研究理论基础的同时，为猪繁殖性状的遗
传改良提供相关实验依据。
1 材料和方法
1.1 实验动物
试验用初生（0 日龄）、初情期（70 日龄）纯种小
梅山母猪各 3 头， 由江苏省小梅山猪育种中心提
供，屠宰后迅速取出下丘脑，投入液氮中保存待用。
1.2 方法
1.2.1 RNA 的提取及 cDNA 的合成 采用异硫氢
酸胍一步法提取脑组织总 RNA，1%琼脂糖电泳检
测总 RNA 质量，测定 OD260nm、OD280nm值，确定其浓度
和纯度；cDNA 合成用大连宝生物试剂盒反应总体
积 10 μl：总 RNA 2 μg，锚定引物 MD01 ∶5′ -CACT-
ATAGGGCTTTTTTTTTTCT-3′ 1 μl（10 pmol/μl），DE-
PC - treated H2O 3 μl；70℃反应 10 min ，立即冰浴
2 min； 再加5×Reaction Buffer 2 μl，RNase Inhibitor
0.25 μl，dNTP 0.50 μl（10 mmol/μl），MMLV 50 U，加
DEPC-treated H2O 至 10 μl，42℃反应 1 h，70℃反应
15 min，立即冰浴 2 min，-20℃保存。
1.2.2 DDRT-PCR 银染分析 以反转录所得 cDNA
为模板， 用锚定引物 MD01 与 20 个随机引物进行
PCR 扩增。 扩增体系总体积为 25 μl，包括 10×PCR
猪下丘脑发育差异表达基因的分离、克隆与表达
潘孝青 张刻 丁家桐 宋晓娟 陈涛 张玉玲
（扬州大学动物科学与技术学院，扬州 225009）
摘 要： 在小梅山猪下丘脑不同发育阶段，用 mRNA差异显示技术分离并筛选出一个差异表达片段，命名为
CQ01，221 bp。测序与 BLAST分析发现，CQ01与猪血管内皮生长因子 A（VEGFA）高度同源 96%。半定量分析结果显示，
CQ01在初情期时下丘脑中表达量较高。
关键词： 猪 下丘脑 基因 克隆
Cloning and Characterization of the Difference of Gene
Expressed in Pig Hypothalamus
Pan Xiaoqing Zhang Ke Ding Jiatong Song Xiaojuan Chen Tao Zhang Yuling
（College of Animal Science and Technology，Yangzhou University，Yangzhou 225009）
Abstract： One specific fragment which named CQ01（221 bp） was found from hypothalamus of Meishan pig by
differential display reverse transcriptase polymerase chain reaction（DDRT-PCR）. After secquencing and BLAST analysis，
CQ01 displayed high homology （96%） to VEGFA gene of pig. The result of semi-quantitative showed that the express
of CQ01 was high at puberty.
Key words： Pig Hypothalamus Gene Clone
2009年第 3期
buffer 2.5 μl，dNTP （2.5 mmol/μl）2.0 μl，锚定引物
和随机引物各 1 μl，TaqDNA 聚合酶 1 U，cDNA 2.0
μl，加 ddH2O 水至总体积 25 μl。扩增条件为 94℃ 5
min；94℃ 30 s，43.6℃ 1 min，72℃ 30 s，40 次循环 ；
72℃ 10 min。 PCR 产物用 PAGE 胶银染分析。
1.2.3 差异条带的回收及再扩增 参照 Liang 等 [7]
采用煮沸法回收差异 cDNA 片段，用消毒的手术刀
片切下包含差异条带的聚丙烯酰胺凝胶， 放入 EP
管中 ，加入双蒸水洗胶 2～3 次后 ，加入 30 μl 双蒸
水并将凝胶捣碎，PCR 仪中 98℃孵育 30 min， 离心
收集上清作为再次扩增的模板。第 2 次扩增条件与
第 1 次相同。
1.2.4 差异片段的纯化克隆 、测序及同源性分析
用 DNA 快速回收/纯化试剂盒对第 2 次扩增产
物纯化，纯化后用 pMD19-T Vector 按试剂盒说明进
行连接反应。 取 2 μl 连接产物加入到 200 μl DH5α
感受态细胞中，42℃ 1.5 min 热激转化，用 200 μl 复
苏菌液涂布于含 Amp、X-gal 和 IPTG 的 LB 平板
上，37℃过夜培养。挑出白斑，进行摇菌，测序后，测
序结果与 GenBank 数据库比对。
1.2.5 差异片段 Reverse Northern Blot 验证 用地
高辛杂交检测试剂盒 I （深圳依诺金生物科技有限
公司），标记小梅山猪下丘脑总 RNA 的反转录产物
（即第 1 条链 cDNA）作为探针，进行 Reverse North-
ern Blot，进一步验证获得的差异表达基因 cDNA 的
特异性。 具体过程为回收的差异条带用 6×SSC 溶
液稀释至 50 μg/μl，取 1 μl 分别点尼龙膜上，用 6×
SSC 溶液作为阴性对照 ，探针煮沸 10 min，立即冰
浴 10 min；取 5 ml Hyb 高效杂交液，加入变性的探
针（1~3 μl /膜，5~2 μg/μl Hyb）杂交过夜；取出膜 ，
放入装有 20 ml 的 2×SSC、0.1% SDS 溶液平皿中 ，
洗涤数次后转入预热的 0.1×SSC、0.1 %SDS 溶液中
洗涤数次；再将膜转入 20 ml 洗涤液洗涤数次。
1.2.6 不同发育时期猪下丘脑差异表达基因表达
量分析 用上述所得 cDNA 为模板，根据差异片段
设计引物，以 β-actin 为内参 ，用半定量 RT-PCR 方
法，确定最佳循环数与最佳退火温度，检测不同发
育时期差异片段表达量的变化情况。 用 1%琼脂糖
检测 PCR 产物， 并用 BandScan 软件分析条带光密
度比值，确定在不同发育阶段差异片段的相对表达
量。
2 结果
2.1 总 RNA 的提取
总 RNA 在 1％琼脂糖凝胶上电泳的结果见图
1。 从图 1 可以看出，总 RNA 28S、18S 和 5S 3 条带
清晰可见 ， 表明所提取的总 RNA 完整性良好 ，且
OD260nm/OD280nm 值在 1.8～2.0 之间 ， 符合 DDRT-PCR
对模板的要求。
2.2 不同发育时期猪下丘脑的 DDRT-PCR 差异
显示及 Reverse Northern Blot 验证
不同发育时期猪下丘脑的 DDRT-PCR 部分引
物组合差异显示结果见图 2，所用引物组合为 MD01×
SJ07：5′-ACAATTCGAGTCATCGAC-3′， 差异条带命
名为 CQ01。
Reverse Northern Blot 斑点杂交结果见图 3。 经
Reverse Northern 杂交验证， 杂交斑点颜色很深，鉴
定条带 CQ01 的 cDNA 片段为阳性， 剔除其假阳性
可能。
2.3 差异片段的序列分析
差异片段 CQ01 长度为 221 bp， 碱基序列见图
4。 将该序列与 GenBank 上的序列进行比对（图 5），
发现从第 18~209 个碱基与猪 VEGFA 基因的一部
分片段有 96%的同源性。
图 1 总 RNA 琼脂糖电泳结果
M.Marker;MS70.小梅山猪初情期 （70 日龄 ）DDRT-PCK 结果 ；
MSOO.小梅山猪出生时 （0 日龄）DDRT-PCK 结果
图 2 锚定引物 MD01 与随机引物 SJ07 差异显示结果
潘孝青等：猪下丘脑发育差异表达基因的分离、克隆与表达 79
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2009年第 3期
2.4 差异条带的表达分析
根据差异片段 CQ01 序列设计引物（5＇- GCGG-
AGGCTGCTGCAACGACG-3＇，5＇- TCCTACAGCACAA-
CAAATGTGA-3＇），以 β-actin （5＇-AGAAGGTCGGGA-
GGAAGG-3＇，5＇-CAAGGCCAACCGTGAGAAGATGA-
CT-3＇ 为内参，用半定量 RT-PCR 检测条带 CQ01 在
不同发育时期猪下丘脑表达量的变化。光密度值相
对结果表明，差异条带在小梅山猪出生时呈弱相表
达， 光密度值为 0.428， 在初情期时相对表达量较
高，光密度值为 0.843。
3 讨论
mRNA 差异显示技术是在转录水平上研究基
因表达差异的有效方法，周彦等 [8]选择不同发育阶
段（13，33 周）的人胎脑组织，应用 mRNA 差异显示
技术获得差异表达的 EST 序列，设计引物筛选点阵
排列的人胎脑 cDNA 文库 ， 得到一个新的全长
cDNA 克隆， 并将其命名为人的类硫氧化还原蛋白
基因 （hTRXL）；Pan 等 [9]以人胎脑为素材分离并鉴
定了一系列脑发育过程中差异表达的 ESTs， 为建
立人脑发育的 cDNA 文库奠定基础 。 本研究利用
mRNA 差异显示技术，首次在猪下丘脑内分离并克
隆出与猪 VEGFA 基因高度同源（96%）的 cDNA 片
段，为下一步构建小梅山猪下丘脑 cDNA 文库提供
素材， 并可能为从分子水平阐明猪下丘脑发育、分
化及某些生理功能奠定基础。
本试验所研究的差异片段与猪 VEGFA 基因的
部分片段有 96%的同源性 ， 推测该片段可能是
VEGFA 基因的一部分。VEGFA 是一种促血管生成、
增加血管通透性的重要血管生成调节因子 ，Yoko-
yama 与 Suhardja[10，11]指出，VEGFA 可改变内皮细胞
表达方式， 促进纤维蛋白酶和间质胶原酶的表达，
能直接诱导新生血管的生长。本研究半定量结果显
示，小梅山猪出生至初情期下丘脑发育阶段 ，该差
异片段的相对表达量有所增强，说明下丘脑在出生
至性成熟发育过程中，这一因子参与其中，并起着
管道迅速发育的导向作用。
参考文献
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A,B.初情期 （70 日龄 ）差异条带 CQ01cDNA 阳性杂交结果 ；C，
D. 出生时 （0 日龄） 的 CQ01 cDNA 的弱阳性杂交结果 ；E，F.
6XSSC 溶液阳性对照杂交结果
图 3 Reverse Northern Blot 杂交鉴定结果
ACAATTCGAGTCATCGACCCGATGAGATCGAGTACATGCTCAAGCCGTCCTG
TGTGCCCCTGATGCGGTGCGGAGGCTGCTGCAACGACGAAGGTCTGAAGTGT
GTGCCCACTGAGGAGTTCAACATCGCCATTCAGATTATGCGGATCAAACCAC
ACCAAGGCCAGCACATAGTAGAGATGAGCTTCCTACAGCACAACAAATGTG
AA TAAAAAAAAAAAGCCCTA
图 4 差异条带的碱基序列
图 5 BLAST 比对结果

图 6 RT-PCK 半定量结果
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